Ribosomteknik avslöjar betydelsen av 5S rRNA-autonomi för ribosomuppbyggnad

Plasmidkonstruktion

Alla plasmider konstruerades genom Gibson assembly50, med plasmidbakgrunder som framställdes genom invers PCR eller restriktionsnukleasavdödning och insatserna som genererades genom PCR eller syntetiserades kemiskt av Integrated DNA Technologies. De rRNA-kodande plasmiderna elektroporterades inledningsvis i E. coli POP2136-celler (genotyperna för alla stammar som användes i den här studien anges i kompletterande tabell 1) och transformanterna återfanns på LB-plattor kompletterade med lämpliga antibiotika. Plattorna inkuberades vid 30 °C för att förhindra att de rRNA-gener som styrs av lambda-PL-promotorn31 uttrycks. Alla andra plasmider transformerades och förökades i E. coli JM109-stammen och odlades vid 37 °C i LB-medium som vid behov kompletterades med 100 μg/ml ampicillin (Amp), 50 μg/ml kanamycin (Kan) eller 50 μg/ml spectinomycin (Spc).

Konstruktion av ptRNA100-plasmid

Plasmidens ryggrad, inklusive replikationsursprunget pA15 och Spc-resistensgenen, amplifierades genom PCR från ptRNA67-plasmid51 med hjälp av primerna NA1 och NA2 (alla primers finns förtecknade i den kompletterande tabellen 4). TRNA-genklustret (som kodar för tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp och tRNAAsp), under kontroll av Ptac-promotorn och T1-terminatorn, syntetiserades som en gBlock (Integrated DNA Technology). Plasmiden pTRNA100 skapades genom Gibson-montering. Plasmidens struktur verifierades genom restriktionsdigest och närvaron av det plasmidburna tRNA-klustret bekräftades genom PCR-amplifiering med hjälp av primrarna NA3 och NA4 och genom sekvensering.

Konstruktion av plasmiderna pDH42, pDH39 och pCH84

Konstruktionerna som bär på hybrid 23S-cp5S rRNA-genen genererades med utgångspunkt från plasmid pAM55229, som bär på E. coli rrnB rRNA-operon. 5S rRNA-genen raderades genom invers PCR med hjälp av primrarna NA17 och NA18, som innehåller Xho1-restriktionsplatsen, digestion av PCR-produkten med Xho1 och DNA-ligering. Ery-resistensmutationen A2058G infördes sedan i 23S rRNA-genen genom platsstyrd mutagenes med hjälp av QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) med primer NA7. Den resulterande plasmiden, pAM552Δ5S, användes för att introducera cp5S rRNA-generna med linkers på tre olika platser i 23S rRNA-genen.

Förberedelse av cp5S rDNA-sekvensen för integration i 23S rDNA utfördes i en enda PCR-reaktion där primerparen NA8/NA9 (för DH39- och DH42-konstruktioner) eller NA26 och NA27 (för CH84-konstruktionen) (100 nM vardera) som innehöll cp5S rDNA-insatsen, kombinerades med primerpar (250 nM vardera) som introducerade slumpmässiga sekvenslänkare, med en storlek från 0 till 3 nt, vid de ”vänstra” och ”högra” 23S-cp5S-kopplingarna enligt följande: NA10-NA13 och NA14-NA17 för DH39, NA18-NA21 och NA22-NA25 för DH42, NA28-NA31 och NA32-NA35 för CH84.

För att generera plasmidbiblioteken DH39, DH42 och CH84 öppnades pAM552Δ5S-plasmiden med hjälp av invers PCR genom att använda primerparen NA36/NA37, NA38/NA39 respektive NA40/NA41. cp5S rDNA-insatserna infördes i de resulterande PCR-amplifierade plasmidryggarna genom Gibson-monteringsreaktioner. Reaktionsprodukterna transformerades till E. coli POP2136-celler genom elektroporation och transformanterna återfanns på LB/Amp-agarplattor som odlades vid 30 °C (förhållanden som förhindrar att det plasmidburna rRNA uttrycks). Varje bibliotek hade minst tre gånger fler kloner än den uppskattade teoretiska mångfalden på 7225 varianter. Kolonier tvättades bort från LB-plattorna, plasmidbibliotek extraherades och lagrades.

