Reglering av kolesterolsyntesen

00:00:08.12Mitt namn är Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03och jag kommer från institutionen för molekylär genetik
00:00:12.01på University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, Texas.
00:00:00:15.17I den här presentationen kommer jag att tala om återkopplingsregleringen av HMG CoA reduktas,
00:00:00:20.27som är det hastighetsbegränsande enzymet i kolesterolsyntesen.
00:00:00:25.06Den här bilden visar kolesterolets struktur
00:00:27.06och några av egenskaperna hos denna viktiga molekyl.
00:00:31.01Kolesterol är en sterol,
00:00:33.10som kännetecknas av denna fyrringstruktur.
00:00:36.00Denna fyrringstruktur ger molekylen styvhet,
00:00:39.02vilket gör den till en idealisk komponent i cellmembran.
00:00:00:43.18Nu, eftersom kolesterol har ett stort antal
00:00:46.07 kol-kol- och kol-väte-bindningar,
00:00:00:49.02 är denna molekyl praktiskt taget olöslig i vatten.
00:00:00:52.07Så, på grund av denna anledning,
00:00:00:54.13 måste cellerna kunna hålla kolesterolet inom ett snävt intervall,
00:00:00:58.03så att tillräckligt med kolesterol produceras för molekylens cellulära behov
00:01:02.13men undviker en giftig överackumulering av kolesterol.
00:01:06.16Överackumulering av kolesterol kan vara giftigt på cellnivå.
00:01:12.11Denna bild visar några av kolesterolets viktiga funktioner.
00:01:15.10Kolesterol är absolut nödvändigt för livet.
00:01:17.26Som jag nämnde tidigare,
00:01:19.27En av de mest välkända rollerna för kolesterol
00:01:22.26är dess roll i cellmembranen,
00:01:25.08 där det upprätthåller optimal membranvätska.
00:01:29.00Kolesterol visar sig vara en viktig prekursor
00:01:32.01för mycket viktiga molekyler som steroidhormoner,
00:01:34.25som hjälper till att skilja mellan flickor och pojkar;
00:01:38.19bålsyror, som hjälper till med matsmältning och näring genom att lösa upp kostfetter och fettlösliga vitaminer;
00:01:47.10och slutligen finns det gott om kolesterol i hjärnan,
00:01:50.18 där det finns i myelinskeden som omger axoner
00:01:53.17och hjälper till med synap… synaptiska överföringar.
00:01:58.18Celler i våra kroppar — däggdjur — däggdjursceller —
00:02:02.01får tag på kolesterol genom två källor.
00:02:04.21En av källorna illustreras på denna bild,
00:02:07.06och det är genom syntesen av kolesterol
00:02:09.19från prekursorn acetyl CoA.
00:02:13.00Omvandlingen av acetyl CoA till kolesterol
00:02:15.21 sker genom verkan av mer än 20 enzymer.
00:02:20.22Som du kan föreställa dig,
00:02:22.21 innebär syntesen av kolesterol att flera mellanprodukter produceras,
00:02:26.16och dessa mellanprodukter kan också omvandlas till mycket viktiga slutprodukter.
00:02:33.11 Till exempel denna förening, farnesylpyrofosfat,
00:02:36.29är en prekursor för en viktig förening som kallas dolichol,
00:02:40.25som är involverad i N-länkad glykosylering.
00:02:43.26Det är också en prekursor för heme och ubiquinoner,
00:02:46.10som är involverade i cellandning;
00:02:49.26vitamin K, som är inblandat i blodkoagulationen;
00:02:53.12och slutligen blir detta farnesylpyrofosfat och geranylgeranylpyrofosfat
00:02:58.06fästa vid många signalproteiner,
00:03:01.16 små GTP-proteiner,
00:03:03.22 och leder dem till membranen,
00:03:06.12och denna modifiering är absolut nödvändig för normal cellfunktion.
00:03:13.04Denna bild visar att syntesen av kolesterol
00:03:16.02 sker i olika vävnader med olika hastighet.
00:03:19.29Levern och binjurarna
00:03:23.14syntetiserar det mesta kolesterolet i våra kroppar.
00:03:25.10Och jag bör påpeka att detta faktiskt gjordes på möss,
00:03:28.06men liknande effekter ses hos människor
00:03:31.07och andra primater.
