Genetik av myasthenia gravis: En fall-kontrollassociationsstudie i den grekiska befolkningen

Abstract

Myasthenia gravis (MG) är en heterogen autoimmun sjukdom som kännetecknas av produktion av autoantikroppar mot proteiner i det postsynaptiska membranet, i den neuromuskulära korsningen. De genetiska faktorernas bidrag till känsligheten för MG har utvärderats genom familje- och tvillingstudier, men den exakta genetiska bakgrunden till sjukdomen är fortfarande svårdefinierad. Vi genomförde en fall-kontrollassocieringsstudie på 101 obesläktade MG-patienter av grekiskt ursprung och 101 friska frivilliga för att bedöma om vanliga genetiska varianter är inblandade i känsligheten för MG. Vi fokuserade på tre kandidatgener som tydligt har förknippats med flera autoimmuna sjukdomar, i syfte att undersöka deras potentiella betydelse för MG:s patogenes. Dessa är interferonreglerande faktor 5 (IRF-5), TNFα-inducerat protein 3 (TNFAIP3), även känt som A20, och interleukin-10 (IL-10), nyckelmolekyler i regleringen av immunfunktionen. En statistisk tendens till association () mellan IL-10-promotorns enskilda nukleotidpolymorfismer (SNP) och undergrupperna av MG-patienter med tidig och sen debut avslöjades. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades i resten av de undersökta varianterna. Såvitt vi vet är detta det första världsomspännande försöket att ta upp det möjliga sambandet mellan gemensamma genetiska varianter av IRF-5 och TNFAIP3 och den genetiska grunden för MG.

1. Introduktion

Myasthenia gravis (MG) är en organspecifik autoimmun sjukdom som orsakas av autoantikroppar riktade mot proteiner i det postsynaptiska membranet vilket leder till försämrad neuromuskulär överföring. Kliniskt kännetecknas MG av muskelsvaghet och snabb trötthet som förvärras av träning och lindras av vila. Det viktigaste autoantigenet, hos 80-90 % av MG-patienterna, är muskelacetylkolinreceptorn (AChR), en pentamerisk kanal som förmedlar synaptisk transduktion vid den neuromuskulära korsningen . Hos flera av de återstående MG-patienterna påvisas autoantikroppar mot muskelspecifikt tyrosinkinas (MuSK) eller mot lipoproteinrelaterat protein 4 (LRP4). Både MuSK och LRP4 bildar ett receptorkomplex som binder den extracellulära matrisproteoglykanen agrin, vilket resulterar i AChR-klusterbildning, som är avgörande för den neuromuskulära korsningens funktion.

Men även om MG är en sjukdom som drabbar båda könen, i alla åldrar och hos alla raser , har bevis från flera epidemiologiska studier visat en köns- och åldersberoende bimodal fördelning av incidensen, med en topp under det andra och tredje decenniet av livet, som främst observeras hos kvinnor, och en andra topp under det sjätte och sjunde decenniet av livet, som främst förekommer hos män . Ovanstående observation ledde till en klassificering av MG i tidig debut som uppträder före 50 års ålder och vanligtvis är relaterad till thymushyperplasi och sen debut av MG (>50 år) med normal eller atrofisk thymus.

Omfattningen av det genetiska bidraget till känslighet för MG har utvärderats genom familje- och tvillingstudier , vilket återspeglar sjukdomens familjära klusterbildning och därefter den genetiska nedärvningen. Hög concordansgrad av MG som observerats bland enäggstvillingar jämfört med tvåäggstvillingar tyder starkt på att genetiska faktorer är inblandade i MG:s patogenes . Dessutom har flera studier rapporterat att MG-patienter kan drabbas av en annan autoimmun sjukdom, oftast sköldkörtelsjukdomar och reumatoid artrit . Detta leder till hypotesen att en mer generaliserad störning av den immunologiska funktionen förekommer.

