Ubiquitin-proteasomvägen: Komplexiteten och de otaliga funktionerna hos proteiner som dör

Vår uppfattning om intracellulär proteinnedbrytning har förändrats dramatiskt under det senaste decenniet. Från att tidigare ha varit en asätande, oreglerad och ospecifik ”slutpunktsprocess” har det blivit tydligt att proteolys av cellulära proteiner är en mycket komplex, tidsmässigt kontrollerad och hårt reglerad process som spelar viktiga roller i en rad olika grundläggande vägar under cellens liv och död. Två stora proteolytiska kaskader har beskrivits. Caspaserna är inblandade i programmerad celldöd (apoptos), medan nedbrytningen av de flesta kortlivade reglerande cellproteiner förmedlas av ubiquitin-proteasomvägen. Bland dessa finns reglerare av cellcykel och celldelning såsom mitotiska och G1-cykliner och cyklinberoende kinashämmare, tillväxtregulatorer såsom c-Fos och c-Jun, tumörundertryckare såsom p53, ytreceptorer såsom tillväxthormonreceptorn och jonkanaler, t.ex. cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR). Systemet är också involverat i selektiv proteolys av onormala/muterade proteiner och i bearbetningen av MHC-klass I-restriktiva antigener (major histocompatibility complex (MHC)). Upptäckten att systemet är involverat i nedbrytningen av c-myc och i den proteolytiska aktiveringen av NF-κB i två steg, till exempel, signalerade att den ubiquitinmedierade nedbrytningen ”kom in” på området för transkriptionsreglering. Via nedbrytning av kortlivade och viktiga reglerande proteiner tycks systemet spela viktiga roller i en rad olika grundläggande cellulära processer. Bland dessa finns reglering av cellcykel och celldelning, inblandning i den cellulära responsen på stress och extracellulära modulatorer, morfogenes av neuronala nätverk, modulering av receptorer på cellytan, jonkanaler och sekretoriska vägar, DNA-reparation, organellernas biogenes samt reglering av immun- och inflammatoriska reaktioner. Nya bevis tyder på att systemet också är involverat i apoptos. Med ett så brett spektrum av substrat och processer är det inte förvånande att avvikelser i processen nyligen har involverats i patogenesen för flera sjukdomar, både ärftliga och förvärvade. Bland dessa finns muskeldegeneration som följer på denervering eller långvarig immobilisering, vissa former av Alzheimers sjukdom, manlig sterilitet och Angelmans syndrom (för nyligen gjorda genomgångar av ubiquitinsystemet, se ref. 1-4).