00:03:33.19Levern… levern syntetiserar stora mängder kolesterol
00:03:36.24för främst produktion av lipoproteiner
00:03:39.14och även för gallsyrasyntesen.
00:03:42.10Binjuren producerar kolesterol
00:03:45.28 främst för syntesen av steroidhormoner,
00:03:48.13 medan tarmen syntetiserar kolesterol för att…
00:03:51.27för celldelning.
00:03:54.12Ett stort antal celler i tarmen slås av varje dag
00:03:57.12och måste ersättas av nya celler,
00:03:59.27vilket kräver en markant mängd kolesterolsyntes.
00:04:03.28Jag bör också påpeka att tarmen också är en källa till produktion av lipoproteiner.
00:04:09.21Den andra källan till kolesterol
00:04:12.12är faktiskt från de lipoproteiner
00:04:15.16som produceras av levern och tarmen.
00:04:18.06Där visas en modell av lipoproteinet med låg densitet.
00:04:23.02Detta är den viktigaste kolesterolbäraren i mänsklig plasma.
00:04:28.02Laboproteinet med låg densitet, eller LDL,
00:04:31.14 består av en kärna som består av fritt kolesterol.
00:04:36.19Det hydrofoba kolesterolet bildar alltså kärnan i LDL-partikeln.
00:04:41.19Detta hydrofoba kolesterol
00:04:44.01omges av ett skal som består av en fosfolipid
00:04:47.02 med olika mängder förestrat kolesterol
00:04:51.13 – detta är kolesterol till vilket en fettsyra har bundits —
00:04:55.14som är inlagd i fosfolipidhöljet.
00:04:59.03Nu är hela denna LDL-partikel
00:05:02.18omgiven av ett protein som kallas apolipoprotein B.
00:05:08.02Så, denna bild visar faktiskt
00:05:10.17 hur cellerna får kolesterol från dessa två källor:
00:05:13.13endogen syntes och från LDL.
00:05:18.19LDL-receptorer
00:05:21.09 – de finns på cellernas yta –
00:05:23.20 binder sig till LDL genom att interagera med denna apolipoprotein B-partikel
00:05:29.12som omger lipoproteinskalet.
00:05:32.25När LDL-partikeln binder sig till LDL-receptorn,
00:05:35.27internaliseras hela komplexet i belagda gropar.
00:05:05:40.06Dessa belagda gropar styrs sedan till lysosomerna,
00:05:05:43.07där LDL-partikeln bryts ner och kolesterolet
00:05:47.15 – det fria kolesterolet –
00:05:49.25 frigörs nu och tillhandahålls till cellen för olika ändamål.
00:05:54.18 Så, återigen, dessa två källor till cellulärt kolesterol
00:05:58.03 – antingen från receptorn… LDL-receptormedierad endocytos av LDL,
00:06:03.07eller genom endogen syntes —
00:06:06.02kan användas omväxlande.
00:06:09.01Så, till exempel, om LDL blir begränsande,
00:06:12.00vänder sig cellen till endogen syntes för sina kolesterolkällor.
00:06:18.02Och om den endogena syntesen blockeras,
00:06:20.05då kan cellerna nu använda exogent LDL
00:06:23.01som kolesterolkälla.
00:06:27.00Så, vi har talat om kolesterolets viktiga funktion.
00:06:30.10Det är viktigt i cellmembranen.
00:06:32.11Det är en viktig föregångare till steroidhormoner
00:06:34.28och gallsyror.
00:06:36.16Hursomhelst finns det en dålig sida av kolesterolet,
00:06:38.13och den illustreras i denna bild.
00:06:41.00Förhöjda nivåer av LDL-kolesterol i blodet
00:06:46.14är sedan ett antal år tillbaka förknippade med en risk för kranskärlssjukdom
00:06:49.19och hjärtinfarkt.
00:06:51.16Så, som visas här kan du se att
00:06:54.27kolesterolnivån i blodet
00:06:57.26 bokstavligen korrelerar med risken för kranskärlssjukdom.
00:07:01.09Och detta beror på att förhöjt kolesterol
00:07:04.21kan faktiskt avsätta sig i de artärer som leder till… till hjärtat.
