Fysikalisk-kemiska egenskaper hos lecitinbaserade nanoemulsioner som erhålls genom spontan emulgering eller högtryckshomogenisering

ARTIGO

Fysikalisk-kemiska egenskaper hos lecitinbaserade nanoemulsioner som erhålls genom spontan emulgering eller högtryckshomogenisering

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nanoemulsioner som består av en medelkedjig triglyceridoljekärna stabiliserad med raps- eller solroslecitiner framställdes genom spontan emulgering och homogenisering under högt tryck. Dessa nanoemulsioner jämförs med formuleringar som stabiliserats med ägglecitin. Nanoemulsioner som erhållits genom högtryckshomogenisering uppvisar större droppstorlek (230-440 nm) jämfört med de som erhållits genom spontan emulgering (190-310 nm). Emulsionernas zeta-potential var negativ och låg under -25 mV. Zeta-potentialinversionen inträffade mellan pH 3,0 och 4,0. Resultaten visar att det är möjligt att framställa lipidemulsioner som innehåller raps- eller solroslecitiner genom spontan emulgering och högtryckshomogenisering.

Nyckelord: nanoemulsion; lecitin; parenteralt; högtryckshomogenisering; spontan emulgering.

INLEDNING

En parenteral nutritionsregim består i princip av makronäringsämnen (aminosyror, kolhydrater och lipider) och mikronäringsämnen (vitaminer, elektrolyter och mikroelement), på recept av en läkare beroende på patientens tillstånd, ålder och vikt1. Lipidmakronäringsämnena, som administreras som emulsioner, är energidonatorer, leverantörer av essentiella fettsyror och bärare av fettlösliga vitaminer. De fettsyror som ingår i dessa formuleringar har stor metabolisk betydelse, eftersom de är cellmembrankomponenter och spelar specifika roller i hormonell signalering och transport. Dessutom är de föregångare till prostaglandiner, leukotriener, tromboxaner och prostacykliner, som modulerar inflammatoriska processer, njurfunktion och trombocytaggregation.2 Brist på essentiella fettsyror hos för tidigt födda barn under hjärnans utveckling leder till inlärningsproblem och nedsatt synfunktion, vilket kan vara irreversibelt, även om en adekvat fettsyrahaltig kost ges senare under utvecklingen.2

Parenterala lipidemulsioner är heterogena system som består av en oljig fas som är homogent dispergerad i en vattenfas (dispergeringsmedel) genom närvaro av ett emulgeringsmedel. En liten droppstorlek, vanligen mellan 200 och 500 nm, kännetecknar formuleringarna, på grund av risken för embolism vid användning av större partiklar. Emulsionerna måste också uppvisa ett fysiologiskt kompatibelt pH (omkring 7), isotonicitet, låg viskositet och en hög zeta-potential (i modul), för att förhindra förekomsten av instabilitetsfenomen.3

Lipidnanoemulsioner används vanligen i blandningar för total parenteral näring, så kallade 3-i-1-system, där alla makro- och mikronäringsämnen tillsätts till en påse av etylvinylacetat (EVA). Dessa blandningar uppvisar dock en viss fysisk instabilitet på grund av närvaron av elektrolyter och andra komponenter som kan fällas ut eller interagera med emulsionsdropparna. I litteraturen rapporteras ofta om utfällning av kalcium och fosfat. Tvåvärda joner (t.ex. kalcium och magnesium) kan dessutom störa emulsionens zeta-potential och leda till aggregering/flockulering av lipiddropparna, följt av koalescens. Detta fenomen är mycket allvarligt, eftersom varje droppe med en diameter över 5 µm som kommer in i blodomloppet kan orsaka en fettemboli.4,5

Fysikaliska egenskaper och följaktligen stabilitet hos lipidemulsioner är starkt relaterade till deras tillverkningsmetod och sammansättning.3,6 Tillverkningsmetoderna är varierande och kan kräva mer än ett steg för att framställa en emulsion med en minskad droppstorlek. En höghastighetshomogenisator (Ultraturrax®) kan till exempel först skapa en grov emulsion. En minskning av droppstorleken kan sedan uppnås genom högtryckshomogenisering, mikrofluidisering eller ultraljud.7-9 Bland de metoder som inte kräver förbehandling finns spontan emulgering, som främst används i formuleringsstudier och som är lätt att utföra i laboratorieskala, eftersom det inte är nödvändigt att använda sofistikerad utrustning.10