Det humana leukocytantigenkomplexet (HLA-komplexet) är den framträdande genomiska region som är inblandad i MG-debut. HLA-A1- och B8-alleler för klass I och DR3 för klass II utgör en förfäders haplotyp kallad ”8.1” som reproducerbart har förknippats med tidigt insjuknande i MG och thymisk hyperplasi . Ytterligare forskning inriktad på att kartlägga denna utvidgade haplotyp A1-B8-DR3 ledde till identifiering av MYAS1-lokus, en region på 1,2 Mb som omfattar 36 gener, på gränsen mellan klass III och proximal klass I-region, vilket utesluter klass II-lokus och bekräftar den dominerande associeringen av B8-allelen framför DR3-allelen .

Avseutom HLA har ett antal HLA-oberoende genetiska loci också undersökts med avseende på deras inblandning i känslighet för MG. Dessa resultat har huvudsakligen härletts från studier av kandidatgener, medan de gener som rapporterats vara associerade eller inte associerade med MG diskuteras i detalj i .

Interferon (IFN) regulatorisk faktor 5 (IRF-5) är en medlem av IRF-familjen av transkriptionsfaktorer. IRF-5 aktiveras av IFN-α/B och uppreglerar en uppsättning proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-6, TNF-α och IL-12, samtidigt som den ytterligare inducerar IFN-genuttryck. Resultat från flera studier, som granskas i , har implicerat IRF-5 som en mottaglighetsgen för SLE. Sökning efter vanliga varianter som påverkar IRF-5-nivåerna ledde till identifiering av SNP rs10954213 (c.*555G > A), belägen inom polyA+-signalsekvensen AATAAA i 3′ UTR. G-allelen stör polyadenyleringsstället och transkriptionen avslutas långt nedströms, vilket ger längre och mindre stabila IRF-5 mRNA-transkriptioner. Vidare bestämmer en 30 bp in-frame insättnings- och borttagningsvariant (rs60344245) i det sjätte exonet av IRF-5 bildandet av två familjer av proteinisoformer som har olika förmåga att initiera transkriptionen av IRF-5-målgener .

TNFα-inducerat protein 3 (TNFAIP3), även känt som A20, är en nyckelmolekyl i den negativa återkopplingsregleringen av NF-κB-beroende reaktioner. Den hämmande effekten av TNFAIP3 på NF-κB-signalering genereras från den kooperativa aktiviteten hos dess två ubiquitinredigerande domäner: den N-terminala ovarietumördomänen (OTU), som ansvarar för deubiquitinering av receptorinteragerande protein 1 (RIP1), ett essentiellt adapterprotein i den TNF-inducerade signalvägen, och den C-terminala domänen med zinkfinger som innehåller en domän, som fungerar som ett E3-ubiquitinligas som främjar den proteasomala nedbrytningen av RIP1 .

SNP rs13207033 (g.137965418G > A), belägen vid 6q23 intergeniska regionen, cirka 185 kb uppströms TNFAIP3, påverkar troligen genuttrycket genom närvaron av potentiella regulatoriska DNA-element . En annan studie visade att en nonsynonymt kodande SNP (c.380T > G, rs2230926) som resulterar i en förändring från fenylalanin till cystein vid rest 127 (p.F127C), i OTU-domänen av TNFAIP3-proteinet, är förknippad med SLE bland individer av europeisk härkomst .

Interleukin-10 (IL-10) är ett pleiotropt cytokin som utsöndras av olika celltyper, t.ex. T-celler och myeloida linjeceller. IL-10 har karakteriserats som en antiinflammatorisk cytokin på grund av dess stimulerande effekter på TH2-celler och det samtidiga undertrycket av TH1-celler . IL-10 inducerar dessutom proliferation och differentiering av aktiverade B-lymfocyter, vilket leder till ytterligare aktivering av humoral respons. Vid experimentell autoimmun MG (EAMG) orsakade IL-10-administrering en ökning av anti-AChR-antikroppsnivåerna, vilket tyder på en sjukdomsförstärkande roll för IL-10 .