00:07:08.12Och med tiden leder denna avlagring
00:07:11.15till en sjukdom som kallas ateroskleros,
00:07:13.09där denna avlagring av kolesterol
00:07:15.04kan leda till bildandet av plack
00:07:17.12som i slutändan kan blockera blodflödet till hjärtat,
00:07:19.18och därmed skapa en hjärtattack.
00:07:23.06Nu är ett av de mest förskrivna läkemedlen
00:07:28.16för att sänka LDL-kolesterolet
00:07:31.11en grupp av läkemedel som kallas statiner.
00:07:33.03Här visas den typiska kärnstrukturen hos statiner
00:07:37.26och några av de olika formerna av statiner
00:07:41.29som har använts i kliniken.
00:07:44.22Under årens lopp har statiner
00:07:47.12blivit ett av de mest använda läkemedlen för att minska… den mest sålda medicinen…
00:07:49.10medicin i USA
00:07:51.20på grund av deras förmåga att sänka LDL-kolesterolet i blodet.
00:07:57.19Det som visas i det här experimentet är alltså en sammanfattning av minst fyra studier
00:08:02.23som visar att statiner faktiskt sänker LDL-kolesterolet
00:08:06.06och att denna sänkning leder till en minskad förekomst
00:08:10.04av kranskärlssjukdom.
00:08:12.11Så, som visas här i de slutna cirklarna är kliniska prövningar
00:08:15.11 där patienterna antingen behandlades med en statin, som visas i… som visas i de slutna cirklarna,
00:08:20.22eller placebo.
00:08:22.11Och i var och en av dessa studier ledde statinbehandlingen till
00:08:25.17en sänkning av LDL-kolesterolnivåerna,
00:08:28.11och i alla dessa studier ledde statinbehandlingen till
00:08:25.17en sänkning av LDL-kolesterolnivåerna,
00:08:28.06och denna minskning av LDL-kolesterolnivåerna
00:08:31.19 ledde till en minskning av kranskärlshändelser, dvs. hjärtinfarkter.
00:08:35.13Frågan blir då hur statiner fungerar?
00:08:38.21Och vad gör statiner?
00:08:40.28Så, vi svarade först, vad gör statiner?
00:08:43.16Så, statiner hämmar enzymet HMG CoA reduktas.
00:08:47.05HMG CoA reduktas katalyserar
00:08:50.20det hastighetsbegränsande steget i syntesen av kolesterol.
00:08:53.28Det är faktiskt det fjärde steget i kolesterolsyntesvägen.
00:08:58.06Så statiner hämmar HMG CoA reduktas
00:09:01.20 genom att efterlikna reduktasreaktionens produkt,
00:09:05.13mevalonat.
00:09:07.20Denna kompetitiva hämning av reduktaset
00:09:10.19 ligger till grund för statinernas förmåga att nedreglera
00:09:14.18LDL-kolesterolet i blodet.
00:09:18.07Hur fungerar statiner?
00:09:20.17Och återigen, genom att konkurrerande hämma HMG CoA-reduktaset,
00:09:24.Detta leder till en minskning av mängden mevalonat
00:09:27.09och naturligtvis en minskning av kolesterol.
00:09:30.18Denna kolesterolförlust leder till en ökning
00:09:33.12av transkriptionen av genen
00:09:36.06som kodar för LDL-receptorn.
00:09:37.25Och som ett resultat av detta ökar antalet LDL-receptorer på ytan…
00:09:41.14i synnerhet i levercellerna,
00:09:43.15och denna ökning av LDL-receptorer leder
00:09:48.01till ett ökat eller förbättrat upptag av LDL i blodet.
00:09:52.25Och denna minskning av LDL i blodet
00:09:55.26är ansvarig för minskningen av kranskärlssjukdom
00:09:58.20 hos statinbehandlade patienter.
00:10:02.12Men de kliniska effekterna av statiner
00:10:05.26försvagas faktiskt av
00:10:09.06den kompensatoriska ökningen av HMG CoA reduktas
00:10:11.10som följer med statinbehandling.
00:10:13.19Och det illustreras på denna bild.
00:10:15.13Detta är en immunoblot av HMG CoA reduktas-protein
00:10:19.03i levern hos möss som fått statin,
00:10:22.17eller till och med i odlade celler
00:10:25.00som behandlats med statiner in vitro.