Ersättning av ptRNA67 med ptRNA100

Den E. coli SQ171-stammen som saknar kromosomala rRNA-alleler och som bär pCSacB-plasmidet som källa för rRNA-gener och ptRNA67-plasmidet som källa för de kromosomala tRNA-gener som saknas32,52, användes som startvärdstam. För att ersätta ptRNA67-plasmidet med ptRNA100 transformerades SQ171-cellerna först med ptRNA-Amp (tillhandahållet av Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City), som liknar ptRNA67 men ger Amp-resistens och innehåller replikationsursprunget pBR322. Transformanterna torkades sedan bort från ptRNA67-plasmidet genom att passera i LB-medium kompletterat med Amp och Kan i ~100 generationer. Förlusten av ptRNA67-plasmidet verifierades genom att klonerna var känsliga för Spc vid replikaplätering. Den resulterande stammen transformerades sedan med ptRNA100 och utplantades på LB-agar kompletterad med Spc och Kan. Transformanterna passerade i ~100 generationer i LB-medium kompletterat med Spc och Kan. Förlusten av ptRNA-Amp-plasmidet verifierades genom att enskilda kloner var känsliga för Amp, vilket framgick av replikaplätering. Förekomsten av ptRNA100 och avsaknaden av ptRNA67 verifierades dessutom genom PCR och restriktionsdigest av de totala plasmiderna som framställts från den resulterande klonen.

Inaktivering av recA-genen i SQ171/ptRNA100-cellerna

RecA-genen i SQ171/ptRNA100-stammen inaktiverades genom P1-fagtransduktion. Donatorstammen BW25113 recA::cat framställdes först genom det konventionella rekombinationsförfarandet52 med hjälp av kloramfenikol (Chl)-resistanskassett från pKD3-plasmid52. Kassetten amplifierades genom PCR med hjälp av primrarna NA42 och NA43. PCR-fragmentet transformerades till BW25113-stammen som bär på den röda rekombinasuttryckande plasmiden pDK46. Efter verifiering av kat-kassettens integrering och efter att pKD46 har torkats bort användes BW25113 recA::cat-cellerna som donatorer för fagtransduktionen. Transduktionen av P1-fager utfördes enligt standardprotokollet53 förutom att återhämtningsinkubationen förlängdes från 1 till 3 timmar innan transduktanterna pläterades på LB/agar-plattor kompletterade med Kan, Spc och 15 μg/ml Chl. För excision av kat-kassetten transformerades den resulterande stammen med plasmidet pZFLP-TetR som kodar för flippasenzymet och transformanterna utplantades på LB/agar-platta kompletterad med Kan, Spc och 2,5 μg/ml tetracyklin (Tet). Elimineringen av cat-genen bekräftades genom PCR och genom klonernas Chl-känslighet. Därefter torkades pZFLP-TetR-plasmidet bort genom att cellerna passagerades i ~100 generationer i LB-medium kompletterat med Kan, Spc, och de resulterande klonerna testades med avseende på känslighet för Tet. Den resulterande stammen fick namnet SQA18 (kompletterande tabell 1).

Introduktion av 23S-cp5S-biblioteken i SQA18-celler

Plasmidbiblioteken som extraherats från POP2136-celler transformerades till SQA18-celler genom elektroporation. Efter 2 timmars återhämtning vid 37 °C utplacerades transformanterna på LB/Amp-agarplattor som sedan inkuberades över natten vid 37 °C. Kolonier tvättades bort från agarplattorna och 0,01 A600 (~106 celler) placerades i en volym på 2 ml LB-medium kompletterat med 150 μg/mL Ery och 0,25 % sackaros. Efter tillväxt i 16 timmar plattades cellerna ut på agarplattor som innehöll Amp, 1 mg/ml Ery och 5 % sackaros. Plattorna inkuberades i 48 timmar vid 37 °C. Livskraftiga kolonier uppstod med DH42- och CH84-biblioteken, men inte med DH39-biblioteket. Flera av de kolonier som framträdde på plattorna testades genom koloni-PCR för närvaro av 23S-cp5S rDNA med hjälp av primerparen NA44/NA45 för DH42-konstruktionen och primerna NA46/NA47 för CH84-konstruktionen. Frånvaro av wt 5S rRNA-genen verifierades genom koloni-PCR med hjälp av primerna NA48 och NA49.