Degradation av ett protein via ubiquitinvägen sker i två diskreta och på varandra följande steg: (i) kovalent bindning av flera ubiquitinmolekyler till proteinsubstratet och (ii) nedbrytning av det målinriktade proteinet av 26S-proteasomkomplexet med frisättning av fritt och återanvändbart ubiquitin. För att säkerställa ett effektivt och specifikt avlägsnande av ett visst protein vid en viss tidpunkt måste både ubiquitinkonjugering och nedbrytning av de märkta substraten regleras noggrant. I en studie som publiceras i detta nummer av Proceedings (5) rapporterar Zhang och medarbetare om identifieringen av en aktiveringsregion i α-underenheten av proteasomaktivatorn PA28 (REG). För att införliva detta fynd i ett lämpligt biokemiskt och fysiologiskt sammanhang ska vi kortfattat gå igenom vår nuvarande förståelse av den ubiquitinproteolytiska vägen. Systemet (avbildat i figur 1) består av flera komponenter som verkar i samverkan. En av dessa, ubiquitin, ett evolutionärt bevarat protein med 76 rester, aktiveras i sin C-terminala Gly till en högenergisk tiolesterintermediat, en reaktion som katalyseras av det ubiquitinaktiverande enzymet E1. Efter aktiveringen överför ett av flera E2-enzymer (ubiquitinbärarproteiner eller ubiquitinkonjugerande enzymer, UBC) det aktiverade ubiquitinpartiet från E1 till en medlem av ubiquitinproteinligasfamiljen, E3, till vilken substratproteinet är specifikt bundet. E3 katalyserar det sista steget i konjugeringsprocessen, kovalent bindning av ubiquitin till substratet. Den första ubiquitindelen överförs till ɛ-NH2-gruppen i en Lysrest i proteinsubstratet för att skapa en isopeptidbindning. I på varandra följande reaktioner syntetiseras en polyubiquitinkedja genom processiv överföring av ytterligare aktiverade enheter till Lys48 i den tidigare konjugerade ubiquitinmolekylen. Kedjan fungerar troligen som en igenkänningsmarkör för proteasomen (se nedan). Ubiquitin K48R eller metylerat ubiquitin (där alla fria aminogrupper har modifierats kemiskt) kan inte generera polyubiquitinkedjor och fungerar som kedjeavslutare. Följaktligen hämmar de proteolysen när de överuttrycks i celler eller förs in i cellfria system. Bindningen av substratet till E3 är specifik och innebär att E3 spelar en viktig roll vid igenkänning och urval av proteiner för konjugering och efterföljande nedbrytning. Systemets struktur verkar vara hierarkisk: en enda E1 verkar utföra den aktivering av ubiquitin som krävs för alla modifieringar. Flera viktiga arter av E2-enzymer karakteriserades i däggdjursceller. Det verkar som om varje E2 kan agera tillsammans med ett eller flera E3-enzymer. Även om endast ett relativt fåtal E3-enzymer hittills har beskrivits verkar det som om ubiquitinligaserna tillhör en stor, fortfarande växande familj av enzymer. När det gäller ligasernas igenkänningssätt är det, med undantag för ett fåtal fall, osannolikt att varje E3 är inriktad på ett enda substrat. Det är snarare tänkbart att flera olika cellulära proteiner känns igen av ett enda ligas via ett liknande, men uppenbarligen inte identiskt, strukturellt motiv. Ett fåtal proteiner kan kännas igen via sin fria och ”destabiliserande” N-terminala rest (”N-end rule”; ref. 6). Den stora majoriteten av cellulära proteiner är dock acetylerade vid sina N-ändar eller har ”stabiliserande” aminoändar och är målinriktade genom olika signaler. Vissa känns igen via primära sekvenser som ligger nedströms från den N-terminala resterna. Andra är målinriktade via sekundära, posttranslationella modifieringar, t.ex. fosforylering, eller efter förening med andra proteiner, t.ex. onkoproteiner eller molekylära chaperoner.

Efter konjugering bryts adduktens proteingrupp ner av proteasomkomplexet, och fritt och återanvändbart ubiquitin frigörs (för nyare översikter om proteasomer, se ref. 7-10). Även om det för närvarande råder konsensus om att 26S-proteasomen fungerar som den huvudsakliga proteolytiska armen i ubiquitinsystemet, kan enzymets substratspektrum vara bredare och även omfatta icke-ubiquitinylerade proteiner. Ett välstuderat fall är ornitindekarboxylas (ODC). ODC bryts ned efter en icke-kovalent förening med ett antienzym som kan fungera i igenkänningsprocessen som en substratspecifik ubiquitinliknande chaperon. Andra substrat, främst proteiner från endoplasmatiska retikulum (ER), kan också brytas ned av proteasomen utan föregående ubiquitinylering, även om detta inte har fastställts med säkerhet. Dessa kan till exempel omfatta felveckade MHC-molekyler med tunga kedjor (HCs), däggdjurens 3-hydroxy-3-metylglutaryl CoA (HMG-R) och Z-varianten av α-1-antitrypsin (α1-ATZ) (granskad i ref. 11). Dessutom står det nu klart att inte alla ubiquitinylerade proteiner är målinriktade för nedbrytning av proteasomen. Detta gäller främst för mogna membranproteiner på cellytan, t.ex. tillväxthormonreceptorn. För dessa proteiner sker ubiquitinmodifieringen efter ligandbindning och är nödvändig för deras endocytos och inriktning på lysosomen (se ref. 12). Nedbrytning av membranförankrade proteiner genom ubiquitinsystemet ger upphov till viktiga, men ännu olösta, mekanistiska problem som främst är relaterade till frågan om hur två topologiskt skilda händelser, t.ex. felveckning i ER och nedbrytning i cytosolen, eller ligandbindning i den extracellulära domänen och ubiquitinylering på en cytosolisk svans av en receptor, kommer samman. För membranproteiner på cellytan är ett uppenbart problem den roll som ubiquitinmodifieringen spelar: krävs den för endocytos av det märkta proteinet eller, i ett senare skede, för att det skall kunna riktas specifikt mot lysosomen och tas upp av lysosomen. När det gäller ER-proteiner som bryts ned av cytosolproteasomen är viktiga frågor de mekanismer som ligger till grund för att dessa proteiner återfinns genom membranet tillbaka till cytosolen. Transmembrandomänen för membranförankrade proteiner är hydrofobisk och dess avlägsnande från membranet inbegriper troligen en specialiserad, energiberoende, kanalbaserad transport. För lumenala ER-proteiner är frågan centrerad kring hur de transporteras tillbaka till cytosolen.