00:10:26.24Och som du kan se,
00:10:28.20statinbehandling orsakar en markant ackumulering
00:10:31.09av HMG CoA reduktas.
00:10:33.10Och denna ackumulering, som jag nämnde tidigare,
00:10:35.24avtrubbar de kliniska effekterna av statiner.
00:10:38.12Så, vår nästa fråga är, varför statiner orsakar
00:10:41.27HMG CoA reduktas att ackumuleras till en så hög nivå?
00:10:44.14Vad jag bör påpeka har uppskattats vara
00:10:47.02minst 200 gånger.
00:10:49.29HMG CoA reduktas
00:10:51.25är normalt sett föremål för en enorm mängd återkopplingsreglering.
00:10:55.02Och denna återkopplingsreglering förmedlas delvis
00:10:57.29av steroler.
00:11:00.02Nu blockerar statinbehandling, som jag nämnde tidigare,
00:11:02.05 HMG CoA-reduktasaktivitet,
00:11:04.12och förhindrar syntesen av dessa sterolmolekyler.
00:11:07.29Och naturligtvis är detta förhindrande av sterolsyntesen
00:11:10.26 faktiskt ansvarig för uppregleringen av LDL-receptorerna
00:11:14.17och den efterföljande minskningen av LDL-kolesterol.
00:11:18.09Men eftersom statinerna
00:11:21.03 blockerar syntesen av steroler,
00:11:22.18 störs återkopplingsregleringen av reduktaset.
00:11:25.14Och som ett resultat av detta inträffar tre händelser.
00:11:27.28För det första, på grund av denna minskning av kolesterol
00:11:31.09och andra produkter från kolesterolsyntesvägen,
00:11:35.08det sker en ökad transkription av reduktasgenen,
00:11:39.07det sker en ökad översättning
00:11:41.28av reduktasets mRNA,
00:11:43.17och slutligen en ökad stabilitet
00:11:45.24för reduktasproteinet.
00:11:47.13Dessa tre händelser är alltså ansvariga
00:11:49.19för den markanta ökningen av reduktasproteinet
00:11:52.03 som jag visade dig i den föregående bilden.
00:11:55.18Mitt laboratorium har under årens lopp varit intresserat av att försöka förstå
00:11:59.27 de molekylära mekanismer som ligger bakom
00:12:02.22 den ökade stabiliteten hos proteinet,
00:12:04.09och det kommer att vara ämnet för resten av denna presentation.
00:12:09.16Denna bild visar att steroler
00:12:13.08 faktiskt påskyndar nedbrytningen
00:12:15.26av HMG CoA reduktas.
00:12:17.14Så, i detta experiment,
00:12:19.11 använde vi klassisk puls-chase-analys
00:12:20.29för att övervaka reduktasets stabilitet i celler
00:12:23.16som har behandlats i frånvaro eller närvaro av steroler.
00:12:26.00Så, vad vi gör här är att vi typiskt sett märker celler med radioaktivitet,
00:12:29.27en liten delmängd HMG CoA reduktasmolekyler.
00:12:33.25Vi tar sedan bort denna radioaktivitet,
00:12:35.25och följer sedan pres…
00:12:37.25stabiliteten hos reduktasproteinet
00:12:39.26i frånvaro eller närvaro av steroler.
00:12:44.10Och som du kan se här,
00:12:46.08när cellerna jagas i media
00:12:49.07som inte innehåller någon radioaktivitet,
00:12:51.01i avsaknad av steroler
00:12:52.28är reduktaset ganska stabilt över tid.
00:12:55.Men som du kan se,
00:12:57.21tillförseln av steroler i chase-mediet
00:12:59.26för att reduktasnivåerna minskar markant.
00:13:02.20Detta är återigen ett tecken på den sterolaccelererade nedbrytningen
00:13:06.04av HMG CoA reduktas.
00:13:09.16För att förstå de molekylära mekanismerna
00:13:11.22för denna sterolinducerade nedbrytning av reduktas,
00:13:14.15 måste vi förstå strukturen av HMG CoA reduktas-proteinet.
00:13:18.05Och reduktasets domänstruktur
00:13:20.14är faktiskt illustrerad på denna bild.
00:13:22.18 HMG CoA reduktas
00:13:24.16 består av två olika domäner.
