Plasmidmedierat AmpC β-laktamas CITM- och DHAM-gener bland gramnegativa kliniska isolat

Bakgrund

Läkemedelsresistens bland vissa gramnegativa bakterier (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii och Pseudomonas aeruginosa) har uppstått och spridit sig över hela världen. Bland Enterobacterales-familjen är Escherichia coli och Klebsiella spp. ofta isolerade organismer som har anmärkningsvärda läkemedelsresistensegenskaper. β-laktamer är de vanligaste läkemedlen mot dessa motsträviga stammar och utgör ensamma omkring två tredjedelar av de senaste kliniska förskrivningarna.1 Denna grupp innehåller fyra stora kemiska klasser: penicilliner, cefalosporiner, karbapenemer och monobakterier, där karbapenemer används som sista utväg i den empiriska behandlingen mot patogena stammar av Gram-positiva, Gram-negativa och anaeroba bakterier.2

Resistens mot β -laktamer kan tillskrivas produktionen av β-laktamas, dessa hydrolytiska enzymer som kan inaktivera antibiotika innan de når penicillinbindande proteiner (PBP) som är belägna på cytoplasmimembranet.3 De större β-laktamasfamiljerna omfattar plasmidmedierade extended-spectrum β-laktamas (ESBL), AmpC, cefalosporinaser och karbapenemas. Alla klasser har upptäckts globalt med några få av dem koncentrerade till specifika länder.1

Generna som kodar för AmpC β-laktamas har spridits i stor utsträckning och upptäcks ofta i bakteriella plasmider. Den första plasmidkodade AmpC-varianten identifierades för första gången 1989 från Klebsiella pneumoniae isolerad i Sydkorea. Den fick namnet CMY-1 på grund av dess fenotypiska egenskap i samband med cefamycinas och var notoriskt resistent mot cefoxitin.4,5 På kort tid upptäcktes många familjer av plasmidmedierade AmpC-varianter, främst från isolat av K. pneumoniae och E. coli. Bakterier som innehar plasmidmedierade AmpC-genotyper tillskrevs på grundval av homologi i nukleinsyresekvensen, vilket bildade ett större antal bakteriesläkten som fungerade som källa för dessa plasmider och ett antal AmpC-familjer.6 Hittills har följande AmpC-familjer rapporterats globalt: två familjer av CMY-β-laktamas (CMY-1 och CMY-2) isolerade från Aeromonas hydrophila respektive Citrobacter freundii; enzymer av FOX-typ och MOX-typ isolerade från Aeromonas spp.ACC-familjen från H. alvei, LAT-familjen av cefalosporinaser från C. freundii, MIR- och ACT-familjerna från Enterobacter spp. och DHA-familjen från Morganella morganii.4,6,7 Majoriteten av plasmidkodade AmpC-gener finns i isolat av E. coli och K. pneumoniae vid nosokomiala infektioner, medan resistens hos andra gramnegativa bakterier som E. cloacae, C. freundii, S. marcescens och M. morganii ges av kromosommedierade AmpC-β-laktamaser, vilket ökar resistensen mot cefalosporiner med brett spektrum8 . De organismer som producerar ESBL som ofta kännetecknas av samexpression med AmpC β-lactamaser utgör ett allvarligt hot vid diagnostik och behandling av patogenerna.

För övrigt är AmpC β-lactamasgener, särskilt MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM och ACCM, ansvariga för utvecklingen av bredspektrumresistens mot de flesta β-laktamer (andra än cefepim och karbapenemer). Dessutom kan förvärv av dessa gener i bakterierna ytterligare öka resistensen eftersom hämmare av klass A-enzymer (inklusive clavulansyra, sulbactam och tazobactam) och p-kloromerkuribenzoat inte är effektiva mot AmpC-β-laktamaserna, även om vissa av dem kan hämmas av tazobactam eller sulbactam.6

