Enterokocker

2.4.3.2 Hydrolytiska aktiviteter hos enterokocker

Enterokocker är kända för att producera tre typer av enzymer som bidrar till deras opportunistiska patogenicitet: hyaluronidas, gelatinas och serinproteas . Hyaluronidaset, som kodas av den kromosomala genen hyl, bryter ned huvudbeståndsdelen i värdcellernas extracellulära matris, hyaluronsyra, vilket underlättar vävnadsinvasion och spridning av toxiner .

Gelatinas, som kodas av den kromosomala genen gelE, är ett zinkmetalloproteas som är verksamt på gelatin, men också på kollagen, kasein, hemoglobin, β-insulin och andra biologiskt aktiva peptider . Detta enzym bidrar också till processen för biofilmsbildning, vilket kan underlätta vävnadskolonisering och persistens på infektionsställen , . Serinproteaset, som kodas av genen sprE, som ligger uppströms från gelE och samtranskriberas med den sistnämnda, deltar också i patogenesen genom att det bryter ner värdvävnader .

Enterokocker bidrar till utvecklingen av ostsmaker under mognadslagring på grund av deras proteolytiska och lipolytiska aktiviteter och deras förmåga att producera flyktiga eller långkedjiga fettsyror, diacetyl, acetoin och andra flyktiga föreningar . Enligt , är E. faecium involverad i utvecklingen av smak, arom, färg och textur. Det bidrar därför till den övergripande sensoriska profilen hos vissa ostar. Dessa egenskaper gör också att den är en lämplig flora för andra fermenterade produkter, t.ex. grönsaker eller kött.

Men medan mjölksyrabakteriernas proteolytiska verksamhet är väl beskriven i litteraturen om fermenterade produkter, är enterokockernas verksamhet mindre välkänd. De är ganska låga i mejeriprodukter, med undantag för vissa stammar av E. faecalis . Enligt , inom detta släkte beror nivån på den proteolytiska aktiviteten på arten och på stammen inom samma art. De bäst beskrivna proteaserna kan hydrolysa kasein men även β-laktoglobulin och α-laktalbumin . Många studier visar att ostar som framställts av mjölk som inokulerats med E. faecalis har högre proteolytisk aktivitet än ostar som framställts utan dessa enzymer. Arbete med tillväxt av 24 stammar av E. faecium och 60 stammar av E. faecalis i skummjölk vid 37 °C visar att den proteolytiska aktiviteten hos E. faecalis är mycket högre än hos E. faecium. Dessa resultat bekräftas av och av i mejeriprodukter och av på enterokocker som isolerats från pastöriserade flytande helägg och som är ansvariga för att de förstörs.

Den efterföljande nedbrytningen av aminosyror anses ha stor betydelse för utvecklingen av ostarnas arom. Proteolytiska aktiviteter kan också vara ansvariga för bildandet av biogena aminer av enterokocker från de aminosyror som de (eller andra bakterietyper) har frigjort . Figur 2.6 visar de olika biogena aminer som potentiellt kan bildas i livsmedel som förstörs.

Figur 2.6. Bildning av biogena aminer i livsmedelsmatriser som svar på mikrobiologiska metaboliska aktiviteter. De grå pilarna representerar de dekarboxyleringsreaktioner som direkt leder till bildning av biogena aminer, de streckade linjerna anger de biogena aminer som produceras via metaboliska vägar som skiljer sig från de enstegsdekarboxyleringsreaktionerna.

(Figur hämtad från , anpassad enligt )

Histamin, tyramin, fenyletylamin och kadaverin framställs genom en enstegsdekarboxyleringsreaktion från deras respektive prekursorer histidin, tyrosin, fenylalanin och lysin. Produktionen av dessa biogena aminer, följt av deras utsöndring, kräver 1) aktiva transportsystem för prekursoraminosyrorna, 2) dekarboxyleringar och 3) system för utsöndring av aminer till följd av dessa dekarboxyleringar. Transporten inbegriper i allmänhet ett protein som byter ut prekursoraminosyran mot den amin som uppstår vid dess dekarboxylering. I cellen genomgår aminosyran en dekarboxylering som katalyseras av ett specifikt dekarboxylas (karboxylyaser EC 4.1.1.1.1.) i närvaro av pyridoxalfosfat. De mest studerade dekarboxylaserna är histidin-dekarboxylas (HDC), tyrosin-dekarboxylas (TDC) och lysin-dekarboxylas (LDC), som kodas av generna hdcA, tdcA respektive cadA. De organiseras senare i operoner med andra gener som är involverade i andra stadier av produktionsprocessen av biogena aminer, t.ex. transport och mognad. Specificiteten hos dessa dekarboxylaser har länge diskuterats och det är nu väl etablerat att ett dekarboxylas kan dekarboxylera flera substrat. Enterococcus TDC kan till exempel dekarboxylera fenylalanin och tyrosin för att producera fenyletylamin respektive tyramin . Putrescin, agmatin, spermidin och spermine syntetiseras genom olika vägar som katalyseras av grupper av gener som kan vara specifika för arten eller stammen eftersom de potentiellt kan förvärvas genom horisontell överföring .