Flera varianter har noterats i den mänskliga IL-10-genens 5′ flankerande sekvens. Tre SNPs, nämligen rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C) och rs1800896 (A/G), belägna på positionerna -592, -819 respektive -1082, bestämmer bildandet av tre haplotyper (GCC, ACC och ATA). Positionen för dessa SNPs är baserad på den tidigare publicerade sekvensen U16720, deponerad i EMBL-EBI-databasen. I en studie av Turner och medarbetare rapporterades ett samband mellan dessa haplotyper och IL-10-proteinproduktion in vitro . Genotypen GCC/GCC var särskilt associerad med hög concanavalin A-inducerad IL-10-produktion, genotyperna GCC/ACC och GCC/ATA med medelhög och genotyperna ACC/ACC, ATA/ATA och ACC/ATA med låg IL-10-produktion.

I den aktuella studien antogs ett hypotesdrivet tillvägagångssätt för att bedöma inblandningen av vissa vanliga varianter i känslighet för MG. Således genomförde vi en kandidatgen fall-kontrollstudie, med fokus på gener med en kritisk roll i immunsystemets funktion, i syfte att identifiera om tidigare rapporterade associationer mellan ovanstående gener och andra autoimmuna sjukdomar skulle kunna gälla för MG.

2. Material och metoder

2.1. Studiepopulation

Totalt 101 obesläktade MG-patienter, alla av grekisk härkomst, rekryterades till denna studie. Blodprover från MG-patienter samlades in vid Hellenic Pasteur Institute under rutinmässig diagnostisk undersökning. Endast AChR-positiva MG-patienter ingick i vår studie. Diagnosen MG baserades på förekomsten av anti-AChR-antikroppar i patientens serum med hjälp av en radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA). Vi uteslöt avsiktligt från den genetiska analysen de patienter som identifierades som positiva för autoantikroppar mot MuSK, för att minska heterogeniteten i undersökningsgruppen. Även om serum från MG-patienter inte analyserades för anti-LRP4-autoantikroppar, ger avsaknaden av detta test inte upphov till någon fråga om heterogenitet i studiepopulationen, på grund av den sällsynta samexistensen av anti-LRP4- och anti-AChR-antikroppar. De viktigaste egenskaperna hos anti-AChR MG-gruppen (ålder vid debut och kön) sammanfattas i tabell 1. Patienterna gavs skriftligt informerat samtycke. Kontrollgruppen bestod av 101 etniskt och könsmatchade friska individer.

2.2. Genotypning

Genomiskt DNA från varje individ extraherades från perifert venöst blodprov med hjälp av QIAamp Blood Midi-kitet (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Polymeraskedjereaktioner (PCR) utfördes med KAPA2G Fast HotStart ReadyMix-kit (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Primersekvenser presenteras i tilläggsmaterialet som Supplementary Table 1 (se tabell 1 i Supplementary Material som finns online på http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), medan reaktionsvillkoren finns tillgängliga på begäran.

Amplifiering genom PCR och agarosgelelektroforesanalys användes för att genotypa 30 bp insättnings-/deletionsvarianten av IRF5.

PCR-baserad restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) användes för att upptäcka SNP rs2230926 (T > G) i TNFAIP3. De amplifierade fragmenten på 549 bp smältes med restriktionsenzymet Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) och analyserades sedan genom elektroforetisk separation på 2 % w/v agarosgel. G-allelen skapar en restriktionsplats för Fnu4HI, vilket resulterar i digestion av amplikoner till 319 och 230 bp fragment.

Identifieringen av IL-10-promotorns SNP-genotyper utfördes genom direkt DNA-sangersekvensering. Ett fragment på 585 bp, som innehåller alla tre varianterna, amplifierades genom PCR. PCR-produkterna renades med det kolonnbaserade PureLink PCR Purification-kitet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Sekvensen för fragmentet på 585 bp bestämdes med hjälp av BigDye Terminator chemistry v3.0-kitet på en Applied Biosystems DNA-sekvenser (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). De primers som användes var desamma som för amplifiering av denna region.

