Kromatins tillgänglighet och arkitektur

Figur 3: Tekniker för kromosomkonformation. Olika steg i 3C, 4C, 5C, ChIA-PET och Hi-C.

Kromatinkonformationsfångst (3C)

3C använder sig av formaldehydkorsbindning för att låsa fast den tredimensionella kromatinstrukturen på plats, följt av restriktionsenzymspjälkning. De utskurna DNA-fragmenten analyseras sedan med qPCR och sekvensering för att identifiera var avlägsna DNA-regioner är sammankopplade. Denna metod för att analysera 3D-kromatinstruktur och interaktioner in vivo utvecklades för första gången 2002 (Dekker et al, 2002), och har sedan dess blivit grunden för en mängd relaterade tekniker som har utvecklats för att uppnå större skala, genomströmning eller specificitet.

Circularized chromosome conformation capture (4C)

4C gör det möjligt att identifiera tidigare okända DNA-regioner som interagerar med ett locus av intresse, vilket gör 4C idealisk för att upptäcka nya interaktioner inom en specifik region (Dekker et al, 2006).

4C tips:

• Välj rätt restriktionsenzymer. Mer frekventa skärande enzymer (dvs. fyra bp igenkänningsställen) är bättre för lokala interaktioner mellan den aktuella regionen och närliggande sekvenser på samma kromosom (van der Werken et al., 2012).
• Optimera tvärbindning. Lägre formaldehydkoncentrationer främjar oönskade självbindningar av region av intresse, men förhindrar också DNA-”hårbollar” som försvårar restriktionsenzymklippning. Höga formaldehydkoncentrationer minskar självbindningshändelserna men ökar hårbollarna. En optimal formaldehydkoncentration bör väljas för den specifika experimentella situationen för att balansera dessa överväganden. Behandling med 1 % formaldehyd i 10 minuter är en bra utgångspunkt för de flesta experiment (van der Werken et al., 2012).

Carbon copy chromosome conformation capture (5C)

5C genererar ett bibliotek av eventuella ligationsprodukter från DNA-regioner som associerar sig med mållokierna, som sedan analyseras med NGS. 5C är idealisk när stor detaljrikedom om alla interaktioner i en viss region behövs, t.ex. när en detaljerad interaktionsmatris för en viss kromosom ska diagrammeras. 5C är dock inte riktigt genomomfattande, eftersom varje 5C-primer måste designas individuellt, så den lämpar sig bäst för en specifik region (Dotsie och Dekker, 2007).

Hjälpsamma tips för 5C:

• Välj rätt restriktionsenzym. Det är viktigt att välja ett enzym som fungerar effektivt under dina specifika experimentella förhållanden. BamHI rekommenderas till exempel inte för de flesta experiment på grund av ineffektivitet under 3C-förhållanden (Dotsie et al., 2007).
• Optimera primerdesignen. 5C använder två primers: en framåtriktad 5C-primer som binder uppströms ligeringsplatsen och en omvänd primer som binder omedelbart nedströms. Primerlängden bör justeras så att annealingstemperaturen är cirka 65 °C för att primerna ska annealera exakt med sina restriktionsfragment. Se till att 5C-primrar syntetiseras med en fosfat i 5′-ändan för ligering.
• Använd en kontrollmall. Detta kommer att kontrollera skillnader i primereffektivitet. Ett kontrollbibliotek som konstruerats från hela den undersökta genomiska regionen rekommenderas. Om detta bibliotek inte konstrueras bör forskarna vara medvetna om att interaktionsfrekvenserna blir mindre exakta.

Chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing (ChIA-PET)

ChIA-PET tar aspekter av ChIP och 3C för att analysera samspelet mellan avlägsna DNA-regioner genom ett visst protein.

ChIA-PET används bäst för upptäcktsexperiment som involverar ett intressant protein och okända DNA-bindningsmål. Bindningsställen för transkriptionsfaktorer, till exempel, studeras bäst med ChIA-PET eftersom denna teknik kräver att DNA:t är bundet av transkriptionsfaktorn in vivo för att interaktionen ska kallas (Fullwood et al., 2009).

ChIA-PET användbara tips:

• Överlappa PET-taggar för att minska bakgrunden. Liksom de flesta 3C-tekniker är bakgrundsbrus en teknisk utmaning. Särskilt i ChIA-PET kan bruset göra det svårt att hitta långväga interaktioner med det intressanta lokuset. Ett användbart tips för att övervinna detta är att kräva att PET-taggar överlappar varandra i båda ändarna av regionen för att det ska vara en långväga interaktion.

ChIP-loop

ChIP-loop är en blandning av ChIP och 3C som använder antikroppar riktade mot proteiner som misstänks binda till en DNA-region av intresse. ChIP-loop är idealisk för att ta reda på om två kända DNA-regioner interagerar via ett intressant protein. ChIP-loop lämpar sig också väl för att bekräfta misstänkta interaktioner, men inte för att upptäcka nya interaktioner (Horike et al., 2005).