Trots att ansträngningar görs för att bromsa tillväxten och spridningen av läkemedelsresistenta patogener är studierna om AmpC β-lactamaser i resursbegränsade miljöer fortfarande otillräckliga. Det viktigaste steget för att hantera den ökande antimikrobiella resistensen (AMR) är den exakta upptäckten av patogena (och/eller resistenta) stammar i diagnostiska laboratorier. Laboratorieprotokollen för rutinrapportering ger dock inte det exakta resultatet i Nepal, eftersom AmpC-β-laktamaserna är svåra att identifiera enbart genom fenotypiska tester och ofta felaktigt upptäcks som ESBL i kliniska laboratorier. Enterobacterales-isolat som är positiva i screeningtestet för ESBL-fenotyp men negativa vid bekräftande test anses vanligen vara potentiella producenter av AmpC β-lactamaser, antingen genom kromosomal depression eller plasmidöverföring.9

Även de sakkunniga kliniska mikrobiologerna misslyckas med att identifiera plasmidmedierat AmpC β-lactamas, vilket tyder på att det finns ett behov av en mer exakt och specifik metod för omedelbar upptäckt. Vissa av dessa förfaranden är dock resurskrävande och kräver ofta reagenser som inte är lättillgängliga.10 Av dessa skäl går AmpC β-lactamaser oupptäckta i kliniska prover. Därför har ett mer tillförlitligt och giltigt laboratorieprotokoll bestående av multiplex polymeraskedjereaktion (PCR) utarbetats för att underlätta diagnosen av plasmidkodade AmpC-gener som är ansvariga för AmpC β-laktamasuttryck i olika kliniska infektioner.11

De flesta studierna är inriktade på prevalensen av ESBL-enzymer i gramnegativa kliniska isolat i Nepal.12-16 Det finns ett begränsat antal studier om AmpC β-laktamasenzymer i gramnegativa bakterier i Nepal. En studie som genomfördes i Kathmandudalen rapporterade 27,8 % av Enterobacterales-isolat som AmpC β-laktamasproducenter med hjälp av fenotypisk metod.17 Såvitt vi vet finns det begränsade studier relaterade till detektion och karakterisering av AmpC β-laktamasenzymer i gramnegativa bakterier med hjälp av både fenotypiska och genotypiska metoder i Nepal. Det är viktigt att införa standardiserade fenotypiska och genotypiska metoder för antibiotikakänslighetstest för att screena läkemedelsresistenta patogener på sjukhus. Denna studie genomfördes för att isolera och identifiera AmpC β-laktamasgener (blaCITM och blaDHAM) i gramnegativa bakterieisolat med hjälp av både fenotypisk screening och konfirmerande metoder.

Metoder

Studieutformning

Detta är en sjukhusbaserad tvärsnittsstudie som genomfördes från juni 2017 till januari 2018 vid Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Totalt 1151 icke-duplicerade kliniska prover samlades in och behandlades under studieperioden. Proverna omfattade urin (n=412), blod (n=206), kateterspets (n=163), pus (n=132), avföring (n=89), CSF (n=53), sårsvabb (n=58) och vaginalsvabb (n=38). Proverna togs i en steril, väl märkt och läckagesäker behållare; och bearbetades så snart som möjligt.18 Alla besökande patienter som misstänktes ha bakterieinfektioner och som gav sitt samtycke till att medverka ingick i studien. Studiedeltagare med otillräcklig demografisk information exkluderades.

Kultur av prover och identifiering av isolaten

Proverna samlades in enligt standardiserade mikrobiologiska riktlinjer för insamling av urin, avföring, pus, blod, CSF och kateterspets. De prover som var lämpliga inokulerades vidare på blodagar (BA), chokladagar (CA) och MacConkey-agar (MA). Dessutom inokulerades urinproverna i kromogen UTI-agar. Isolaten identifierades med hjälp av mikrobiologiska standardparametrar som koloniernas morfologiska utseende, färgningsreaktioner och biokemiska egenskaper.19,20