Tabell 1 visar sammansättningen av typiska, kommersiellt tillgängliga, intravenösa lipidemulsioner. Förutom de beskrivna komponenterna måste formuleringarna uppfylla kraven för injicerbara produkter.11

Den oljiga fasen i parenterala emulsioner består av långkedjiga triglycerider (LCT), som kan kombineras med medelkedjiga trigylcerider (MCT), enligt tabell 1. LCT består av en mängd olika oljor, t.ex. solrosolja, ricinolja, olivolja eller, vanligare, sojabönolja. Alla dessa oljor innehåller fettsyrekedjor som är längre än 12 kolväten. MCT erhålls genom förestring av kokosoljefettsyror. De emulgeringsmedel som väljs för stabilisering av injektionsemulsioner är lecitiner, eftersom de är biokompatibla och biologiskt nedbrytbara. Lecitiner är naturliga blandningar av polära och neutrala fosfolipider som erhålls från animaliska eller vegetabiliska källor.12 Fosfolipidsammansättningen i lecitiner från vegetabiliska källor kan variera på grund av extraktion, gröda och andra bearbetningsförhållanden.13 De innehåller huvudsakligen amfotera fosfolipider, såsom fosfatidylkolin och fosfatidyletanolamin, men negativa fosfolipider kan också förekomma.

Kommersiellt tillgängliga lipidemulsioner för parenteral nutrition består oftast av lecitin från äggula eller, i sällsynta fall, lecitin från sojabönor (Solipid® E&S). Trots de många fördelarna med fetttillskott finns det rapporter om negativa kliniska effekter i samband med långtidstillskott, på grund av metabola begränsningar och immunreaktioner hos kritiskt sjuka patienter.14,15 Negativa reaktioner på parenterala lipidemulsioner rapporteras vara relaterade till närvaron av sojabönor och äggullegelektin16-18 . Interaktioner mellan läkemedel och matallergier kan leda till en rad negativa reaktioner, från gastrointestinala störningar till anafylaxi.19

I detta sammanhang fortsätter sökandet efter alternativa råvaror för att hitta hypoallergena substitut som är säkrare för parenteral administrering till patienter. I detta arbete prioriteras sökandet efter olika lecitiner i syfte att hitta nya alternativ för lipidemulsioner avsedda för parenteral nutrition, eller till och med som läkemedelsbärare, för att tillhandahålla de säkraste alternativen för patienter (särskilt för tidigt födda barn) med överkänslighet mot emulgeringsmedel baserade på ägg eller sojabönor. Vi försökte utveckla parenterala lipidnanoemulsioner som stabiliserades med raps- eller solroslecitiner och jämförde dessa med nanoemulsioner som innehöll ägglecitin. Dessutom jämfördes framställningen genom spontan emulgering med högtryckshomogenisering, som vanligen används för industriell framställning av parenterala lipidemulsioner.

MATERIALER OCH METODER

Kemikalier och reagenser

MCT, sojabönolja och äggula (Lipoid E80®), raps- (Lipoid R100®) och solroslecitiner (Lipoid H100®) erhölls från Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Tyskland), som vänligen donerade raps- och solroslecitinerna. Glycerol och etanol kom från Merck (Brasilien) respektive Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ultrarent vatten erhölls från en Milli-Q®-apparat (Millipore, Billerica, USA).

Förberedelse av nanoemulsioner

Lipidemulsioner framställdes i tre exemplar genom två metoder: spontan emulgering och högtryckshomogenisering. De formuleringar som erhölls genom spontan emulgering framställdes enligt en tidigare beskriven procedur.10,20 Kortfattat blandades sojabönolja med MCT, lecitin och etanol. Glycerol löstes i vatten, till vilket etanolfasen sakta tillsattes under måttlig magnetisk omrörning i 30 minuter. Lösningsmedlet avlägsnades sedan genom destillation under reducerat tryck i en roterande förångare. De formuleringar som erhållits genom högtryckshomogenisering framställdes enligt tidigare beskrivning.21 Först dispergerades lecitin i vatten innehållande glycerol och blandades under magnetisk omrörning vid 40 ºC tills en homogen vattenfas erhölls. Oljefasen bestod av sojaolja och MCT. Både olje- och vattenfasen blandades under magnetisk omrörning (15 minuter i rumstemperatur) för att få en grov emulsion. De grova emulsionerna blandades sedan vid 9500 rpm i 2 minuter med hjälp av en IKA® Ultra-Turrax T8-mixer (IKA® Works Inc., NC, USA) för att bilda rå föremulsioner, som var för sig utsattes för högtryckshomogenisering (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Kanada) vid 750 bar (10 000 psi) i 10 cykler för att producera den slutliga emulsionen. pH-värdet i alla formuleringar justerades till 8,0 med 0,01 mol L-1 NaOH-lösning. Emulsionerna förvarades vid 4 ºC. Formuleringarna och deras beståndsdelar anges i tabell 2.