00:13:26.28Det har en N-terminal domän
00:13:29.06som förankrar proteinet i membranen i det endoplasmatiska retikulumet,
00:13:32.14 eller ER.
00:13:35.00Denna N-terminala domän,
00:13:36.29som vi kallar membrandomän,
00:13:39.04 innehåller åtta membranöverskridande regioner.
00:13:42.05Och den följs av den andra domänen för HMG CoA reduktas,
00:13:45.07som vi kallar den katalytiska domänen.
00:13:47.24Den katalytiska domänen sticker ut i cellens cytosol
00:13:51.24och innehåller all enzymatisk aktivitet hos HMG CoA-reduktas.
00:13:56.03En trunkerad version av reduktaset
00:13:59.29som endast innehåller den katalytiska domänen
00:14:02.13kan helt och hållet rädda syntesen av mevalonat
00:14:06.28i celler som saknar HMG CoA reduktas.
00:14:10.13Den katalytiska domänen är alltså både nödvändig och tillräcklig
00:14:13.01för syntesen av mevalonat.
00:14:15.29 Vilket då väcker frågan,
00:14:17.28varför är detta protein membranbundet?
00:14:19.26Och det visar sig att reduktas
00:14:22.02 faktiskt är ett membranbundet protein redan i jäst.
00:14:25.18Funktionen hos reduktasets membrandomän
00:14:28.26 illustrerades i detta tidiga experiment
00:14:31.27 där man jämförde stabiliteten hos den katalytiska domänen
00:14:35.08 – som, kom ihåg, innehåller all enzymatisk aktivitet –
00:14:37.26med enzymet i sin fulla längd.
00:14:40.20Och återigen användes en enkel puls-chase-analys
00:14:42.21 för att övervaka stabiliteten hos dessa två proteiner.
00:14:47.13Som du kan se i panelen till vänster,
00:14:49.03 producerar den trunkerade katalytiska domänen
00:14:53.14ett mycket stabilt protein som… och det är viktigt,
00:14:57.08 dess nedbrytning inte påverkas av steroler.
00:14:59.20Däremot är det fullständiga proteinet – som återigen innehåller membrandomänen –
00:15:03.07 mindre stabilt, även i avsaknad av steroler.
00:15:06.13Och du kan se att steroler påskyndar
00:15:09.25nedbrytningen av HMG CoA reduktas,
00:15:12.09 vilket tyder på att membran domänen…
00:15:15.12membrandomänens funktion
00:15:17.25är denna sterol-accelererade eller sterol-inducerade nedbrytning.
00:15:22.08Så, vad de tidigare studierna indikerade
00:15:25.12är att reduktasets membrandomän
00:15:28.03är nödvändig och tillräcklig för sterolaccelererad nedbrytning,
00:15:30.25och de antydde att membrandomänen,
00:15:33.16 antingen direkt eller indirekt,
00:15:35.16kan känna av intracellulära nivåer av steroler.
00:15:38.00och att känna av resulterar kanske i,
00:15:41.02en konformationsförändring i reduktasets membrandomän
00:15:43.29som gör att proteinet blir mottagligt för snabb nedbrytning.
00:15:48.14Och eftersom statiner blockerar kolesterolsyntesen,
00:15:52.01 blockerar statiner faktiskt detta
00:15:54.22som vi kallar ER-associerad nedbrytning — eller ERAD —
00:15:57.08av HMG CoA-reduktas.
00:16:02.Ett viktigt genombrott i vår förståelse
00:16:04.23 av ERAD av HMG CoA reduktas
00:16:06.15 kom med upptäckten av ett par proteiner
00:16:08.28 – ER-membranproteiner –
00:16:10.23 som kallas Insig-1 och Insig-2.
00:16:14.15 Dessa Insig-proteiner är för detta föredrag
00:16:16.27 mycket överflödiga.
00:16:18.14De har redundanta roller i nedbrytningen, eller ERAD,
00:16:22.06av HMG CoA reduktas.
00:16:24.00De är identiska… de är ungefär 85 % identiska,
00:16:26.23 och de är mycket hydrofoba proteiner.
00:16:29.24Nu illustrerades Insigs roll i ERAD av HMG CoA reduktas
00:16:34.28 för första gången i det här experimentet.