ChIP-loop helpful hints:

• Undvik icke-nativa slingor. Det största problemet som man stöter på med ChIP-loop är bildandet av icke-nativa slingor som bildas under DNA-koncentrationen innan ligering sker. Ett enkelt sätt att undvika detta är att välja ett protokoll som utför utfällningen efter ligeringssteget (Simons et al., 2007).
• Validera ChIP-loop interaktioner. En annan utmaning vid ChIP-slingor kan vara noggrann kvantifiering av ligeringsprodukter. 3C-tekniker, särskilt ChIP-loop, fångar ofta slumpmässiga interaktioner. För att motverka detta kan man överväga att utföra ett ChIP-experiment parallellt och använda det för att validera ChIP-loop-interaktionerna. Om en DNA-protein-DNA-interaktion som identifieras av ChIP-loop verkligen är verklig bör båda DNA-proteininteraktionerna också visas i ChIP-data (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifierar ligeringsprodukter från hela genomet och bedömer deras frekvenser med hjälp av sekvensering med hög genomströmning. Hi-C är ett utmärkt val när bred täckning av hela genomet krävs och upplösningen inte är ett stort bekymmer, till exempel vid kartläggning av de genomomfattande förändringarna i kromosomstrukturen i tumörceller (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Hi-C tips:

• Optimera biblioteksamplifieringen. Hi-C-biblioteksamplifiering måste generera tillräckligt med produkt för analys, samtidigt som PCR-artefakter undviks. För att göra detta bör PCR-cykelantalet optimeras (i intervallet 9-15 cykler). Om tillräckligt med produkt inte kan produceras (50 ng DNA) bör flera PCR-reaktioner sammanföras i stället för att cykelantalet ökas, fem reaktioner är vanligtvis tillräckliga (Belton et al., 2012).
• Balansera avläsningslängder. Som med alla sekvensexperiment är högkvalitativa avläsningar av största vikt. Läslängden måste vara optimal för att balansera behovet av långa läsningar för att kartlägga interaktioner, men inte för långa så att de passerar genom ligationsförbindelsen till partnerfragmentet. Därför är läsningar på 50 bp optimala i de flesta fall (Belton et al., 2012).
• Välj en lämplig bin-storlek. Detta är avgörande för dataanalysen. Binstorleken bör vara omvänt proportionell mot antalet förväntade interaktioner i en region. Använd mindre bins för mer frekventa intrakromosomala interaktioner och större bins för mindre frekventa interkromosomala interaktioner (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C använder en kombination av 3C- och oligonukleotidinfångningsteknik (OCT), tillsammans med sekvensering med hög genomströmning för att studera hundratals loci på en gång. Capture-C är idealisk när både hög upplösning och genomisk skala krävs. Till exempel för att analysera den funktionella effekten av varje sjukdomsassocierad SNP i genomet på den lokala kromatinstrukturen (Hughes et al., 2014).

Capture-C hjälpsamma tips:

• Välj noggrant sondpositioner. Det är bäst att placera sonder nära restriktionsenzymställena, även överlappande när det är möjligt (Hughes et al., 2014).
• Håll biblioteken komplexa. Att bibehålla bibliotekens komplexitet är högsta prioritet. Ett komplext bibliotek innebär fler högkvalitativa interaktioner i resultatet. Av denna anledning bör allt som kan minska bibliotekets komplexitet undvikas, t.ex. en Hi-C biotinfångst (Hughes et al., 2014).
• Se upp för falska interaktioner i duplicerade regioner. Kartläggningsprocessen kan stimulera starka interaktioner mellan dessa regioner (t.ex. pseudogener) som egentligen är artefakter (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y och Dekker J (2012). Hi-C: en omfattande teknik för att fånga konformationen hos genomer. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M och Kleckner N (2002). Fånga kromosomkonformationen. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). De tre ”C:na” för att fånga kromosomkonformation: kontroller, kontroller, kontroller. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J och Dekker J (2007). Kartläggning av nätverk av fysiska interaktioner mellan genomiska element med hjälp av 5C-teknik. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y och Dekker J (2007). Kromosomkonformitetsfångst med kolkopieringsteknik. Curr Protoc Mol Biol, kapitel 21, enhet 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF och Kohwi-Shigematsu T (2005). Förlust av silent-chromatin looping och försämrad imprinting av DLX5 vid Retts syndrom. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). En östrogenreceptor-alfa-bunden mänsklig kromatininteractom. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Omfattande kartläggning av långdistansinteraktioner avslöjar veckningsprinciper för det mänskliga genomet. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (augusti 2014). E-postintervju.

Hughes JR, et al. (2014). Analys av hundratals cis-regulatoriska landskap med hög upplösning i ett enda experiment med hög genomströmning. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J and de Laat W (2007). En utvärdering av 3C-baserade metoder för att fånga DNA-interaktioner. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E och de Laat W (2012). 4C-teknik: protokoll och dataanalys. Methods Enzymol, 513, 89-112

.