Selektion av de föredragna 23S-cp5S rRNA-länkarna

Det totala DH42-plasmidbiblioteket som isolerats från POP2136-cellerna transformerades till SQA18-celler och utplantades på LB/Amp-plattor enligt beskrivningen ovan. Kolonierna (~50 000) sköljdes av plattan och total plasmid extraherades från ~109 celler och användes som ett förvalsbibliotek.

Omkring 109 celler utsattes sedan för plasmidutbytesförfarandet. Specifikt placerades de i en volym på 20 ml LB-medium kompletterat med 150 μg/mL Ery och 0,25 % sackaros. Efter 4 timmars tillväxt pläterades cellerna ut på agarplattor som innehöll Amp, 1 mg/ml Ery och 5 % sackaros. Plattorna inkuberades i 48 timmar vid 37 °C. Kolonier (~50 000) sköljdes bort från plattan. Den extraherade totala plasmiden från dessa celler utgjorde biblioteket efter urvalet.

Cp5S rDNA flankerat av 23S rDNA-sekvenser och linkers amplifierades genom PCR från plasmidpreparaten från biblioteket före och efter urvalet med hjälp av primrarna NA50 och NA51. PCR-biblioteken utsattes för nästa generations sekvensering.

Foldberäkningsfaktorn för varje kombination av länkare beräknades med hjälp av följande förfarande. Efter trimning av adaptern eliminerades hela sekvensen av cp5S rRNA, utom de avslutande 4 nukleotiderna i varje ände, för att minska antalet falska sekvensvarianter som uppstod på grund av sekvenseringsfel inom den 5S-kodande sekvensen. De resulterande sekvensmotiven räknades i biblioteken före och efter urvalet och frekvensen av fraktionen av varje länkvariant beräknades.

Förberedelse av totalt cellulärt RNA

Övernattningsodlingar av E. coli-stammarna POP2136 eller SQA18 odlades vid 30 °C respektive 37 °C i LB/Amp-medium. Kulturerna späddes 1:100 i 2 ml färskt medium och odlades vid 37 °C till A600 ~ 0,5. Cellerna skördades genom centrifugering (5000 × g, 1 minut) och återuppsattes i 100 μl lysisbuffert . Efter att 400 μl extraktionsbuffert (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) tillsatts och inkuberats i 5 minuter i rumstemperatur extraherades totalt RNA genom fenol/kloroformextraktion. RNA utfälldes med etanol, RNA-pelleten tvättades med 1 ml 70 % etanol, löstes i RNase-fritt vatten, snabbfrystes och förvarades vid -80 °C.

Sucrosegradientanalys av ribosomer och polysomer

E.coli-kulturer som odlats under natten späddes ut i 50 ml LB/Amp-medium och odlades till A600 ~ 0,5. Chl tillsattes till en slutkoncentration på 125 μg/ml och efter 5 min inkubation skördades cellerna genom centrifugering (5000 × g, 10 min, 4 °C). Cellpellets resuspenderades i iskall lysisbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lysozym, 0,25 % natriumdeoxycholat och 2U RQ1 RNasfritt DNas I). Cellerna lyserades genom tre cykler av frysning och upptining. Lysaten klargjordes genom centrifugering (20 000 × g, 15 min, 4 °C) och 20 A260-enheter lysat laddades på 12 mL av 10-40 % linjär sackarosgradient i buffert 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoetanol. Gradienterna centrifugerades (3 timmar, 4 °C) vid 39 000 rpm i en SW41-rotor (Beckman). Gradienterna fraktionerades med hjälp av en fraktioneringsapparat (BioComp) och absorbansen registrerades vid 254 nm. Fraktioner som motsvarar 50S-underenheterna, 70S-ribosomerna och polysomerna slogs samman. RNA isolerades genom fenol/kloroformextraktion och etanolfällning.