Båda SNPs, rs10954213 (A/G) i 3′ UTR av IRF5 och rs13207033 (G/A) som ligger i en intergenisk region på 6q23, genotypades genom PCR i realtid och högupplöst smältkurvanalys (HRM) på en RotorGene Q realtidscyklist (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Amplifieringen av det fragment som innehåller den aktuella SNP:n utfördes med hjälp av PCR-kitet Type-it HRM PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens anvisningar. Under HRM ökar temperaturen från 65 till 95 °C med en uppvärmningshastighet på 0,1 °C/2 sekunder, vilket leder till denaturering av PCR-produkterna och generering av smältkurvor som är karakteristiska för varje genotyp. Eftersom en förändring av ett enda baspar orsakar en betydande förskjutning av smältningstemperaturen (), baseras genotypning på analysen av smältningsprofilerna: homozygoter för A-allelen uppvisar liknande smältningsprofiler och med en lägre , jämfört med G/G-homozygoter, medan heterozygoter särskiljs genom en förändring av smältningskurvans form.

Ingen mallkontroller ingick minutiöst i alla genotypningsprocesser. Negativa och positiva kontrollprover identifierades initialt genom DNA-sekvensering och användes därefter i alla genotypningsmetoder. Varje prov testades i två exemplar, utom de som analyserades genom PCR-RFLP och DNA-sekvensering.

2.3. Statistisk analys

Underskotten i genotypfördelning och allelfrekvenser mellan fall och kontroller beräknades genom analys eller Fisher’s Exact-test. värden mindre än 0,05 betraktades som statistiskt signifikanta.

3. Resultat

Genotypfördelningar av alla varianter överensstämde med Hardy-Weinberg-jämvikt i både MG-patient- och kontrollgrupperna (data visas inte).

Allel- och genotypfrekvenserna för varianten IRF-5 rs60344245 visade en likartad fördelning i de undersökta grupperna av 101 MG-patienter och 100 kontroller (). När det gäller IRF-5 rs10954213 SNP visade sig A/G-genotypen vara något vanligare hos MG-patienter än hos kontroller (54,8 % jämfört med 45,5 %), men analysen visade ingen signifikant skillnad (). Allel- och genotypfrekvenser för båda IRF-5-varianterna visas i tabell 2.

Genotypfrekvensen för TNFAIP3 rs13207033 G/G visade en ökning hos friska kontroller (44,6 %) jämfört med MG-patienter (33,3 %). Den statistiska analysen visade dock inte på någon signifikant skillnad mellan de två grupperna (). När det gäller den kodande SNP:n rs2230926 är genotyperna fördelade på liknande sätt hos de 73 undersökta MG-patienterna och 81 kontrollerna, vilket framgår av värdet . Genotypfrekvenserna för varianten rs2230926, både hos MG-patienter och kontroller, överensstämmer med dem som härrör från prover av europeisk härstamning (CEU) som ingår i det internationella HapMap-projektet. Dessutom uppvisade vår undersökningsgrupp rs13207033-genotypfrekvenser som är jämförbara med de frekvenser som rapporterats i europeiska populationer, i dbSNP-databasen. Genotypningsresultaten för de två TNFAIP3-varianterna sammanfattas i tabell 3.

Sjukdomsdebutåldern utvärderades också genom att MG-patienter delades in i patienter med tidig och sen debut. Ingen signifikant skillnad i genotypfördelning upptäcktes mellan de två undergrupperna och kontrollgruppen (data visas inte).