Testning av antibiotikakänslighet

Alla identifierade gramnegativa isolat genomgick vidare ett antimikrobiellt känslighetstest in vitro med hjälp av den modifierade Kirby-Bauer-diskdiffusionsmetoden.21 För det första tillverkades inokulum genom att bakteriekolonier överfördes från nutrientagar till steril normal saltlösning. Inokulernas turbiditet fastställdes till 0,5 McFarland-standard enligt CLSI:s riktlinjer. Mattkultur av testinokulerna framställdes också på Muller-Hinton-agar (MHA). Antibiotikadiskar (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Indien) användes i följande proportioner: amoxicillin (10 μg), azitromycin (10 μg), amikacin (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftazidim (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), imipenem (10 μg), piperacillin/tazobaktam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), kotrimoxazol (25 μg) och cefepim (30 μg). Den inokulerade plattan inkuberades aerobt vid 37 °C i upp till 18 timmar. Efter tillräcklig inkubation mättes hämmande zoner (ZOI) runt skivorna och resultatet klassificerades som känsligt, intermediärt eller resistent.21 Isolat som uppvisar resistens mot tre eller fler antibiotika av olika klasser tolkades som multiresistenta.22

Screening för AmpC β-laktamaser

Isolaten screenades först för eventuell produktion av AmpC β-laktamaser enligt CLSI:s riktlinjer, 2019.23 För screening utsattes ceftazidim eller cefotaxim eller cefoxitin eller ceftriaxon, vardera 30 µg, för AST-testning och organismer som var resistenta mot dessa antibiotika (som uppvisade en inhiberingszon med en diameter ≤ 18 mm) screenades som potentiella AmpC-producenter och genomgick ytterligare bekräftande tester.

Bekräftelse för AmpC β-lactamaser

Positiva producenter av AmpC β-lactamaser bekräftades genom AmpC-disk-test och inhibitorbaserat bekräftelsetest (borsyretest).

I borsyretestet gjordes en mattkultur av testorganismen på MHA-platta med 0,5 McFarland-lösningar. Två cefoxitinskivor (30 µg), varav den ena var tillsatt med fenylborsyra (400 µg), placerades på mattkulturen på MHA-plattan och inkuberades och resultaten tolkades. Om det fanns en ökning av inhiberingszonen med ≥5 mm när den önskade antibiotikadisken (ceftazidim eller cefotaxim) bedömdes i kombination med fenylborsyra än under testet utan kombinationen (antibiotikadisk enbart), markerades isolatet som positivt konfirmationstest.

I disk approximationstestet sattes diskar över mattkulturen av E. coli ATCC 25922. 30μg ceftazidimskiva placerades i mitten av plattan följt av 10μg imipenem, 30μg cefoxitin och 20/10μg amoxicillin/clavulanatskivor som placerades på ett avstånd av 20 mm från ceftazidimskivan. Kolonierna av testorganismen tillsattes till en skiva och sedan vändes plattan och inkuberades i 24 timmar vid 37 °C aerobt. Varje intryckning eller utplattning av ZOI indikerade produktion av AmpC β-laktamas av isolaten.20,24

Konservering av AmpC β-laktamaspositiva isolat

Glycerolstockberedningsmetoden användes för konservering. Organismerna konserverades i Tryptic Soy Broth (TSB) innehållande 40 % glycerol och förvarades vid -20ºC.25

Rå plasmid-DNA-extraktion

En isolerad koloni av testorganismen inokulerades i Luria Bertani (LB)-buljong. Inokulumet inkuberades aerobt med hjälp av en shaker i vattenbad vid 37 °C i 18-24 timmar. Den på så sätt erhållna renodlade kulturen utsattes för alkalisk analys för att extrahera plasmid-DNA. Det extraherade plasmid-DNA:t suspenderades sedan i TE-buffert och förvarades vid -20°C tills vidare undersökningar.26