Isolering av 70S ribosomer och ribosomala underenheter

För isolering av tight-couple ribosomer54 späddes E. coli-kulturer över natten ut i 1 L LB/Amp-medium och odlades till A600 ~ 0,5. Cellerna skördades genom centrifugering (5 000 g, 15 min, 4 °C), resuspenderades i buffert A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-merkaptoetanol, 10 U/ml RQ1 RNasfritt DNas I) och lysterades med fransk press vid 10 000 psi. Lysaten klargjordes genom centrifugering i JA25-50-rotor (Beckman) vid 13 000 rpm i 30 minuter vid 4 °C och supernatanterna lastades på 10 ml 1,1 M sackaroskudde som förberetts i en buffert som innehåller 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 och 6 mM β-merkaptoetetanol, i 35 ml Quick-Seal centrifugeringsrör (Beckman). Ribosomerna pelleterades genom centrifugering i 16 timmar vid 36 000 rpm (4 °C) i en Ti70-rotor (Beckman). Ribosompellet resuspenderades i buffert B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl och 6 mM β-mercaptoetanol) och 100 A260-enheter lastades på 10-40 % sackarosgradient som förberetts i buffert B i rören i en SW27-rotor (Beckman). Gradienterna centrifugerades i 21 timmar vid 20 000 rpm (4 °C) i en SW27-rotor, fraktionerades med hjälp av gradientfraktionatorn (BioComp) och fraktioner som innehöll 70S ribosomer och 50S ribosomala underenheter sammanfördes separat. Materialet koncentrerades med hjälp av 2 ml Vivaspin-koncentratorer (Sartorius) med cellulosetriacetatmembran och återställdes i ribosomförvaringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol). Alikvantiteter av ribosomer och ribosomala underenheter snabbfrystes och förvarades vid -80 °C. Vid behov isolerades rRNA genom fenol/kloroformextraktion och etanolfällning.

För isolering av 50S-underenheterna från 70S-ribosomerna, 130 pmol ribosomer, framställda enligt ovan men koncentrerade genom pelletering och förvarade i ribosomförvaringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol) späddes i buffert D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoetanol) för att nå en slutkoncentration av MgCl2 på 1,5 mM. Ribosomala underenheter separerades genom centrifugering i 10-40 % sackarosgradienter preparerade i buffert D som innehöll 1,5 mM MgCl2. Gradienterna centrifugerades i 16 timmar vid 27 000 rpm (4 °C) i en SW27-rotor (Beckman), fraktionerades, koncentrerades och återställdes i bufferten för lagring av ribosomer enligt beskrivningen ovan. Alikvotarna snabbfrystes och förvarades vid -80 °C.

LC-MS/MS-analys av ribosomala proteiner

Proteinsammansättningen av wt- och muterade tight-couple 70S-ribosomer och 50S-ribosomala subenheter, framställda enligt beskrivningen ovan, bestämdes med kvantitativ masspektrometri55. Ribosomala preparat blandades i ett molärt förhållande 1:1 med SILAC-märkta wt-ribosomer som innehöll massemärkt arginin (Arg6: 6HN4O2) och lysin (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Tyskland). Ribosomala proteiner smältes med trypsin (Sigma) eller Lys-C proteas (Wako, USA). De resulterande peptiderna fraktionerades och analyserades via LC-MS/MS med LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Proteinidentifiering och kvantifieringsanalys utfördes med hjälp av Maxquant v1.5.6.056 och Perseus v1.6.2.357. Maxquant-sökningen gjordes med hjälp av E. coli MG1655 proteinsekvensdatabas från UniProtKB (24.04.2019). Proteinöverflödet normaliserades för stora och små underenhetsproteiner separat genom att förskjuta det genomsnittliga L/M-förhållandet till 1.