DNA-sekvensanalys av IL-10-promotorregionen visade att ACC/GCC-genotypen var den mest frekventa genotypen hos både MG-patienter och kontroller (23,72 % respektive 28 %), följt av genotypen med låg sekretion ATA/ACC, som påvisades hos 21,62 % av alla MG-patienter och 18 % av kontrollerna (tabell 4). Den aktuella studien visade dock inte på någon statistiskt signifikant skillnad i fördelningen av IL-10-genotyper mellan den fullständiga kohorten av MG-patienter (dvs. total MG) och kontrollgruppen (). En jämförelse mellan undergrupperna enligt ålder vid debut visade att genotypen GCC/GCC med hög IL-10-sekretion finns i låg frekvens i MG med tidig debut (4 %), medan den är överrepresenterad i MG-fall med sen debut (20 %) (tabell 4). En statistisk tendens till association () mellan fördelningen av IL-10-fenotypen och de två undergrupperna med tidig och sen debut avslöjades (figur 1).

Figur 1

IL-10 fenotypfördelning i undergrupperna av MG-patienter med tidig och sen debut.

4. Diskussion

MG är en heterogen autoimmun sjukdom med en tydlig genetisk predisposition. Förutom HLA-loci har flera vanliga varianter i HLA-oberoende gener förknippats med känslighet för MG . Många av dessa riskassocierade gener är vitt spridda bland olika autoimmuna sjukdomar, vilket stöder uppfattningen att autoimmuna sjukdomar kännetecknas av gemensamma patogenetiska vägar. I den här studien utförde vi en fall-kontrollassocieringsstudie för att undersöka hur vanliga varianter i IRF-5-, TNFAIP3- och IL-10-generna bidrar till känsligheten för MG. Dessa gener ansågs vara bra kandidater på grund av deras kritiska roll i regleringen av immunsvaret och deras tidigare kända inblandning i den autoimmuna processen . Endast patienter med anti-AChR-antikroppar i serumet ingick i den genetiska analysen, eftersom man har förväntat sig att de representerar en mer homogen undergrupp än den bredare MG-gruppen. Denna undergrupp delades vidare in i två distinkta sjukdomsenheter: MG-patienter med tidig debut, som huvudsakligen består av kvinnor, och MG-patienter med sen debut, som uppvisar en högre andel män.

Såvitt vi vet är detta den första studien, i någon population, som undersöker sambandet mellan MG och vanliga varianter av IRF-5- och TNFAIP3-generna. Enligt tidigare studier, som granskats i , har flera varianter i IRF-5 locus reproducerbart associerats med SLE vilket implicerar IRF-5 som en mottaglighetsgen vid lupus. SNP rs10954213 har visat sig påverka mRNA-polyadenylering och därmed försämra nivåerna av IRF-5-protein; A/A-homozygoter uttrycker ungefär 5 gånger högre nivåer av immunreaktivt IRF-5 jämfört med G/G-homozygoter . När det gäller rs60344245-varianten tar bort 30 bp (GGCCGCCTACTCTGCAGCCGCCCACTCTCTGC/-) 10 aminosyror från IRF-5-proteinet och ändrar en prolin-, glutaminsyra-, serin- och threoninrik (PEST)-domän. I IRF-familjen av proteiner deltar sådana domäner i proteininteraktioner och de orsakar också snabb proteolytisk nedbrytning . Trots deras uppenbara funktionella roll lyckades den aktuella studien inte påvisa ett signifikant samband mellan IRF-5-varianterna rs10954213 och rs60344245 med MG ( respektive , ), vilket tyder på att IRF-5 kanske inte är involverad i MG-patogenesen.

Fortfarande har nyligen gjorda upptäckter från GWA-studier avslöjat signifikanta samband mellan varianter i det humana TNFAIP3-lokuset och ett brett spektrum av autoimmuna sjukdomar. En GWA-undersökning av patienter med reumatoid artrit, med antikitrullinerade peptidantikroppar, upptäckte starka bevis för att rs13207033 SNP är associerad med utvecklingen av RA . På samma sätt rapporterade Musone och medarbetare i en studie att den nonsynonyma kodande SNP:n rs2230926 är associerad med SLE . Funktionella studier för att fastställa den biologiska effekten av rs2230926 visade att det mindre Cys127-proteinet uppvisar en minskad hämmande aktivitet . Dock observerades ingen association mellan MG och TNFAIP3 rs13207033 () och rs2230926 () SNPs.

