ISH: protokoll för in situ-hybridisering

Förvaring av prover

RNA-konservering
Konservering av RNA försvåras på grund av förekomsten av RNasenzym. Detta enzym finns på glasvaror, i reagenser och på operatörer och deras kläder. RNas förstör snabbt allt RNA i cellen eller själva RNA-sonden, så användarna måste se till att de använder sterila tekniker, handskar och lösningar för att förhindra RNas-kontaminering av sonden eller vävnads-RNA.

Allmän provförvaring vid användning av frysta snitt
För bästa resultat på äldre objektglas ska du inte förvara objektglasen torrt i rumstemperatur. Förvara dem istället i 100 % etanol vid -20 °C eller i en plastlåda täckt med saranfolie vid -20 °C eller -80 °C. Sådan förvaring bevarar objektglas i flera år.

Val av sond

RNA-sonder

RNA-sonder bör vara 250-1 500 baser långa; sonder som är ungefär 800 baser långa uppvisar den högsta känsligheten och specificiteten. Transkriptionsmallarna bör möjliggöra transkription av både sondens (antisense-sträng) och den negativa kontrollens (sense-sträng) RNA. Klona till en vektor med motsatta promotorer för att uppnå detta. Cirkulära mallar måste linjäriseras innan man gör en sond, även om PCR-mallar också kan användas.

DNA-sonder

DNA-sonder ger hög känslighet för in situ-hybridisering. De hybridiserar inte lika starkt till mRNA-molekylerna i målet jämfört med RNA-prober, så formaldehyd bör inte användas i tvättarna efter hybridiseringen.

Probespecificitet är viktig. Om den exakta nukleotidsekvensen för mRNA eller DNA i cellen är känd kan en exakt komplementär sond utformas. Om >5 % av basparen inte är komplementära kommer sonden endast att hybridisera löst med målsekvensen. Detta innebär att det är mer sannolikt att sonden tvättas bort under tvätt- och detektionsstegen och kanske inte upptäcks korrekt.

Digoxigenin (DIG)-märkt RNA-sond in situ hybridiseringsprotokoll

Detta protokoll beskriver användningen av DIG-märkta enkelsträngade RNA-sonder för att detektera uttrycket av genen av intresse i paraffinininbäddade sektioner.

1) Deparaffinering

För frusna sektioner, börja med steg 2. Om du använder formaldehydfixerade paraffininbäddade sektioner, fortsätt med detta steg.

För att fortsätta måste objektglasen deparaffiniseras och rehydreras. Ofullständig borttagning av paraffin kan orsaka dålig färgning av snittet.

Placera objektglasen i ett ställ och utför följande tvättar:

• Xylen: 2×3 min
• Xylen 1:1 med 100 % etanol: 3 min
• 100 % etanol: 2×3 min
• 95 % etanol: 3 min
• 70 % etanol: 3 min
• 50 % etanol: 3 min
• Skölj med kallt kranvatten

Var med objektglasen i kranvattnet fram till antigenhämtning. Från och med denna tidpunkt får objektglasen inte torka eftersom detta kommer att orsaka ospecifik antikroppsbindning och hög bakgrundsfärgning.

2) Antigenhämtning

Digestrera med 20 µg/mL proteinas K i förvärmd 50 mM Tris i 10-20 min vid 37 °C. Inkubationstid och koncentration av proteinas K kan kräva optimering.

Vi rekommenderar att man provar ett proteinas K-titreringsexperiment för att fastställa optimala förhållanden. Otillräcklig digestion kommer att minska hybridiseringssignalen och överdigestion kommer att resultera i dålig vävnadsmorfologi, vilket gör det mycket svårt att lokalisera hybridiseringssignalen. Den optimala koncentrationen av proteinas K kommer att variera beroende på vävnadstyp, fixeringslängd och vävnadens storlek.

3) Skölj objektglasen 5x i destillerat vatten.
4) Fördjupa objektglasen i iskall 20 % (v/v) ättiksyra i 20 sek. Detta permeabiliserar cellerna för att ge tillgång till sonden och antikroppen.
5) Dehydratisera objektglasen genom att tvätta i cirka 1 min per tvätt i 70 % etanol, 95 % etanol och 100 % etanol och sedan lufttorka.
6) Tillsätt 100 µl hybridiseringslösning till varje objektglas.