Amplifiering av AmpC β-laktamasgener (blaCITM och blaDHAM) med PCR

AmpC β-laktamasgener (blaCITM och blaDHAM) amplifierades med PCR med plasmid-DNA-preparatet som mall. De primers som användes för blaCITM-genen var CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) och CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG CTG AAC GTG GTG GCT GGC -3ʹ) som framåtriktad respektive omvänd primer medan primrarna för blaDHAM-genen var den framåtriktade sekvensen DHAM for (5ʹ AAC TTT CTG CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) och den omvända sekvensen DHAM_rev (3ʹ CCG CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Reaktionsvolymen fastställdes till 25 µl genom att tillsätta 12,5 µl 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estland), 0,5 µl vardera av de framåtriktade och bakåtriktade primrarna och 4 µl DNA-mall samt ddH2O 7,5 µl. Den optimerade PCR-amplifieringen av båda generna var 94ºC i 3 minuter för inledande denaturering; 35 cykler av denaturering vid 94ºC i 30 sekunder; 25 cykler av glödgning vid 62ºC i 30 sekunder; 35 cykler av förlängning vid 72ºC i 1 minut; och slutlig förlängning vid 72ºC i 7 minuter.11,27

Rensning av DNA

Plasmid-DNA renades med etanolutfällningsmetoden. I denna metod sköljdes DNA-pelletsen med iskall 70 % etanol och lämnades att torka i 10 minuter vilket underlättar alkoholavdunstningen. DNA-pelletsen suspenderades i en buffertlösning innehållande Tris, EDTA och RNaser för att easera ut de återstående föroreningarna.

Detektering av PCR-produkter med hjälp av gelelektrofores

De amplifierade produkterna visualiserades med hjälp av gelelektrofores i 1,5 % agarosgel som färgats med 0,1 µL ethidiumbromid. Efter gelberedningen tillsattes 2 µl av 100 bp DNA ladder till den första brunnen som markör, 2 µl av negativ kontroll till en annan brunn, 2 µl av positiv kontroll till en annan brunn och 2 µl av PCR-produkter till de återstående brunnarna. Slutligen visualiserades gelen under UV-trans-illuminator.28

Kvalitetskontroll

En aseptisk standardprocedur antogs för förfarandena i denna studie. Alla partier av odlingsmedier och kemiska reagenser bearbetades med aseptisk teknik enligt CLSI:s riktlinjer. Inom AST upprätthölls kvalitetskontrollen genom att använda kontrollstammar av E. coli ATCC 25922. Vid PCR säkerställdes kvalitetskontrollen genom användning av Klebsiella-isolat som bar båda generna i fråga, medan blanka eller negativa kontroller framställdes utan användning av nukleinsyror. Alla dessa kontroller användes i varje sats av PCR-analysen.

Statistisk analys

Data matades in och analyserades med hjälp av programvaran SPSS version 24.0. Sambanden undersöktes med hjälp av Chi-kvadrat-test med 95 % konfidensintervall (CI) bland demografiska variabler som kön och ålder hos försökspersonerna.

Resultat

Demografiska och kliniska egenskaper hos de inskrivna patienterna

Av de 1151 inskrivna patienterna var 54,2 % (624/1151) män och 45,8 % (527/1151) kvinnor. Av 253 bakterietillväxt var 47,8 % (121/253) från män och 52,2 % (132/253) från kvinnor. Av den totala bakterietillväxten (253) kom 26,1 % (66/253) från urinprov, följt av kateterspetsar (17,4 %; 44/253), blod (16,2 %; 41/253), pus (11,9 %; 30/253) och sårvabbar (10,7 %; 27/253). När det gäller åldersfördelningen av patienterna hittades den högsta tillväxten av bakteriella patogener i åldersgruppen 16-45 år (39,5 %; 100/253) följt av 46-60 år (30,1 %; 76/253), >60 år (24,1 %; 61/253) och 0-15 år (6,3 %; 16/253) respektive (tabell 1).

