Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

Sporrhöljen består av protein, har ordnade matriser av protomeriska subenheter, uppvisar självassemblering och har skyddande egenskaper. Som vilande metaboliskt inaktiva livsformer kan sporer överleva på obestämd tid i ett uttorkat tillstånd, och det har faktiskt dokumenterats att de har överlevt intakta i miljontals år . Sporen kan motstå temperaturer så höga som 90 °C samt exponering för skadliga kemikalier . De flesta (men inte alla) sporbildande bakterier tillhör två huvudsläkten, Bacillus och Clostridium. Clostridia-sporbildare, till skillnad från Bacillus, differentierar sig endast under anaeroba förhållanden, vilket gör Bacillus till det mest lämpade släktet för studier.

Bacillus-arter producerar en enskild spor eller endospor (till skillnad från svampens exosporer) inom bakteriecellen genom en differentieringsprocess som kräver en samordnad verkan av hundratals utvecklingsgener . Vanligtvis är mogna sporer 0,8-1,2 μm långa och har antingen en sfärisk eller ellipsoid form (se figur 1A). Den enda bakteriekromosomen är kondenserad i sporens centrum, den så kallade kärnan. Skikt av lipidmembran och modifierad peptidoglykan omger sporkärnan, men den viktigaste strukturen är sporhöljet. Detta laminerade proteinhaltiga skal ger sporen motståndskraft mot organiska lösningsmedel och lysozym. I Bacillus subtilis finns så många som 25 olika skalproteiner i två olika skalskikt (figur 1B), det inre och det yttre, men hos andra arter finns det bevis för att skalet är mindre komplext och att det i vissa fall kan bestå av endast ett fåtal proteintyper. Sporshöljets struktur och sammansättning framstår nu som ett modellsystem för att förstå komplexa morfogenetiska sammansättningsprocesser i likhet med de klassiska studierna av sammansättning av fag T4-fager. Det yttre, elektrontäta skiktet i B. subtilis’ sporfodral består av fem huvudsakliga polypeptider, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) och CotF (8 kDa). CotA är ett multikopparoxidas och kan ackumuleras i multimera former (observerade mikroskopiskt) i de sporulerande cellerna i vissa manteldefekta mutanter . Troligen föregår oligomerisering och självmontering av CotA avlagringen på sporskaftets yta. Proteinerna CotG och CotB har också visat sig interagera på ett kovalent sätt och dessutom har CotG och CotC extremt ovanliga aminosyrasekvenser som innehåller flera upprepningar (>13) av 12-13 aminosyror som är rika på lysiner och tyrosiner. Dessutom har många av proteinerna i sporshöljet ovanliga profiler, dvs. multimera former och avvikande molekylmassor, när de undersöks med SDS-PAGE. Nyligen har det visats att sporhöljet faktiskt är flexibelt och kan expandera och dra ihop sig. Denna egenskap är avgörande för sporbildningen när sporen dehydreras och på samma sätt för groningen när sporen återfuktas. Denna aspekt av en självmonterad struktur är särskilt intressant och kan erbjuda ett antal framtida tillämpningar inom läkemedelsleverans, nanofabrikation och ytbeläggningar.

Bakteriella endosporer. Panel A visar endosporer från B. subtilis varav en fortfarande är kvar i den stavformade ”modercellen”. Hos B. subtilis är sporerna ungefär 1,2 μm långa och ellipsoida. De frigjorda sporerna har ett genomskinligt skyddshölje som kallas sporfodret och består av så många som 25 olika protomeriska komponenter som är sammanfogade till diskreta lager. Panel B visar en typisk SDS-PAGE-fraktionering (12,5 %) av solubiliserade sporhöljeproteiner som avslöjar de dominerande arterna.

Engineering av bakteriens sporhölje

En strategi för att konstruera Bacillus subtilis-sporer så att de visar heterologa antigener på sporens yta har nyligen rapporterats och illustreras i figur 2. Ett sporbaserat visningssystem ger flera fördelar jämfört med system som bygger på användning av bakterieceller, bland annat bakteriesporens robusthet som gör det möjligt att förvara den i torkad form, enkel produktion, säkerhet och en teknisk plattform som stöds av omfattande verktyg för genetisk manipulation.