Enterokocker beskrivs som kapabla att orsaka dekarboxylasaktiviteter som ansvarar för produktionen av biogena aminer i fermenterade livsmedel. De anses till och med ha de starkaste tyrosin- och fenylalanindekarboxylasaktiviteterna i bakterievärlden . Mjölksyrabakterier i den endogena floran i fermenterat kött, t.ex. korv, anses vara de största tyraminproducenterna . Ost och vissa köttprodukter kan vara lämpliga substrat för produktion av 2-fenyletylamin, tyramin, histidin eller andra aminer. Dessa stammar har därför gener eller operoner som kodar för dekarboxylaser eller andra enzymer som är involverade i syntesen av biogena aminer eller i deras katabolism . När det gäller fisk- och skaldjursprodukter kan inte enterokocker tillskrivas syntesen av biogena aminer . Även om värmebeständiga bakterier som enterokocker, som är de viktigaste bakterierna som är inblandade i produktionen av biogena aminer i mejeriprodukter, endast delvis elimineras genom pastörisering, minskar värmebehandling nivån av biogena aminer. Detta fenomen kan bero på att kontamineringsnivån i livsmedlet minskar och/eller på att en viktig kofaktor för dekarboxylering har denaturerats genom pastörisering .

Men även om mjölksyrabakterier inte är särskilt aktiva mot lipider är de kända för att delta i smaksättningen av ost, antingen genom omvandling av kortkedjiga fettsyror till ketoner eller metylerade laktoner, eller genom bildning av aldehyder som härrör från oxidation av omättade fettsyror och som är ansvariga för utvecklingen av härskande lukter och smaker, antingen genom solvens av aromatiska föreningar som produceras från lipider, men också från proteiner och laktos . Enligt , och , har enterokocker esterasaktiviteter som ofta är starkare än andra mjölksyrabakterier. Bland enterokockerna är dessa aktiviteter också varierande och forskning visar att de är starkare hos E. faecalis än hos E. faecium. Andra studier visar att den lipolytiska aktiviteten hos enterokocker varierar inte beroende på art, utan på vilken typ av ost som stammen kommer från.

Redan 1965 visade man på esterasaktiviteter hos E. faecalis- och E. faeciumstammar. Visar att enterokocker var mer aktiva på triglycerider än Streptococcus-stammar och att hydrolyshastigheten minskade med ökande kolkedjelängd hos de frigjorda fettsyrorna (tripropionin > tributyrin > tricaprin > tricaprylin). De framhåller bristen på aktivitet på triolein. visar att enterokocker uppvisar låg lipolytisk aktivitet när de placeras i ett tillväxtmedium som innehåller helmjölk. Arbetet visar att tributyrinhydrolys uttryckt av E. faecium och E. faecal isoleras från ost, men att dessa stammar inte är aktiva på mjölkfetter. visar att ett lipas från E. faecalis också är mer aktivt på tributyrin än på tricaproin, tricaprylin och triolein. Enligt , varierar dock enterokockernas förmåga att hydrolysa mjölkfetter mycket från en stam till en annan. Vissa stammar uppvisar ingen lipolytisk aktivitet medan andra uppvisar hög aktivitet på ett brett spektrum av fettsyror. Arbete som utförts av , på syntetiska substrat (4-nitrofenyl-acyls) visar att E. faecium är aktivt på fettsyror med en kedjelängd på mellan 2 och 18 kolhydrater. I senare studier visar samma författare att ett intracellulärt esteras från E. faecium in vitro utvecklar en aktivitet på 4-nitrofenylacylsyror med en kedjelängd på mellan 2 och 12 karboner, med ett optimum i närvaro av 4-nitrofenylbutyrat (C2) . Arbetet visar att majoriteten av de testade enterokockstammarna (90 %, N = 129) kan hydrolysa homogena triglycerider som innehåller fettsyror med en kedjelängd på mellan 4 och 18 kolhydrater, med en aktivitet som minskar med ökande kolkedjelängd. Alla testade stammar (100 %) i samma studie visar en aktivitet på de syntetiska substraten, från 4-nitrofenylacetat (C2) till 4-nitrofenylstearat (C18), där aktiviteten också minskar med ökad längd på kolkedjan för fettsyra.

Av de få publicerade studierna om hydrolytiska aktiviteter som kan vara inblandade i fördärvningen av äggprodukter finns de som visar lipolytiska aktiviteter som uttrycks av stammarna E. faecium och i synnerhet E. faecalis som isolerats från fördärvade pastöriserade flytande heläggsprodukter. Arbetet visar att lipasaktivitet också påvisas för hälften av de Enterococcus-stammar som härrör från industriell äggvita och som testats med avseende på deras förmåga att förstöra en av huvudkomponenterna i efterrätter från flytande öar, nämligen vaniljkräm.