Kemisk sondering av rRNA-struktur

rRNA-strukturen sonderades i 70S-ribosomerna som isolerats från wt- eller mutantceller. Ribosomerna (10 pmol) placerades i 50 μl modifieringsbuffert och aktiverades genom inkubation i 5 minuter vid 42 °C. Modifieringsreaktionen startades genom tillsats av 2 μl dimetylsulfat (Sigma) utspätt 1:10 i etanol. Proverna inkuberades i 10 minuter vid 37 °C. Modifieringsreaktionerna stoppades genom tillsats av 50 μl nyberedd stopplösning (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoetanol) och 300 μl etanol. Proverna fälldes, resuspenderades i buffert (300 mM natriumacetat, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5 % SDS) och RNA isolerades genom fenol/kloroformextraktion och etanolfällning. Primerförlängningar utfördes med primerna NA56-NA57.

Analys av mutantens rRNA-innehåll

För att analysera närvaron av det konstruerade 23S-cp5S rRNA isolerades totalt RNA från sackarosgradientfraktionerna enligt beskrivningen ovan. Innehållet av mutant 23S-cp5S rRNA bedömdes genom primerförlängning med antingen NA58 eller NA59 primers. Specifikt annealerades 5′-märkt primer (0,5 pmol) till 1 μg totalt RNA i hybridiseringsbuffert (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) genom inkubation vid 90 °C i 1 minut och sedan nedkylning under 15 minuter till 42 °C, och förlängdes med 2 U AMV omvänt transkriptas (Roche) i 20 minuter vid 42 °C i en slutlig reaktionsvolym på 8 µl. För primern NA58 innehöll reaktionen 0,25 mM ddATP och 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP. För primern NA59 innehöll reaktionen 0,25 mM ddCTP och 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Reaktionerna avslutades genom att tillsätta 120 μl stoppbuffert (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70 % EtOH), kylning vid -80 °C i 15 minuter och pelletering av nukleinsyrorna genom centrifugering vid 15 000 × g i 1 timme vid 4 °C. Supernatanten avlägsnades, pellets torkades och löstes upp i formamid som laddningsfärgämne. cDNA-produkterna löstes upp i en 12 % denaturerande polyakrylamidgel och visualiserades genom fosforimaging.

In vitro-översättning

In vitro-översättningsreaktioner utfördes i det cellfria översättningssystemet Δribosome PURExpress (New England Biolabs). DNA-mallarna som innehåller T7 RNA-polymeras-promotorn, ribosombindningsstället och den proteinkodande sekvensen framställdes genom PCR. ErmBL-mallen framställdes med hjälp av primers NA52-NA55. GFP-mallen framställdes från sf-gfp-genen i plasmid pY71-sfGFP58 med hjälp av primers NA31 och NA32. Dihydrofolatreduktas (DHFR) uttrycktes från plasmidmallen som levererades med PURExpress-kitet.

Translationsreaktionen för uttryck av GFP sammanställdes i en total volym på 10 μl och innehöll 2 μl av PURExpress-kitets lösning A, 1.2 μl faktorblandning, 1 μl aminosyrablandning (3 mM vardera), 1 μl tRNA (20 μg/ml), 16 U RiboLock RNashämmare (ThermoFisher), 10 ng GFP-mall och 12 pmol wt- eller muterade ribosomer. Proverna placerades i brunnarna i en 384-wells vävnadskulturplatta med svart vägg/klar platt botten (BD Biosciences) och täcktes med locket. Reaktionerna inkuberades vid 37 °C i en mikroplattläsare (Tecan) där GFP-fluorescensen registrerades var 10:e minut vid λexc = 488 nm och λem = 520 nm under en period av 4 h.