Sporsytedisplay med hjälp av proteiner från sporsöverdraget. B. subtilis-sporen består av en inre kärna (gul) omgiven av en peptidoglykanliknande cortex (röd) och ett proteinhaltigt hölje som är uppdelat i en inre (grå) och en yttre (svart) del. Fusionsproteinet, som består av en bärare (blå) och en passagerardel (lila), exponeras på sporens yta.

I motsats till den rikedom av information som finns tillgänglig om hur genuttrycket kontrollerar differentieringen av en växande cell till en vilande spor är lite känt om mekanismerna för proteininförandet i pälsen, karaktären av de strukturella komponenter som utgör pälsens mest yttre del och om det finns förankringsmotiv. De första försöken att exponera heterologa proteiner på sporernas yta har varit inriktade på två pälskomponenter, CotB och CotC. När det gäller CotB är det känt att detta sporpälsprotein är belägen på ytan, medan CotC har en hög relativ abundans i förhållande till andra pälsproteiner. Observationen att båda dessa komponenter är oumbärliga för bildandet av en till synes normal sporta och för dess groddning var ytterligare ett positivt inslag i valet av CotB och CotC som potentiella bärarproteiner.

Två antigener valdes ursprungligen ut som modellproteiner för att visas på sporernas yta: i) det icke-toxiska 459 aminosyra C-terminala fragmentet av tetanustoxin (TTFC), ett välkänt och mycket immunogent 51.8 kDa peptid som kodas av tetC-genen från Clostridium tetani, och ii) den 103 aminosyror stora B-underenheten av det värmelabila toxinet från enterotoxigena stammar av Escherichia coli (LTB), en 12 kDa peptid som kodas av eltB-genen .

CotB som bärarprotein

Likt andra höljekomponenter har CotB associerats till det yttre höljeskiktet på grundval av genetiska bevis och först nyligen har en immunocytofluorimetrisk analys utförd på intakta sporer visat att CotB är tillgänglig för CotB-specifika antikroppar och att den därför troligen exponeras på sporernas yta .

CotB-strukturgenen, cotB, står under dubbel transkriptionskontroll av σK och det DNA-bindande proteinet GerE. Som en följd av detta transkriberas cotB endast i modercellsavdelningen av den sporulerande cellen . När CotB väl har syntetiserats i modercellens cytoplasma samlas CotB runt den bildande sporen på ett sätt som på något sätt är beroende av CotE, CotG och CotH. Därför genomgår CotB och det heterologa protein som eventuellt fusioneras med det inte ett steg för translokation av cellväggen, vilket är typiskt för visningssystem i andra bakterier.

CotB har en starkt hydrofil C-terminal halva som utgörs av tre 27 aminosyrarepeats som är rika på serin-, lysin- och glutaminrester. Serinrester utgör över 50 % av den C-terminala halvan av CotB. Lysinresterna i CotB:s upprepningar har föreslagits utgöra platser för intra- eller intermolekylär tvärbindning, i analogi med bindvävsproteinerna kollagen och elastin . CotB-proteinet har en avledd molekylmassa på 46 kDa, men migrerar på SDS-PAGE som en polypeptid på 59 kDa. Nyligen har diskrepansen mellan uppmätt och deducerad molekylvikt förklarats genom att visa att CotB initialt syntetiseras som en 46 kDa-art och omvandlas till en 59 kDa homodimer , som behåller både de N- och C-terminala ändarna som förutspås från cotB-nukleotidsekvensen.

Strategin för att erhålla rekombinant B. subtilis-sporer som uttrycker CotB-TTFC eller CotB-LTB på sin yta baserades på i) användning av cotB-genen och dess promotor för konstruktion av translationella fusioner och ii) kromosomal integration av cotB-tetC- och cotB-eltB-genfusionerna i den kodande sekvensen av den icke-essentiella genen amyE (figur 3A) . Genom att placera fusionsproteinerna under cotB:s transkriptions- och translationssignaler säkerställdes en korrekt tidpunkt för uttrycket under sporulationen, medan den kromosomala integrationen garanterade konstruktionens genetiska stabilitet. På grund av bristen på information om CotB-hudens sammansättning och om kraven på förankringsmotiv utfördes inledande försök genom att placera passagerarproteinet vid CotB:s C-terminal, N-terminal eller i mitten av CotB (figur 3B).