Tillsammans kan våra data tyda på att den organspecifika MG kan ha en annan genetisk bakgrund som leder till att den separeras från ett brett kluster av systemiska autoimmuna sjukdomar som omfattar SLE och RA . En alternativ förklaring till bristen på association i vår studie kan vara relaterad till den otillräckliga statistiska styrkan på grund av de relativt små urvalsstorlekarna. Som det är allmänt känt står vanliga varianter för en blygsam del av den genetiska risken för autoimmuna sjukdomar. I sådana fall kan det krävas tusentals prover för att upptäcka en associationssignal som kan särskiljas från bakgrundsbruset . När det gäller sjukdomar med låg prevalens, som MG, är det emellertid mycket svårt att rekrytera stora provstorlekar. Det är värt att nämna att den diagnostiska enheten för MG vid Hellenic Pasteur Institute är den enda enheten i Grekland som systematiskt har tagit emot och analyserat blodprover sedan 1983. Därför är vår samling av DNA-prover från MG för närvarande den största i Grekland och den berikas ständigt av nya fall.

Trots det specifika urvalet av anti-ACHR-patienter och deras indelning i tidig och sen debut kunde dessutom en ytterligare klassificering enligt thymusanomalier (thymom eller hyperplasi) ha varit informativ; histologiska data var dock inte tillgängliga.

Enligt ett oväntat resultat var avsaknaden av samband mellan IL-10-promotor-SNPs och MG. Eftersom dessa varianter antas ligga inom IL-10-promotorregionen kan de påverka bindningen av transkriptionsfaktorer som reglerar IL-10-uttrycket. En nyligen genomförd studie av Alseth och medarbetare på den norska befolkningen visade att ACC/ACC-genotypen var associerad med undergruppen titinantikroppspositiva MG-patienter, medan en statistiskt signifikant ökad ATA/ATA-frekvens observerades hos MG-patienter med tidig debut. I vår grupp av grekiska MG-fall upptäcktes inga tecken på samband när vi jämförde genotypfördelningen mellan hela kohorten av MG-patienter och kontrollgruppen (). GCC/GCC-genotypen uppvisade dock en statistisk tendens till samband med MG i de olika undergrupperna av MG-patienter med tidig och sen debut (). Ytterligare studier med större urval skulle därför kunna avslöja eventuella samband mellan MG och IL-10. Det är också värt att notera att allelfrekvenser för en viss SNP kan variera avsevärt mellan etniska grupper. Den skillnad som noterades i frekvensen av ACC/ACC-genotypen mellan de norska och grekiska kontrollgrupperna (3,4 % jämfört med 15 %) återspeglar detta förhållande.

Sammantaget har detta varit det första försöket, såvitt vi vet, att ta upp det möjliga sambandet mellan vanliga genetiska varianter av IRF-5 och TNFAIP3 och den genetiska grunden för MG, i någon population, medan ytterligare studier behövs för att avslöja den, ännu till stor del okända, genetiska bakgrunden till MG.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot MG-patienter och frivilliga som deltog i vår studie. Anna Kokla och Maria Belimezi från Hellenic Pasteur Institute tackas för deras hjälp med insamling av MG-patientprover. Denna studie har fått ekonomiskt stöd från Europeiska kommissionen genom bidrag från Fight MG till S. J. Tzartos och GEN2PHEN (FP7-200754) till G. P. Patrinos, med deltagande av medel från Thales-projektet (Autoimmunitet) till S. J. Tzartos och K. Poulas och Hellas/Turkiet Bilateral Collaboration-projektet (MuSK-myasthenia gravis) till K. Poulas.

Supplementary Materials

Det kompletterande materialet inkluderar Supplementary Table 1 som ger information om primers för PCR-amplifiering av varje variant och dess flankerande sekvens.

1. Supplementary Table

.