00:16:37.19Så, även här använde vi oss av puls-chase-analys
00:16:40.15för att mäta den sterolaccelererade nedbrytningen
00:16:43.29av reduktaset i celler
00:16:47.02som antingen var transfekterade med kontrollmolekyler,
00:16:51.06 kallade siRNAs,
00:16:53.05eller celler som transfekterades med siRNAs
00:16:55.26som skulle leda till en knockdown av uttrycket
00:16:58.13av både Insig-1 och Insig-2.
00:17:02.07Och som du kan se i panelen till vänster,
00:17:04.13i de celler som transfekterats med kontroll siRNAs,
00:17:08.04steroler påskyndar markant nedbrytningen
00:17:12.07av HMG CoA reduktas.
00:17:14.13Oppna cirklar är alltså experiment som utförts i frånvaro,
00:17:17.09och slutna cirklar är experiment som utförts
00:17:20.15i närvaro av steroler.
00:17:22.12Och vad man lätt kan se är att knockdown av Insig-1 och Insig-2
00:17:26.23 helt avskaffar sterol-accelererad nedbrytning,
00:17:30.02 vilket tyder på att dessa proteiner
00:17:32.28 spelar en nyckelroll i processen.
00:17:35.27Så vår nästa fråga är,
00:17:38.02vilken mekanism
00:17:39.26med vilken Insigs påskyndar ERAD av HMG CoA reduktas?
00:17:47.09Detta experiment…
00:17:48.21Denna bild visar att hämmare av proteasomen, 26S-proteasomen,
00:17:53.21 blockerar den sterolinducerade nedbrytningen av HMG CoA reduktas.
00:17:57.15Så, som du kan se i detta experiment…
00:18:00.18i de två första spåren, orsakade steroler en markant nedbrytning av reduktaset,
00:18:04.17och denna nedbrytning blockeras helt
00:18:06.19när dessa celler behandlas med proteasomhämmaren.
00:18:12.03Så, med… detta gör att vi kan skapa en annan modell
00:18:15.27i vilken, återigen, reduktasets membrandomän
00:18:18.25 antingen direkt eller indirekt
00:18:21.22 känner av nivåerna av intracellulära steroler,
00:18:24.Detta får reduktaset att binda till Insigs,
00:18:28.12och denna Insig-bindning leder till reaktioner som gör att reduktaset
00:18:32.06 nu bryts ned av 26S-proteasomen.
00:18:37.22Nu är det känt att de flesta substrat för proteasomerna
00:18:41.00kräver föregående ubiquitinering.
00:18:44.05Ubiquitinering är en process genom vilken
00:18:46.23det lilla proteinet ubiquitin blir kovalent fäst
00:18:50.16till substratmolekyler.
00:18:52.08Och när en kedja av ubiquitiner
00:18:54.16är fäst vid substratet,
00:18:56.08känns den av proteasomerna för nedbrytning.
00:19:00.25Detta kallas polyubiquitinering,
00:19:02.25och polyubiquitinering av proteiner
00:19:05.14 kräver minst tre olika typer av enzymer.
00:19:07.29Det illustreras i denna bild.
00:19:11.09I det första steget,
00:19:13.15 aktiverasubiquitin
00:19:15.20på ett ATP-beroende sätt av ett enzym som kallas E1,
00:19:19.11eller ubiquitin-aktiverande protein.
00:19:22.15I nästa steg överförs ubiquitinet från E1 till…
00:19:27.13till ett annat enzym som kallas E2, eller ubiquitin-konjugerande enzym.
00:19:32.16I det sista steget kombineras E2 med ett E3,
00:19:36.24eller ubiquitinligas,
00:19:39.08som i sin tur associeras med substratet,
00:19:42.09som här visas i grönt.
00:19:44.11Vad E3 gör är att det underlättar överföringen av ubiquitin
00:19:47.27från det ubiquitin-konjugerande enzymet
00:19:50.00till en lysinrest i substratproteinet,
00:19:53.08och skapar ett ubiquitinerat substrat.
00:19:57.28Denna process sker många gånger,
00:20:00.02 tills en ubiquitinkedja byggs upp på substratproteinet.
00:20:06.02Det kan nu kännas igen av proteasomerna för nedbrytning.
00:20:10.18Så, med tanke på att dessa Insig-proteiner
00:20:12.26är nödvändiga för nedbrytning av reduktas,
00:20:15.08och att reduktas faktiskt bryts ned av proteasomerna,
00:20:19.02 är vår nästa fråga, är reduktas ubiquitinerat?