Tabell 1 Demografisk och klinisk karaktär hos patienter som besöker Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Fördelning av bakterieisolat i kliniska prover

Av totalt 1151 kliniska prover, 22 % (253/1151) uppvisade tillväxt på kulturmedier. Av 253 bakterieisolat var de flesta (89,3 %; 226/253) gramnegativa bakterier. Bland bakterietillväxten var E. coli (28,5 %; 72/253) den dominerande organismen följt av Pseudomonas aeruginosa (16,2 %; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8 %; 40/253), grampositiva bakterier (10,7 %; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9 %; 25/253) och Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figur 1)

Figur 1 Fördelning av bakteriesläkten i odlingspositiva kliniska prover (n=253).

Antibiotikakänslighetsmönster hos isolerade gramnegativa bakterier

Av 226 gramnegativa bakterieisolat var 66.8 % (151/226) var resistenta mot cefoxitin, följt av ceftazidim (58,4 %; 132/226), ciprofloxacin (53,5 %; 121/226) och cefepim (51.8 %; 117/226) medan isolaten var mest mottagliga för meropenem (69 %; 156/226), ertapenem (68,6 %; 155/226), imipenem (66,8 %; 151/226), amikacin (61,1 %; 138/226), piperacillin/tazobaktam (56,6 %; 128/226) och azitromycin (53.1 %; 120/226) (tabell 2).

Tabell 2 Antibiotikakänslighetsmönster hos gramnegativa bakterieisolat (n=226)

Mönster för multiresistens (MDR) hos isolaten

Av 226 isolat var 46.9 % (106/226) av isolaten var MDR. Den högsta procentandelen MDR hittades bland E. coli (31,1 %; 33/106) följt av P. aeruginosa (20,8 %; 22/106), A. baumannii (18,9 %; 20/106), K. pneumoniae (9,4 %; 10/106) och K. oxytoca (4,7 %; 5/106) respektive (figur 2). Hos enskilda arter hittades den högsta andelen multiresistens hos C. freundii (100 %; 8/8) följt av P. aeruginosa (53,6 % 22/41), C. koseri (50 %; 2/4), A. baumannii (50 %; 20/40) och E. coli (45,8 % 33/72), respektive (figur 2).

Figur 2 Fördelning av MDR-bakterier och total MDR % och MDR inom varje art.

AmpC-detektion med olika tester

Av 226 gramnegativa isolat visade 50 % (113/226) resistens mot cefoxitin. AmpC β-laktamasproducerande isolat bekräftades med två olika konfirmationstester, disk-test och boronsyretest. Av de 91 isolaten visade 91,2 % (83/91) positivt resultat i båda testerna och 8,8 % (8/91) av isolaten visade positivt resultat endast i boronsyretestet, vilket bekräftades av minst ett test, och betraktades som AmpC β-laktamasproducenter.

Förekomst av blaCITM- och blaDHAM-gener i AmpC β-laktamasproducerande gramnegativa isolat

I PCR-testet testades 90,1 % (82/91) och 87,91 % (80/91) av isolaten positivt för blaCITM och blaDHAM. De amplifierade blaCITM- och blaDHAM-generna med en ampliconstorlek på 465 bp och 405 bp upptäcktes (figurerna 3 och 4).

Figur 3 Agarosegelelektrofores (1,5 %) som användes för separering av PCR-produkter. Lane 2, positiv kontroll; Lane 3, 5 och 7 är CITM-positiva; Lane 4 och 6, CITM-negativa; och Lane 8. negativ kontroll.

Figur 4 Agarosgelelektrofores (1,5 %) som används för separation av PCR-produkter. Lane 2, positiv kontroll; Lane 3, 4, 6 och 7 är Dham-positiva; Lane 5, Dham-negativ; och Lane 8, negativ kontroll.