Fysikalisk-kemisk karakterisering av nanoemulsioner

Formuleringarnas pH-värden bestämdes direkt i proverna strax efter beredningen med hjälp av en kalibrerad potentiometer (Digimed, São Paulo, Brasilien) vid rumstemperatur. Den genomsnittliga droppstorleken och polydispersitetsindexet mättes med hjälp av fotokorrelationsspektroskopi (PCS) och zeta-potentialen bestämdes med hjälp av elektroforetisk rörlighet, med hjälp av en Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, Storbritannien) vid 25 ºC. För dessa mätningar späddes nanoemulsionerna i 1 mmol L-1 NaCl-lösning i pH-området från 2,0 till 8,0 enheter. Viskositeten utvärderades med hjälp av kapillärviskosimetri vid 25 ºC (viskometerns konstant k = 0,0212), vid 25 ± 0,1 ºC. Tiden i sekunder registrerades för vätskan att rinna från den övre till den nedre markeringen i ett kapillärrör. Alla formuleringar analyserades i tre exemplar.

Morfologisk analys

Den morfologiska undersökningen utfördes med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM). En droppe av nanoemulsionen placerades på ett kolbelagt koppargaller (200 mesh), negativfärgades med en 2,0 % uranylacetatlösning och lämnades att torka i 24 timmar före undersökning. Ett JEM-1200 EXII-instrument (JEOL, Tokio, Japan), som arbetar vid 80 kV, användes.

RESULTAT OCH DISKUSSION

I den här studien utvecklar vi lipidemulsioner som är avsedda för parenteral nutrition eller läkemedelsbäring, som stabiliseras av två lecitiner som erhålls från vegetabiliska källor (raps (R) och solros (S)), som alternativ till ägguljelecitin (E), ett traditionellt stabiliseringsmedel för parenterala emulsioner. För att jämföra de nya formuleringarna med traditionella formuleringar hölls alla andra emulsionskomponenter i liknande koncentrationer som i de kommersiella lipidemulsionsprodukterna. I detta arbete jämförs också två olika produktionsmetoder: spontan emulgering och högtryckshomogenisering.

Tabell 3 visar de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de resulterande nanoemulsionerna. De formuleringar som erhållits genom spontan emulgering uppvisar en genomsnittlig droppstorlek från 220 till 300 nm, enligt PCS. I teorin är detta ett område med hög emulsionsstabilitet.11,22,23 När droppstorleken minskar ökar självdiffusionshastigheten till en punkt där mycket små droppar kan hindras från att grädda genom diffusionsblandning.7,23 Nanoemulsioner som innehåller raps- eller solroslecitin uppvisar en mindre genomsnittlig droppstorlek jämfört med dem som innehåller ägguljelecitin. Liknande resultat har beskrivits för nanoemulsioner som erhållits med samma metod, som enbart består av MCT, som oljefas, och som stabiliserats med 2 % (m/m) ägglecitin.24 Baserat på dessa data skulle man kunna dra slutsatsen att en koncentration på 1,2 % skulle vara tillräcklig för att emulgera blandningen av sojabönolja, MCT och vatten. Även om en liten droppstorlek och ett lågt polydispersitetsindex erhölls förblev emulsionerna dock inte fysiskt stabila i mer än en vecka efter beredningen, varefter fasseparation (koalescens) kunde observeras visuellt. Koalescensprocessen är ett irreversibelt instabilitetsfenomen, eftersom oljedropparna förlorar sina gränsytor och smälter samman till större droppar.25