Expression av DHFR följdes av inkorporering av -L-methionin i proteinet i full storlek. Översättning utfördes i 10 μl reaktioner som monterades enligt beskrivningen ovan men kompletterades med 5 μCi -L-methionin (1175 Ci/mmol), med användning av 50 ng av DNA-mallen och 6 pmol wt- eller muterade ribosomer. Reaktionerna inkuberades vid 37 °C. Var 12:e minut togs 1 μl alikvot ut, blandades med 3 μl SDS-haltigt gelladdningsfärgämne och förvarades på is tills reaktionsförloppet var avslutat. Proteinprodukterna analyserades genom SDS-gelelektrofores i 16,5 % Bis-Tris-geler (Biorad) med hjälp av NuPAGE MES/SDS-körbuffert (Invitrogen). Gelerna färgades, torkades och exponerades för en fosforimager-skärm över natten. Radioaktiva band visualiserades genom fosforimaging.

Cryo-EM-analys av 70S-ribosomer och 50S-underenheter

Cryo-EM-galler framställdes på följande sätt. 400 M koppargaller belagda med spetsigt kol och ett 2 nm tunt skikt av kol (Ted Pella Inc.) glödladdades med 20 mA ström med negativ polaritet i 60S i en PELCO easiGlow glödladdningsenhet. En Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) förbalanserades till 4 °C och 95 % relativ luftfuktighet. En alikvot av tidigare snabbfrysta ribosomer tinades upp och när opalescens noterades rensades lösningen i en mikrocentrifug (10 minuter vid 16 000 × g vid 4 °C). Koncentrationen av den rensade supernatanten härleddes från A260 som mättes med en Nanodrop (ThermoFisher) och ribosomerna späddes till 200 nM i LPP-buffert . Tre µl av 200 nM ribosomlösning applicerades på gallret; efter en 10S fördröjning blottas gallret i 4S och sänks sedan ner i flytande kvävekyld flytande etan.

Data samlades in i ett Talos-elektronmikroskop (ThermoFisher) som arbetar vid 200 KV och är utrustat med en K3-direktelektrondetektor (Gatan Inc.) med inriktning på 0,5-1,8 μm underfokus. Datainsamlingen automatiserades med SerialEM59 genom att använda strålens lutning för att samla in flera filmer (t.ex. en bild i mitten, sex med förskjutning) vid varje position på scenen60. Filmerna med superupplösning hade totalt 19 bilder med 1,5 e-/Å2 per bild för en total dos på 30 e-/Å2 på provet. Totalt samlades 5222 filmer in under 22 timmar. Filmerna anpassades i farten under datainsamlingen med hjälp av IMOD61 för att dekomprimera bilderna, tillämpa förstärkningsreferensen, binära superupplösningsdata till en fysisk pixel på 0,87 Å på provet och korrigera för bildavdrift.

Främsta stegen i genereringen av 3D-bilden från CTF-bestämning, referensfri partikelplockning (489 732 partiklar) och skapandet av staplar utfördes i cisTEM. Partikeljustering och förfining utfördes i Frealign 9.11 och cisTEM62,63. För att påskynda bearbetningen framställdes 2×-, 4×- och 8×-binnade bildstaplar med hjälp av resample.exe, som är en del av FREALIGN-distributionen64. Den ursprungliga modellen för partikeljustering av 70S-kartor var EMD-100365, som minskades för att matcha en 8× binned bildstapel med hjälp av EMAN266. Två omgångar av sökning i läge 3 med en högupplösningsgräns på 30 Å och sedan 20 Å kördes med hjälp av den 8× binned stacken. Därefter kördes 7 omgångar av förädling i läge 1 med den 4×, eventuellt obinnade stapeln, medan upplösningsskal gradvis lades till (gräns på 5 Å) och upplösningen nådde 2,94 Å. Strålförskjutningsförädling användes för att förbättra den totala upplösningen till 2,87 Å.