Saltlösning (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardts lösning (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polyvinylpyrrolidin)
• 10 g bovint serumalbumin (BSA)
• 500 ml sterilt dH2O

7) Inkubera objektglasen i 1 timme i en fuktad hybridiseringskammare vid önskad hybridiseringstemperatur. Typiska hybridiseringstemperaturer ligger mellan 55-62 °C.
8) Späd proberna i hybridiseringslösning i PCR-rör. Värm vid 95 °C i 2 minuter i ett PCR-block för att denaturera RNA- eller DNA-sonden. Kyl på is omedelbart för att förhindra återskapande.
9) Tappa av hybridiseringslösningen. Tillsätt 50-100 μL utspädd sond per sektion och täck hela provet. Inkubera i den befuktade hybridiseringskammaren vid 65 °C över natten. Täck provet med ett täckglas för att förhindra avdunstning.

Under detta steg kommer RNA-sonden att hybridisera med motsvarande mRNA, eller DNA-sonden kommer att hybridisera med motsvarande cellulärt DNA. Optimera hybridiseringstemperaturen beroende på den använda sondens sekvens samt cell- eller vävnadstypen. Denna temperatur bör optimeras för varje vävnadstyp som analyseras.

Optimal hybridiseringstemperatur för prober beror på den procentuella andelen baser som finns i målsekvensen. Koncentrationen av cytosin och guanin i sekvensen är viktiga faktorer.

10) Sträng tvättning

Lösningsparametrar som temperatur, salt- och detergentkoncentration kan manipuleras för att avlägsna ospecifika interaktioner.

För att bereda 1 L 20x saltlösning natriumcitrat (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g natriumcitrat
• 800 mL sterilt dH2O
• Justera till pH 5 med hjälp av citronsyra, fyll på till 1 L och autoklavera

Tvätta 1

• 50% formamid i 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Tvätta bort överflödig sond och hybridiseringsbuffert med högre temperaturer (upp till 65°C) under korta perioder. Om detta sker för länge kan detta tvätta bort för mycket av den hybridiserade sondens RNA/DNA.

Tvätt 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Detta steg avlägsnar ospecifik och/eller repetitiv DNA/RNA-hybridisering.

Följ dessa riktlinjer för att optimera temperatur och saltkoncentration för stringent tvättning:

• För mycket korta DNA/RNA-prober (0.5-3 kb) eller mycket komplexa prober bör tvätttemperaturen vara lägre (upp till 45 °C) och stränghetsgraden lägre (1-2x SSC).
• För singlelocus- eller stora prober bör temperaturen ligga runt 65 °C och stränghetsgraden vara hög (under 0,5-3 kb) och stränghetsgraden hög (under 0,5-3 kb).5x SSC).
• Temperaturen och stringensen bör vara högst för repetitiva prober (t.ex. alfa-satellitrepetitioner).

11) Tvätta två gånger i MABT (maleinsyrabuffert innehållande Tween 20) i 30 min i rumstemperatur. MABT är mildare än PBS och lämpar sig bättre för detektion av nukleinsyror.

För att förbereda 5x MABT-stock

• 58 g maleinsyra
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 ml vatten

Håller pH-värdet till 7,5 genom att tillsätta Trisbas. Cirka 100 g kommer att behövas. För in den slutliga volymen till 1 L.

12) Torka objektglasen.
13) Överför till en fuktig kammare och tillsätt 200 µl blockeringsbuffert till varje sektion (MABT + 2 % BSA, mjölk eller serum). Blockera i 1-2 timmar i rumstemperatur.
14) Tappa bort blockeringsbufferten. Tillsätt anti-märkningsantikroppen i önskad utspädning i blockeringsbufferten. Kontrollera antikroppens datablad för rekommenderad koncentration/utspädning. Inkubera i 1-2 timmar i rumstemperatur.
15) Tvätta objektglasen 5×10 min med MABT i rumstemperatur.
16) Tvätta objektglasen 2×10 min vardera i rumstemperatur med förfärgningsbuffert (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17). För fluorescensdetektering, gå vidare till steg 18. För andra former av detektion, återför objektglasen till den fuktade kammaren och följ tillverkarens anvisningar för färgutveckling.

18) Skölj objektglasen i destillerat vatten.
19) Lufttorka objektglasen i 30 minuter. Tvätta i 100 % etanol och lufttorka ordentligt.
20) Montera med DePeX-monteringslösning.