Nanoemulsionernas kvalitativa och kvantitativa sammansättning kan, förutom typen av emulgeringsmedel och emulgeringsmetod, direkt påverka droppstorleken.7,23 En andra metod testades därför för beredning av nanoemulsioner. Högtryckshomogenisering är vanligt förekommande inom läkemedelsindustrin för framställning av sådana formuleringar, dock i industriell skala. Bland de olika metoder som finns tillgängliga för emulgering är denna metod att föredra på grund av dess effektiva upplösning av droppar. Detta är en högenergimetod, där storleksreduktion uppnås genom att en grov emulsion tvingas under högt tryck genom en homogeniseringsventil, vilket deformerar och minskar droppstorleken.26 Spontan emulgering är en billig, enkel och tillförlitlig metod, och den används vanligtvis i experimentella studier i stället för en högtryckshomogenisator, som är mycket mer komplex och dyr.

Som framgår av tabell 3 gav högtryckshomogenisering större droppstorlekar i nanoemulsioner som innehöll raps- (296 ± 18 nm) eller solroslecitin (417 ± 25 nm), i jämförelse med den tidigare metoden och i förhållande till kontrollemulsionerna av ägg-lecitin (243 ± 12 nm). Det måste dock påpekas att även om högtryckshomogeniseringen var mindre effektiv när det gäller upplösning av dropparna, gav den formuleringarna större stabilitet. Till skillnad från de emulsioner som erhållits genom spontan emulgering var dessa visuellt stabila i minst 30 dagar. Dessa resultat bekräftar preparationsmetodens betydelse för att ge emulsionsstabilitet.

Med tanke på intravenösa tillämpningar kan storleksfördelningen av dropparna i lipidemulsioner vara ännu viktigare än den genomsnittliga droppstorleken. En liten population av stora oljedroppar kan vara tillräcklig för att orsaka en fettemboli hos patienter.4,5 Droppstorleksfördelningarna för de framställda formuleringarna presenteras i figur 1.

I figur 1 observeras två populationer i formuleringar som består av rapslecitin (som erhålls genom spontan emulgering, figur 1C) och solroslecitin (som erhålls antingen genom spontan emulgering eller genom högtryckshomogenisering, figurerna 1E och 1F). Som ett resultat erhålls ett polydispersitetsindex högre än 0,20 för dessa formuleringar.

Stabiliteten hos emulsioner kan korreleras med sammansättningen och egenskaperna hos deras gränsskiktsfilm (lecitin), eftersom denna bestämmer formuleringarnas zeta-potential och repulsionen mellan dropparna, vilket är en av mekanismerna för emulsionsstabilisering.27 Lecitin är en heterogen blandning av fosfolipider; Dess heterogenitet är mycket fördelaktig på grund av gränssnittsfilmens flytande karaktär jämfört med en ren fosfolipid.28 De viktigaste fosfolipiderna i lecitinblandningar är fosfatidylkolin och fosfatidyletanolamin, som är oladdade vid fysiologiskt pH (7,4). Mindre mängder sura lipider, såsom fosfatidylinositol, fosfatidylserin och fosfatidylglycerol, kan också förekomma. Dessa lipider joniseras vid pH 7,0 och ger emulsionsdropparna en negativ ytladdning, vilket bidrar till deras stabilitet. Varje tillsatt ämne som stör denna laddning kommer sannolikt att förändra systemets stabilitet.29 Även om lecitin av parenteral kvalitet är höggradigt renat innehåller det fortfarande en liten mängd andra fosfolipider, vilket framgår av tabell 4, som beskriver sammansättningen av de tre lecitinråvaror som användes i denna studie.

Som framgår av tabell 3 observeras en mindre zeta-potential (modulvärde) för nanoemulsioner som är sammansatta av raps- eller solroslecitin och som erhålls genom spontan emulgering. Däremot observeras inga skillnader i zeta-potentialen för nanoemulsioner som framställts genom högtryckshomogenisering. Dessa resultat tyder på att den viktigaste faktorn som påverkar zeta-potentialen är framställningsmetoden. Även om vår grupp har optimerat båda metoderna måste de experimentella förhållandena vanligtvis justeras med hänsyn till sammansättningen av formuleringarna. Parametrar som antalet cykler och tryck kan modifieras för att få önskade fysikalisk-kemiska egenskaper hos de slutliga formuleringarna.30,31

Zetapotentialen hos nanoemulsioner beror också på joniseringen av emulgeringsmedlet. En minskning av den resulterande laddningen (i modul) från 40 mV till mindre än 25 mV kan öka flocknings- och koagulationshastigheten.32 Zeta-potentialen och den genomsnittliga droppstorleken hos nanoemulsioner som är sammansatta av olika lecitiner och framställda med olika emulgeringsmetoder utvärderades vid i pH-området från 2,0 till 8,0. Resultaten presenteras i figur 2.