Spore-surface display system in B. subtilis . (A) Schematisk bild av integreringen av genfusioner på kromosomen. Röda staplar representerar genfusionen, grå och gröna staplar representerar den icke-essentiella amyE-genen i B. subtilis som används som integrationsplats och kloramfenikolacetyltransferas-genen (cat) som används som en selekterbar markör. (B) Schematisk framställning av fusionsproteiner som använder antingen full längd CotB (380 aminosyror) eller CotBΔ105 (275 aminosyror) eller CotC (66 aminosyror) som bärarproteiner (alla i blått). De tre 27 aminosyror som upprepas av CotB i full längd och den del av dem som återstår i CotBΔ105 är i svart. Lila staplar representerar den heterologa delen av fusionerna (TTFC eller LTB).

När TTFC och LTB fusionerades till CotB:s C-terminala ände misslyckades de chimära proteinerna med att samlas på ett korrekt sätt på sporernas yta (Isticato och Ricca, opublicerat). Sådana inledande misslyckanden tillskrevs en potentiell instabilitet hos konstruktionerna, antingen på DNA-nivå (repetitiva DNA-sekvenser) eller på proteinnivå. För att kringgå sådana problem fusionerades TTFC och LTB till den C-terminala änden av en CotB-form som var borttagen från de tre 27 aminosyrarepeaten, CotBΔ105-TTFC (fig. 3A). I motsats till den fullständiga versionen var det chimära proteinet CotBΔ105-TTFC korrekt sammansatt och exponerat på sporernas yta. En kvantitativ dot blot visade att varje rekombinant sportsort exponerade en mängd CotBΔ105-TTFC-fusionsprotein motsvarande 0,00022 pg, vilket gör det möjligt att dra slutsatsen att 1,5 × 103 chimära molekyler finns på ytan av varje rekombinant sportsort .

Till skillnad från CotBΔ105-TTFC var CotBΔ105-LTB inte korrekt sammansatt. Stammen som uttrycker denna chimär uppvisade minskad sporulering och groningseffektivitet och dess sporer var inte resistenta mot lysozym. Dessa observationer, tillsammans med SDS-PAGE-analysen av de frigjorda pälsproteinerna, tyder på att närvaron av CotBΔ105-LTB kraftigt förändrade sporernas pälsskikt. En in-silico-analys visade en viss homologi mellan den chimära produkten (i fusionsregionen) och LytF, ett cellväggsassocierat endopeptidas som produceras av B. subtilis under vegetativ tillväxt, vilket ger upphov till möjligheten att den chimära produkten skulle kunna störa den korrekta pälsbildningen genom att degradera vissa pälskomponenter (Mauriello och Ricca, data inte visat).

Inom den C-terminala ändfusionen som beskrivs ovan har modellpassagerarproteinet TTFC också fusionerats vid N-terminalen och i mitten av CotB (fig. 3B). I båda fallen användes CotBΔ105-formen av CotB för att undvika de problem som uppstod med den C-terminala fusionen (se ovan). Både den N-terminala fusionen och sandwichfusionen gav upphov till chimära produkter som var korrekt sammansatta i pälsstrukturen ur både kvalitativ och kvantitativ synvinkel . Åtminstone när det gäller CotB var det då möjligt att dra slutsatsen att där passagerarproteinet är exponerat påverkar det inte visningen på sporernas yta.