Distribution av AmpC β-laktamas-, blaCITM- och blaDHAM-gener bland gramnegativa isolat och deras förhållande till kön, ålder, kliniska prover och kliniska isolat

Av 91 AmpC-producenter kom 50,6 % (46/91) av isolaten från kvinnliga patienter och 49,4 % (45/91) från manliga patienter. På samma sätt erhölls lika stora andelar (50 %; 41/82) blaCITM-gener från prover från båda könen medan 51,3 % (41/80) och 48,7 % (39/80) blaDHAM-gener påvisades i prover från manliga respektive kvinnliga patienter. Det fanns inget signifikant samband mellan patientens kön och produktionen av AmpC-enzymer och AmpC-gener (tabell 3).

Tabell 3 Fördelning av AmpC β-laktamas-, CITM- och DHAM-gener bland gramnegativa bakterieisolat och deras förhållande till kön, ålder och kliniska prover

Högsta antalet AmpC β-laktamasproducenter (40.7 %; 37/91) och prevalens av isolat som producerade blaCITM (40,2 %; 33/82) och blaDHAM (41,2 %; 33/80) erhölls från åldersgruppen (46-60) år följt av (16-45) år (30,8 %; 28/91), (29,3 %;24/82) och 31,3 %; 25/80) respektive. Det fanns ett signifikant samband mellan AmpC β-laktamasenzymproduktion och åldersgrupp (p=0,01) medan andra faktorer inklusive förvärv av blaCITM- och blaDHAM-gener inte hade något signifikant samband med patientens ålder (tabell 3).

Av kliniska prover upptäcktes det högsta antalet AmpC β-laktamasproducerande isolat (20,9 %; 19/91) från blod och kateterspetsar, följt av urin (18,7 %; 17/91), pus (13,3 %; 12/91) och sårsvabbar (9,9 %; 9/91). På samma sätt upptäcktes det högsta antalet blaCITM- och blaDHAM-producerande isolat från kateterspetsar (21,9 %; 18/82); (22,5 %; 18/80), följt av blod (19,5 %; 16/82); (21,3 %; 17/80), urin (17,0 %; 14/82); (17,5 %; 14/80) och pus (13,4 %; 11/82); (8,8 %; 7/80), respektive. Det fanns inget signifikant samband mellan kliniska prover, AmpC β-laktamasproduktion och generna: blaCITM och blaDHAM (tabell 3).

Distribution av AmpC β-laktamas och förvärv av blaCITM- och blaDHAM-gener i olika gramnegativa bakterier

Den högsta prevalensen av AmpC β-laktamasenzymer hittades i E. coli (28,6 %; 26/91), följt av P. aeruginosa (26,4 %; 24/91), A. baumannii (13,2 %; 12/91) och K. pneumoniae (10,9 %; 10/91). Den högsta prevalensen av blaCITM- och blaDHAM-gener upptäcktes hos E. coli (30,6 %; 25/82) (31,3 %; 25/80) följt av P. aeruginosa (25,7 %; 21/82), (22,5 %; 18/80) A. baumannii (12,2 %; 10/82), (12,4 %; 10/80) respektive K. pneumoniae (10,9 %; 9/82), (12,4 %; 10/80) (tabell 3).

Diskussion

Den ökande förekomsten av antimikrobiell resistens förblir ett av de största folkhälsoproblemen i utvecklingsländer som Nepal29 , vilket har lett till förlängd sjukhusvistelse, ökade behandlingskostnader, begränsning av terapeutiska alternativ och ökad sjuklighet och dödlighet.29,30 Produktion av β-laktamas är den viktigaste försvarsmekanismen mot β-laktamantibiotika. Denna studie genomfördes för att undersöka förekomsten av Amber Class C β-lactamaser (AmpC) i gramnegativa organismer som härrör från kliniska prover som erhållits vid ANIAS, Kathmandu, Nepal. I studien bedömdes också förekomsten av AmpC β-laktamasgener (blaCITM och blaDHAM) med hjälp av PCR-analys. Vi fann en hög prevalens av dessa enzymer och gener, även om prevalensen av sådana enzymer varierade från en geografisk region till en annan, inom och mellan länderna.