Renoverade bevis tyder på att principen om ubiquitinmodifiering inte är begränsad till att rikta proteiner för nedbrytning. Det verkar som om ubiquitin ingår i en större familj, och flera ubiquitinliknande proteiner har också beskrivits. Ett intressant fall gäller inriktning på komplexa strukturer. Man fann att lokaliseringen av RanGAP1, ett Ran GTPas-aktiverande protein, till kärnporrkomplexproteinet RanBP2 är beroende av en enda och stabil kovalent modifiering av ett 11,5 kDa, 101-residus ubiquitinliknande protein, SUMO-1, som är ett 11,5 kDa, 101-residus ubiquitinliknande protein (13). Aktiveringsreaktionen liknar den för ubiquitin och involverar E1 och en specifik E2, UBC9. Posttranslationell kovalent modifiering genom ubiquitin och ubiquitinliknande molekyler tjänar således ett brett spektrum av funktioner. Den är involverad i inriktning av proteiner för nedbrytning av proteasomen och lysosomen, men har också icke proteolytiska funktioner.

Det bäst undersökta proteasomkomplexet som är involverat i nedbrytning av ubiquitinmärkta proteiner är 26S-proteasomkomplexet. Det är en ”dumbshell-formad” symmetrisk struktur som består av en katalytisk kärnenhet, ett tunnformigt 20S-proteasomkomplex, som flankeras på båda sidor av reglerande 19S-proteasomkomplex (19S-20S-19S). Kristallstrukturen av det eukaryotiska (jäst) 20S-proteasomen har lösts upp vid 2,4 Å (14). Studien har bekräftat tidigare förutsägelser om komplexets struktur, men har också avslöjat vissa oväntade egenskaper. Jästkomplexet är arrangerat som en stapel av fyra ringar som var och en innehåller sju olika underenheter, α1-7β1-7β1-7β1-7α1-7. De olika α- och β-underenheterna har molekylära massor i intervallet 25-30 kDa. De aktiva platserna finns i tre β-underenheter, β1, β2 och β5, men inte i α-underenheterna. Topologisk analys av placeringen av de olika subenheterna har visat att för de tre olika proteolytiska aktiviteterna, den trypsinliknande, den chymotrypsinliknande och den postglutamylpeptidylhydrolytiska aktiviteten, genereras de aktiva platserna av intilliggande par av identiska β-subenheter av β-typ som befinner sig i olika β-ringar. Analysen av de aktiva platsresterna avslöjar en ny typ av proteolytisk mekanism. De tre β-underenheterna genomgår autokatalys mellan den sista Gly-restigen i propeptiden och Thr1 i den mogna underenheten som deltar i den autokatalytiska processen och blir en väsentlig del av den katalytiska platsen. Upplösningen av kristallstrukturen möjliggjorde också en bättre förståelse av de olika proteasomhämmarnas verkningssätt. Thr1 i β1, β2 och β5 binder den mindre specifika calpain I-hämmaren Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystin, en mer specifik hämmare, kan bindas kovalent till β5 där den dessutom kan generera en mängd vätebindningar med andra omgivande sidokedjor. Mutationsanalyser har visat att de andra β-underenheterna, särskilt β4 och β7 som ligger intill β5 och β1, påverkar aktiviteten hos dessa underenheter. β6 och β7 genereras också från proproteiner via specifik bearbetning. β3 och β4 bearbetas inte. På grund av deras möjliga roll i upprättandet av intersubenhetskontakter och stabilisering av den komplexa strukturen verkar det som om propeptiderna är väsentliga för biogenesen och stabiliseringen av den proteasomala strukturen, och bearbetningen sker först efter sammansättningen. Kristallstrukturen har också visat att α-kedjorna, även om de är katalytiskt inaktiva, spelar en viktig roll för att stabilisera β-kedjornas tvåringsstruktur. De måste också spela en roll i bindningen av 19S cap-komplexen, men kontaktstrukturerna och bindningsmekanismerna kommer att belysas först när kristallstrukturen av 26S-komplexet kommer att lösas upp. Kristallstrukturen har också avslöjat ett avstånd på 28 Å mellan Thr1-rester av intilliggande aktiva β-underenheter. Detta avstånd bestämmer troligen längden på de peptider som genereras under den proteolytiska processen (≈8-aa-rester) och förklarar proteasomens roll i genereringen av antigena peptider som presenteras på MHC-molekyler av klass I. Förekomsten av mellanprodukter av varierande längd tyder dock på att det finns en andra hydrolytisk plats nedströms Thr1 (se nedan).

