VIRAL PLAQUE ASSAY

Materiais:

30ml de cultura exponencial de células SF9 a 5×105 células/ml

6-pernas (2 cada)

1-garrafa 4% Agarose Gel

1-garrafa SF-900 (1.3X) meio

1 garrafa esterilizada

0,5ml de sobrenadante do baculovírus

100ml SFM

1. Em condições subestéreis, distribuir 2 ml de suspensão celular por poço.

2. Deixar as células assentarem no fundo da placa e incubar, cobertas, em RT durante 1h.

3. Colocar o frasco de gel de agarose no banho-maria a 70oC. Colocar a garrafa vazia e o SF-900 (1.3X) no banho a 40oC.

4. Após 1h de incubação das placas em RT, observar as monocamadas sob o invertedmicroscópio para confirmar a fixação das células e 50% de confluência.

5. Produzir uma diluição em série de oito logs do sobrenadante viral colhido, diluindo sequencialmente 0,5 ml da diluição anterior em 4,5 ml de meio SFM em 12-mldisposiveis. Você deve concluir com 8 tubos contendo cada um de uma diluição de 10-1 a 10-8 do estoque original do vírus.

7. Sequencialmente remova o sobrenadante de cada poço, descarte, e imediatamente substitua com 1ml da respectiva diluição do vírus para cada poço duplicado. Incubar durante 1h emRT.

8. Mover as garrafas de banho-maria para a campânula esterilizada quando a agarose tiver líquido (20 a 30 min). Distribuir rapidamente 30 ml do meio SF-900 (1,3X) e 10 ml do agarosegel a 4% para a garrafa vazia e misturar suavemente. Devolva o frasco de banho-maria a 40oC até à utilização.

9. Após esta segunda incubação de 1h, devolver o frasco de agarose diluída e as placas de 6 poços à campânula.

10.Sequencialmente (de alta a baixa diluição) remover o vírus dos poços e substituir por 2ml da agarose diluída. Trabalhar rapidamente para evitar a dessecação da monocamada. Uma pipeta Pasteur ligada a uma bomba de vácuo remove facilmente os vestígios de inóculo.

11.Deixar endurecer durante 10 a 20 minutos antes de se mover.

12.Incubar a 27oC numa incubadora humidificada durante 4 a 10 dias.

13.O recombinantvirus produz placas leitosas/ cinzentas de ligeiro contraste visível sem coloração ou outros métodos de detecção.

14.Monitorizar as placas diariamente até que o número de placas contadas não mude durante dois dias consecutivos.

15.Todeterminar o título do inóculo utilizado, um intervalo óptimo para contar é de 3 a 20 placas por poço de uma placa de 6 poços. O título (pfu/ml) pode ser calculado através da seguinte fórmula:

16. Sobreposição de agarose com corante Vermelho Natural:

Preparar 0,5% de agarosesolução em SFM

Adicionar solução Natural Red à concentração final de 50mg/ml (diluir 3,33mg/ml de caldo 1:66.6).

Overlay 1ml da solução corante para cada poço (numa placa de 6 poços).