Oberfläckeladdningen för alla formuleringar sjunker till noll mellan pH 3,0 och 4,0, vilket tidigare observerats för Intralipid®, en ägglecitinstabiliserad triglyceridemulsion.25 Zeta-potentialen beror på pH, eftersom H+ är en potentialbestämmande jon på fosfolipidytorna, med ett isoelektriskt pH på 3,1.33 En sänkning av pH resulterar i en minskad (mindre negativ) zeta-potential och en snabbare flockningshastighet.34 Den genomsnittliga droppstorleken uppvisar en liten ökning vid pH-värdet för zeta-potentialinversion. Av figur 3 kan man dra slutsatsen att pH i nanoemulsioner helst bör vara högre än 7,0, eftersom en platå uppnås vid det pH-värdet, där maximal avstötning mellan oljedropparna observeras.

Finalt undersöktes morfologin hos oljedropparna i de nanoemulsioner som framställts genom högtryckshomogenisering med TEM. Figur 3 avslöjar homogena och sfäriska partiklar, vilket visar att emulsionsdropparna har en genomsnittlig droppstorlek i nanometerområdet. Dessa resultat bekräftar den tidigare analysen av droppstorleken.

Nanoemulsioner är lågviskösa system med newtonskt beteende. Utvärdering av emulsionens viskositet är avgörande, eftersom intravenös administrering av emulsioner med hög viskositet kan vara mycket smärtsamt för patienten.23,32 Nanoemulsioner som består av olika lecitiner visar liknande viskositeter. Som väntat observeras inget samband mellan den genomsnittliga droppstorleken och nanoemulsionernas viskositet, eftersom alla formuleringar innehöll endast 10 % oljekärna.35 Däremot observeras vissa skillnader i viskositet för formuleringar som erhållits med de olika beredningsmetoderna: spontan emulgering gav något mer viskösa emulsioner.

Det är värt att nämna att kompositionerna av de nanoemulsioner som studerats i det här arbetet är baserade på kompositionerna av kommersiella nanoemulsioner som använder ägglecitin som emulgeringsmedel. Användningen av ett annat emulgeringsmedel kan kräva en optimering av dess koncentration och/eller emulgeringsförhållanden. Kommersiella injicerbara nanoemulsioner som består av lecitin från sojabönor (Solipid®) kräver t.ex. en koncentration av emulgeringsmedlet på 1,5 %. Ibland används ytterligare samemulgeringsmedel för att stabilisera emulsionerna och främja mindre polydispersitet och mindre droppar. De används dock endast i lipidemulsioner som läkemedelsbärare, eftersom små mängder av formuleringarna administreras för detta ändamål. Coemulgeringsmedel används inte ofta i emulsioner för parenteral nutrition på grund av de stora volymerna av dessa formuleringar som administreras och säkerhetsproblem, särskilt när det gäller för tidigt födda barn. Natriumoleat används vanligen för att stabilisera formuleringar av injicerbara lipidemulsioner,36 och fungerar som ett anjoniskt ytaktivt medel och lösningsmedel.27

KONKLUSIONER

Resultaten visar att det är möjligt att framställa injicerbara lipidemulsioner som består av raps- eller solroslecitiner genom spontan emulgering och homogenisering under högt tryck, som alternativ till traditionella nanoemulsioner av ägg- lecitin för patienter som är känsliga för äggderivat. Ytterligare studier bör genomföras för att optimera emulgeringsförhållandena för att förbättra formuleringarnas långtidsstabilitet.

ÅTERKÄNNANDE

Författarna vill tacka Nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling (CNPq) för finansiellt stöd och Lipoid GmbH för det tillhandahållna materialet.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1st ed., Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, kap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Food Emulsifiers: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. 10.

13. Schneider, M. I Lecithiner: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, vol. 3, chap. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, kap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria e Prática na indústria farmacêutica; 3rd ed., Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf, B 2006,51,54.

Received 03/02/2014; accepted 17/04/2014; published on the web 15/07/2014