Ett viktigt, men ännu olöst, problem gäller inmatningen av proteinsubstrat och utmatningen av proteolytiska produkter från proteasomen. Den arkebakteriella (Thermoplasma acidophilum) proteasomen innehåller två inträdesporer på ≈13 Å vid de två ändarna av cylindern som omges av definierade segment av de sju α-kedjorna. Som en slående och ganska överraskande kontrast finns dessa inträdesportar inte i den eukaryota 20S-proteasomen, och det är inte möjligt att komma in i den katalytiska kammaren mellan β-ringarna från komplexets ändar. De N-terminala domänerna av α1, α2, α3, α6 och α7 sticker ut mot varandra och fyller utrymmet i flera lager av tätt interagerande sidokedjor. Inträde från ändarna kommer därför att vara möjligt först efter en betydande omarrangemang som kan uppstå efter förening med 19S-komplexet. En sådan omorganisering kan också kräva metabolisk energi som kan tillhandahållas av ATPasaktiviteten hos flera av 19S-komplexets underenheter. Jästkomplexet uppvisar några smala sidoöppningar, särskilt vid gränssnittet mellan α- och β-ringarna. Dessa öppningar leder direkt till de aktiva platserna Thr1. De är belagda med polära rester som potentiellt kan omarrangeras för att generera ≈10 Å öppningar genom vilka oveckade och förlängda proteinsubstrat kan tränga in.