Utav 1151 kliniska prover uppvisade endast 253 (21,9 %) en signifikant tillväxt av organismer. Av den totala (253) bakterietillväxten var mer än nittio procent gramnegativa bakterier, E. coli var de mest dominerande isolaten bland dem. Våra resultat överensstämmer med tidigare studier som rapporterats från Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, Indien,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Etiopien,38 och Mexico City, Mexiko.39 Något högre andel gramnegativa bakterieinfektioner observerades bland kvinnliga patienter, vilket kan bero på högre prevalens av urinvägsinfektioner bland kvinnor. Detta stämmer överens med tidigare studier från Model Hospital, Kathmandu,17 och Andra-Pradesh, Indien.40 I överensstämmelse med denna studie rapporterades högre andel pusinfektioner på postoperativa fall hos kvinnor (63,33 %) än hos män (43,75 %) i en studie som genomfördes i delstaten Uttar Pradesh i Indien.41

I denna studie uppvisade gramnegativa bakterieisolat högre resistens mot följande antibiotika: cefoxitin, ceftazidim, ciprofloxacin och cefepim, följt av kotrimoxazol medan meropenem, imipenem, piperacillin-tazobaktam och azitromycin rapporterades som de känsligaste antibiotika. Ett liknande mönster observerades i några av de tidigare resultaten från Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoxitin och ceftazidim med låg känslighet är de första linjens läkemedel som lätt hydrolyseras av bakterieenzymerna och är mindre användbara vid behandling av infektioner orsakade av gramnegativa patogener. I likhet med vår studie har imipenem/meropenem visat sig vara de känsligaste läkemedlen i tidigare studier från Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid, Spanien,44 och Wisconsin, USA.45

Antimikrobiell resistens (AMR) med ökande spridning av MDR är ett globalt problem, och dess effekter är större i låg- och medelinkomstländer där bördan av infektionssjukdomar är hög.30 Behandlingen av MDR-mikrober är dyr och svår och förvärras ytterligare av den höga prevalensen av nosokomiala infektioner.46 I denna studie visade sig nästan hälften av de isolerade gramnegativa isolaten (46,9 %; 106/226) vara MDR. Högre prevalens av MDR-bakterier har rapporterats i några andra studier som genomförts i Kathmandu46-49 och andra distrikt i Nepal.15,50,51 Produktion av ESBL, metallo β-laktamas (MBL) eller AmpC β-laktamas skulle kunna vara orsaken till den minskade mottagligheten för nyare generationer av antibiotika.52 Dessutom uppstår multiresistens på grund av aggregering och uttryck av olika gener på resistenta (R) plasmider eller gener som kodar för multiresistenta utflödespumpar.53 Dessutom är de gener som ansvarar för uttrycket av β-laktamasenzymer ständigt förknippade med icke-β-laktamantibiotika som aminoglykosider och fluorokinoloner.

I den här studien hittades AmpC-produktion i högre grad hos manliga patienter (41,67 %) än hos kvinnliga (38,98 %). Resultaten i denna studie överensstämmer med några andra studier från Kano, nordvästra Nigeria.54 Våra resultat skiljer sig dock från studier som rapporterats från Benin, Nigeria.55 Högre prevalens av UTI med multiresistens bland kvinnor har rapporterats i många studier, detta kan bero på högre prevalens av AmpC-producerande patogener bland kvinnor eftersom de är mer benägna att drabbas av UTI än män.

Användningen av cefoxitinresistens i diagnostiska laboratorier tjänar som ett tillförlitligt screeningsmedel/markerare för att upptäcka AmpC-produktion. Dessutom ger denna markör ett bra negativt prediktivt värde.