Tjugo omgångar av 3D maximum-likelihood-klassificering utan maskering och till 14 Å upplösning användes för att snabbt separera 8x binnade partiklar i 12 klasser med olika sammansättningar som avslöjar 50S-underenheter, 70S-ribosomer utan tRNA eller 70S-ribosomer med tRNA och 30S i antingen en roterad eller icke-roterad konformation (kompletterande fig. 3a). 50S-partiklar (133 490), tomma 70S-partiklar (120 428) eller tRNA-bundna 70S-partiklar i icke-roterat tillstånd (55 677) skapades med hjälp av 1x binned stack med hjälp av merge_classes.exe, en del av Frealign-paketet, vilket kräver partikelpoäng på 0 och minst 50 % beläggning. Understammarna var sedan återigen binned till 4x med hjälp av resample.exe för att påskynda ytterligare klassificeringssteg.

Den 50S partikelunderstammen separerades i 6 klasser med en fokusmask med en radie på 55-Å runt 5S rRNA-delen av 23S-cp5S hybrid rRNA. Klasser med svag eller avsaknad av uL16 och/eller bL33 och klasser som skiljer sig åt i 5S rRNA-position separerades. Klasserna rekonstruerades med ursprungliga parametrar för inriktning och strålens lutning vid 1x binning och en av dessa klasser användes för strukturell modellering enligt detaljerna i följande avsnitt.

Den 70S-partiklarna undersöktes också. Den tomma (inget tRNA) 70S-partikelundergruppen separerades i 12 klasser med hjälp av samma 55-Å fokusmask. Klasserna uppvisade skillnader i uL16- och/eller bL33-beläggning och 5S rRNA-position, i likhet med de 50S-klasser som beskrivs ovan. Till skillnad från 50S-partiklarna visade dock 3 av 12 tomma 70S-klasser en normalt veckad PTC.

Klassificering av den klassiska tRNA-bundna 70S-partikelunderklassen i 12 klasser med samma mask avslöjade en nästan stökiometrisk beläggning på 16 uL, och alla partiklar hade en normalt veckad PTC och en stark P-tRNA-täthet. Däremot var tRNA-beläggningen av A-platsen svag i vissa klasser med svagare L33-täthet. Klassificering av 70S-partiklarna med ett roterat 30S och P/E-tRNA i hybridtillstånd i 12 klasser visade också varierande beläggningar av uL16 och bL33, och sju klasser uppvisade avvikande PTC.

Den 3,2-Å cryo-EM-struktur av 70S-ribosomen bunden med A- och P-tRNA67 användes som utgångsmodell för strukturförfiningar. Ribosomens komponenter/domäner anpassades till kartor med hjälp av Chimera68. Här anpassades 50S, L1-stjälken, L11-stjälken, 30S-kroppen och -huvudet samt tRNA:erna oberoende av varandra. Modellering av 5S rRNA och justeringar av PTC och avkodningscentret gjordes med PyMOL69. Strukturmodellerna förfinades med hjälp av real space simulated-annealing refinement med RS Ref 70,71 mot motsvarande kartor. Förädlingsparametrar, t.ex. den relativa viktningen av stereokemiska begränsningar och den experimentella energitermen, optimerades för att producera den optimala stereokemiska strukturen, realrymdskorrelationskoefficienten och R-faktorn, som rapporterar om modellens anpassning till kartan72. Sekundärstrukturbegränsningar, som omfattar vätebindningsbegränsningar för ribosomala proteiner och basparningsbegränsningar för RNA-molekyler, användes enligt beskrivningen73. Strukturerna förfinades därefter med hjälp av phenix.real_space_refine74 följt av en förfiningsrunda i RSRef med harmoniska begränsningar för att bevara proteinets geometri70,71. Phenix användes för att förfina modellernas B-faktorer mot deras respektive kartor utan B-faktorfiltrering74. De resulterande strukturmodellerna har goda stereokemiska parametrar, som kännetecknas av låg avvikelse från ideala bindningslängder och -vinklar och stämmer väl överens med motsvarande kartor, vilket indikeras av höga korrelationskoefficienter och låga R-faktorer i det verkliga rummet (kompletterande tabell 2). Figurerna har framställts i PyMOL69.

Rapporteringssammanfattning

Förlängre information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.