Reglering av 20S-proteasomens aktivitet sker på flera nivåer. Efter stimulering av antigenpresenterande celler med interferon γ ersätts tre konstitutiva β-underenheter, 1, 2 och 5, med nya och distinkta β-underenheter, β1i (LMP2), β2i (MECL1) och β5i (LMP7). De nya subenheterna är relativt sett effektivare när det gäller att generera antigena peptider som känns igen av MHC-klass I-molekylerna och de lämpliga cytotoxiska T-cellerna via T-cellsreceptorerna. En annan typ av reglering innebär komplexbildning med reglerande komplex. 26S-proteasomen bildas efter ATP-beroende förening av 20S-komplexet med två 19S-komplex. 19S-komplexen består av minst 18 olika proteiner med en molekylmassa på 25-110 kDa. Detta komplex fungerar som ingångsport till den katalytiska kärnan och tillhandahåller de olika regleringsfunktioner som är nödvändiga för att säkerställa selektiv nedbrytning av ubiquitinmärkta substrat. Dessa inkluderar till exempel en bindningsställe för ubiquitinkedjor, ubiquitinåtervinningsaktivitet och flera ATPaser samt förmågan att stimulera de olika peptidasaktiviteterna i 20S-komplexet. Underenheter som utför sådana aktiviteter har faktiskt identifierats. Av särskilt intresse är den ubiquitinkedjebindande underenheten som har beskrivits hos både däggdjur (S5a) och växter (MBP1). Dessa underenheter binder monomerer av ubiquitin, men polyubiquitinkedjor, särskilt de som innehåller mer än fyra enheter, binder med högre affinitet. Nyligen har jästgenen som kodar för den homologa kedjan, Mcb1, klonats. Överraskande nog uppvisar Δmcb1-deletionsmutanter ingen tillväxtdefekt och bryter ner normalt ubiquitinylerade proteiner, med undantag för det linjära fusionsmodellproteinet ubiquitin-Pro-β-Gal. De uppvisar dock en liten känslighet för stress, t.ex. exponering för aminosyraanaloger (15). En möjlig förklaring till dessa oväntade resultat är att ubiquitinylerade proteiner känns igen av ytterligare en, ännu odefinierad, proteasomal underenhet. En sådan kandidat är det deubiquitinylerande enzymet Doa4 som fungerar för att avlägsna ubiquitinmoyheter från proteolytiska substrat. En avlägsen möjlighet är att proteasomen inte känner igen ubiquitinmoyheter, utan i likhet med molekylära chaperoner associerar den sig med dåligt definierade felveckade motiv i proteinsubstratet. Dessa motiv skapas efter ”denaturering” av proteinet genom ubiquitinmärkning. Identifiering av proteasomens specifika igenkänning och den roll som ubiquitin spelar i denna process är avgörande för att förstå proteasets verkningsmekanismer i synnerhet och ubiquitinsystemet i allmänhet. En annan reglerande funktion hos 19S-proteasomen inbegriper redigering av polyubiquitinkedjor. Komplexet innehåller ett 37 kDa isopeptidas som avlägsnar enskilda ubiquitinrester från den distala änden av korta polyubiquitinkedjor (16). Man antar att detta isopeptidas är involverat i redigering och räddning av dåligt ubiquitinylerade eller långsamt nedbrutna proteiner från nedbrytning. Det skiljer sig i detta avseende från Doa4 och ett ATP-beroende isopeptidas som är associerat med proteasomen. De två enzymerna är involverade i återvinning av ubiquitin och upprätthållande av den fria ubiquitinnivån i cellen.

Ett annat komplex som associerar sig med 20S-proteasomen och ökar dramatiskt dess aktivitet är PA28 (REG eller 11S-regulatorn; ref. 17 och 18). Till skillnad från associeringen med 19S är komplexbildningen med PA28 ATP-oberoende. Efter associeringen ökar PA28 Vmax och minskar Km för 20S-komplexet mot en hel rad olika peptider. PA28-20S-PA28-komplexet är dock inaktivt mot intakta nativa eller ubiquitinkonjugerade proteiner. Den rena aktivatorn är ett komplex av två ≈28-kDa-underenheter, PA28α och PA28β, som är ≈50 % identiska. Immunutfällning med underenhetsspecifika antikroppar och kemiska korsbindningsexperiment visade att PA28 är en ringformad hexamer som består av alternerande α- och β-underenheter med en stökiometri på (αβ)3 (19). Intressant nog är dessa underenheter också 30-40 % identiska med ett kärnprotein med hittills okänd funktion, Ki antigenet, som reagerar med serum från patienter med den autoimmuna sjukdomen systemisk lupus erythematosus. Det hexameriska komplexet har en ringformad struktur (fig. 1) och täcker 20S-proteasomkomplexet på antingen en eller båda ändplattorna. Kapstrukturen genomkorsas av en central kanal med en 20 Å-öppning i den yttersta änden och en 30 Å-öppning vid proteasombindningsytan (20, 21). Öppningarna och kanalen fungerar troligen som en del av translokaliseringsmekanismen för peptidsubstrat på väg till 20S-komplexets katalytiska kammare. PA28α kan generera hexa- eller hepta-homomultimerer som associerar med 20S-komplexet och aktiverar det, dock mindre effektivt än (αβ)3-heteromultimern. Däremot associerar PA28β inte med 20S-komplexet och har ingen stimulerande aktivitet. β-underenheternas roll är troligen att modulera PA28-aktiviteten genom att indirekt påverka α-underenheternas aktivitet eller genom att modifiera PA28-partikelns affinitet till 20S-proteasomen.