00:20:23.20Den frågan besvarades i detta experiment
00:20:26.11som visas på denna bild.
00:20:28.21Så, vad vi har gjort i detta experiment är att vi har behandlat celler
00:20:31.15i frånvaro och närvaro av steroler
00:20:33.20och proteasomhämmaren.
00:20:37.05Efter dessa behandlingar,
00:20:39.11har vi immunutfällt reduktaset
00:20:41.21och sedan undersöker vi dessa immunoprecipitat för antingen totalt reduktas,
00:20:43.20visas på den nedre panelen,
00:20:45.18eller ubiquitinerat reduktas.
00:20:49.07Så, som du kan se i den första körbanan,
00:20:51.01 även om reduktas dras ner i dessa experiment,
00:20:55.11 ser vi ingen reaktivitet med ubiquitinering.
00:20:58.14Steroler gör dock att reduktaset blir ubiquitinerat.
00:21:03.09Och denna ubiquitinering ökar markant
00:21:07.22om vi också inkluderar proteasomhämmare.
00:21:09.27Det här tyder alltså på att steroler
00:21:12.16 faktiskt gör att reduktaset blir ubiquitinerat,
00:21:14.20 och att det ubiquitinerade proteinet nu bryts ner av proteasomerna,
00:21:17.18som indikeras av stabiliteten hos ubiquitinerat reduktas
00:21:21.21 genom dessa proteasomhämmare.
00:21:24.27Vår nästa fråga är,
00:21:27.07är Insigs nödvändiga för denna sterolinducerade ubiquitinering av reduktaset?
00:21:32.16Och återigen vänder vi oss till siRNA.
00:21:35.08Celler transfekterades antingen med kontroll siRNA
00:21:38.18eller siRNA mot Insig-1 och -2.
00:21:41.03Vi behandlar sedan dessa celler i frånvaro eller närvaro av steroler,
00:21:43.20och undersöker sedan för ubiquitinerat reduktas.
00:21:47.16Och som ni kan se i de två första spåren,
00:21:49.10 är reduktaset fint ubiquitinerat i närvaro av steroler,
00:21:52.08och knockdown av Insig-1 och Insig-2
00:21:56.02 helt upphäver denna ubiquitinering.
00:22:01.01Detta gör att vi nu kan fylla fler luckor i vår modell
00:22:04.07för Insig-medierad ERAD av HMG CoA-reduktas.
00:22:09.14Nu visar det sig att en undergrupp av Insig-molekyler
00:22:12.00 faktiskt associerar sig med ett E3/E2 ubiquitinligaskomplex.
00:22:16.27I närvaro av steroler,
00:22:20.15reduktasets membrandomän
00:22:23.03avkänner sterolen,
00:22:24.25och denna avkänning får reduktaset att binda till Insigs,
00:22:27.28och naturligtvis binder dessa Insigs
00:22:31.13 sedan överbryggar reduktaset till E3/E2 ubiquitinligaskomplexet.
00:22:36.26Denna överbryggning resulterar sedan i ubiquitinering av reduktaset
00:22:40.00 vid två lysinrester i membrandomänen.
00:22:43.17Och denna ubiquitinering leder sedan till att reduktaset
00:22:46.17 avlägsnas från ER-membranet
00:22:50.09och därefter bryts ned av proteasomerna,
00:22:52.22 genom en process som vi inte är helt…
00:22:55.07 genom en process som inte är helt förstådd.
00:23:00.20Så, sammanfattningsvis har jag berättat för er idag
00:23:03.16att HMG CoA reduktas är det hastighetsbegränsande enzymet
00:23:06.07i kolesterolsyntesvägen,
00:23:08.01och det är ett mål för dessa kolesterolsänkande statinläkemedel.
00:23:11.26Reduktaset styrs genom ett mycket komplext
00:23:15.16feedbackregleringssystem
00:23:18.01som förmedlas av kolesterol och andra typer av steroler.
00:23:20.Och att statiner stör detta återkopplingsreglerande system,
00:23:24.03 delvis genom att blockera denna Insig-medierade ubiquitinering
00:23:27.10och ERAD av HMG CoA reduktas.