Trots sin breda räckvidd har några av studierna betonat användningen av cefoxitin som ett dåligt screeningmedel för AmpC-produktion. Detta kan bero på att det finns andra alternativa mekanismer än AmpC (en av dem är porinkanalmutation) som kan leda till falskt positiv tolkning (som cefoxitinresistens).52 Vår studie visade att en tredjedel av de gramnegativa isolaten (>40 %) var ansvariga för AmpC-produktion. Resultaten i denna studie stod i kontrast till studien från Model Hospital, Kathmandu.17 Skillnaden kan bero på den fenotypiska detektionsmetod som användes i denna studie som använde cefoxitinresistanstest och AmpC-disk-testmetod med användning av cefoxitin (30 µg). Det bekräftande testet som användes var fenylboronsyratest med cefoxitin 30 µg/400 µg fenylboronsyra. Boronsyraderivat har visat sig vara reversibla hämmare av AmpC β-laktamasenzymer.56

I denna studie observerades AmpC-produktion hos 91 (80,53 %) av 113 isolat. AmpC-produktionen i vår studie är något högre än andra studier som rapporterats från Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 och Indien.59

För att kompensera begränsningarna på grund av en av metoderna kan integrering av båda teknikerna i rutindiagnostik öka testens sensitivitet och specificitet i kliniska miljöer.

Totalt 73 gramnegativa isolat uppvisade förekomst av både blaCITM- och blaDHAM-gener. Dessa resultat stämmer överens med en tidigare studie som rapporterats från Ilam, Iran.27 I en liknande typ av studie som rapporterats från Indien visade det sig att blaCITM-gener var vanligare i E. coli.60 I vår studie undersöktes prevalensen av AmpC-associerade gener (blaCITM och blaDHAM) med fenotypiska och genotypiska metoder. Denna studie ger en bred analys av de gramnegativa bakterier som är associerade med produktion av AmpC β-laktamas och deras antibiotikakänslighetsmönster bland kliniska isolat. Resultaten av denna studie är viktiga för att informera om olika organismers resistensmönster mot cefalosporiner. Övervakning av multiresistens med β-laktamas, inklusive ESBL-, MBL- och AmpC-produktion, behövs för en rutinmässig klinisk praxis för att optimera behandlingen och förhindra ytterligare resistens mot β-laktamantibiotika13,61,62.

Stärkor och begränsningar

Detta är den första studien som utforskar AmpC β-laktamasgener (blaCITM och blaDHAM) med hjälp av både fenotypiska och molekylära test bland patienter som besöker ett tertiärt vårdcenter i Nepal. Resultaten av denna studie kan informera den antimikrobiella politiken för tertiära vårdcentraler, inklusive att förbereda hanteringen av sjukhusinfektioner, behandlingsprotokoll och diagnostiskt förfarande. Det finns några begränsningar i denna studie som inkluderar undersökning av begränsade AmpC β-laktamaser, studiens korta varaktighet och att den genomfördes på ett enda tertiärvårdscenter. Framtida studier kan bygga vidare på den för att genomföra en longitudinell studie vid flera tertiära vårdcentraler med utforskning av alla β-lactamaser som ESBL, MBL, KPC och de viktigaste generna som är ansvariga för resistens. Icke desto mindre kommer denna studie, som en första studie av sin typ med triangulering av fenotypiska och molekylära metoder, att vara en värdefull referens för framtida studier om AmpC-β-laktamaser och prevalens av blaCITM- och blaDHAM-gener i andra miljöer/sjukhus i Nepal.

Slutsats

Våra resultat visar att minskad mottaglighet för cefoxitin hos gramnegativa isolat är kopplat till förekomsten av plasmidmedierade AmpC-gener. Eftersom det saknas en enda definitiv metod föreslås det att man använder flera fenotypiska detektionsmetoder samtidigt för att exakt upptäcka AmpC β-laktamasproducerande bakterier. I denna studie upptäckte PCR nästan 90 % av AmpC β-laktamasgenerna (blaCITM och blaDHAM) bland fenotypiskt bekräftade isolat. Hög prevalens av resistenta gener och MDR bland gramnegativa isolat är ett alarmerande tecken som kräver brådskande interventionsåtgärder för att hejda tillväxten och spridningen av dessa isolat.