PA28α innehåller i sin centrala del en unik sekvens, KEKE-motivet som är en hydrofil domän som består av omväxlande positivt laddade Lysrester och negativt laddade Glurester. Det postulerades att detta motiv, som inte finns i PA28β, främjar proteinproteininteraktion mellan α-underenheterna i PA28-partikeln och α-underenheterna i 20S-proteasomen (22). Mutationsanalys visade dock att ΔKEKEKE PA28α behåller sin stimulerande aktivitet (23). Bindning till 20S-proteasomen kräver dock en intakt C-terminus av PA28α och kan involvera C2 α-subenheten av 20S-proteasomen (8). Det föreslogs att fosforylering aktiverar den stimulerande aktiviteten hos PA28α, men detta regleringssätt har inte fastställts med säkerhet.

Mutationsanalys av PA28α av Zhang och kollegor (5) avslöjade flera inaktiverande mutationer i en definierad slinga vid molekylens bas. Några av de muterade proteinerna binder tätt till 20S-komplexet, men kan inte aktivera det (5). Bindningen till proteasomen kan således tydligt skiljas från den stimulerande aktiviteten hos PA28. Intressant nog finns det en stor lucka i fördelningen av de inaktiverande mutationerna som spänner över aminosyraresterna 51-122. Denna mutationsfria zon representerar en region som är unik för varje underenhet i PA28-komplexet. Den är förmodligen inte involverad i PA28:s interaktion med 20S-komplexet eller i stimuleringen av dess proteolytiska aktivitet. Snarare kan den spela en roll i partikelns funktion i den intakta cellen, t.ex. i dess intracellulära lokalisering eller förening med andra komponenter som bestämmer dess specifika aktivitet och interaktioner.

Ett viktigt problem gäller de fysiologiska rollerna för PA28. Båda underenheterna induceras markant av interferon γ, vilket tyder på en roll för partikeln i proteasomens antigenbearbetningsfunktion. Övexpression av PA28α i en musfibroblastlinje som uttrycker cytomegalovirus pp89-proteinet resulterar i en markant ökning av igenkänning av pp89-specifika cytotoxiska T-celler. På samma sätt förstärktes också presentationen av ett nukleoprotein från influensa (24). Studier i ett cellfritt system visade att PA28-20S-PA28-komplexet med hjälp av en samordnad dubbelklyvningsmekanism effektivt kan trimma stora peptider (som har flankerande sekvenser på både N- och C-terminalerna) till de exakta antigena epitoper som erkänns av MHC-komplexet och den lämpliga cytotoxiska T-cellen (25). Det verkar alltså som om PA28 spelar en viktig roll i bearbetningen av antigener för presentation på MHC-molekyler av klass I. Eftersom PA28-20S-PA28-proteasomen inte kan smälta intakta nativa eller ubiquitinylerade proteiner måste den agera nedströms till 19S-20S-19S-proteasomen som bryter ned ubiquitinmärkta proteiner eller stora peptider. Det är också möjligt, även om det inte har påvisats, att det finns en enda asymmetrisk 19S-20S-PA28-proteasom som kan utföra denna proteolytiska process i två steg, initial proteolys till stora peptider och slutlig trimning. De symmetriska eller förmodade asymmetriska PA28-innehållande proteasomerna kan också vara inblandade i den terminala nedbrytningen av peptider till fria aminosyror, en aktivitet som inte kan katalyseras av 19S-20S-19S-proteasomen (fig. 1). Således verkar det som om uppklarandet av PA28-komplexets cellulära roller måste vänta på ytterligare experiment.