CotC som bärarprotein

CotC är en 12 kDa, alkalilöslig komponent i B. subtilis sporskikt, som tidigare identifierats med hjälp av omvänd genetik och sedan associerats till det yttre skiktet av skiktet baserat på genetiska bevis . CotC betraktades ursprungligen som en bärarkandidat på grund av dess relativa mängd i sporskaftet (figur 1B). Tillsammans med CotG och CotD utgör CotC cirka 50 % av de totala solubiliserade täckproteinerna. En sådan relativt stor mängd kan göra det möjligt att sätta ihop ett stort antal CotC-baserade chimärer på höljet och på så sätt garantera en effektiv heterologisk visning. CotC-genens uttryck står under kontroll av den modercellsspecifika σ-faktorn σK och av transkriptionsregulatorerna GerE och SpoIIID. Liksom CotB transkriberas CotC också i modercellen och dess montering på pälsen kräver ingen membrantransplantation. Den primära produkten av cotC-genen är en polypeptid med 66 aminosyror som är extremt rik på tyrosin- (30,3 %) och lysinrester (28,8 %) . Det har dock nyligen visats att CotC är sammansatt i minst fyra olika proteinformer, som varierar i storlek mellan 12 och 30 kDa . Två av dessa, med molekylmassor på 12 och 21 kDa och som sannolikt motsvarar en monomerisk respektive homodimerisk form av CotC, samlas på den bildande sporen direkt efter syntesen åtta timmar efter det att sporulationen har börjat. De andra två formerna, 12,5 och 30 kDa, är troligen produkter av posttranslationella modifieringar av de två andra formerna, som sker direkt på pälsytan under mognaden av sporerna.

När det gäller CotC har hittills endast C-terminala fusioner konstruerats (figur 3B). Både CotC-TTFC- och CotC-LTB-genfusioner erhölls genom kloning av tetC eller eltB i ram med det sista cotC-kodonet under transkriptionell och translationell kontroll av cotC-promotorregionen. Genfusionen integrerades sedan i B. subtilis-kromosomen vid amyE-lokusen genom dubbel cross-over-rekombination (figur 3A). Båda dessa två chimära proteiner monterades på de rekombinanta sporernas hölje utan någon större effekt på sporernas struktur och/eller funktion, eftersom de verkade identiska med vildtypssporer när det gäller sporuleringseffektivitet, groddning och resistensegenskaper. Western blot, cytofluorimetrisk analys och, för CotC-TTFC, immunofluorescensmikroskopi (figur 4) visade att båda de CotC-baserade chimärerna fanns på ytan av de rekombinanta sporerna. En kvantitativ bestämning av rekombinanta proteiner som exponeras på B. subtilis-sporer visade att ca. 9,7 × 102 och 2,7 × 103 molekyler av CotC-TTFC respektive CotC-LTB extraherades från varje spor.

Detektering av förekomst av CotC-LTB och CotC-TTFC genom immunofluorescensmikroskopi. Sporulering av B. subtilis-stammar inducerades genom resuspensionsmetoden, och prover togs 6 timmar efter sporuleringens början och analyserades med immunofluorescensmikroskopi enligt tidigare beskrivning . Proverna märktes med antikroppar mot LTB från mus följt av IgG-TRITC-konjugat mot mus (rött fluorescein, panelerna A & B) eller antikroppar mot TTFC från kanin följt av IgG-FITC-konjugat mot kanin (grönt fluorescein, panelerna C & D). Panelerna A & C, sporer av vildtyp; Panel B, isogena sporer som uttrycker CotC-LTB); Panel D, isogena sporer som uttrycker CotC-TTFC.

Och även om CotC förefaller förekomma rikligare än CotB inom pälsen exponeras jämförbara mängder av heterologa proteiner av de CotC-baserade och de CotBΔ105-baserade systemen. Detta resultat var något oväntat, eftersom CotC verkar vara mycket rikligare än CotB i pälsen. En möjlig förklaring kommer från den nyligen gjorda upptäckten att den C-terminala änden av CotC inte bara är nödvändig för interaktion med andra CotC-molekyler utan även med andra komponenter i pälsen (Isticato och Ricca, manuskript under förberedelse) och visar därför att användningen av CotC som bärare fortfarande måste optimeras.

Stabilitet hos proteiner som presenteras i sporer

En av de viktigaste anledningarna till att man föreslår att bakteriesporen ska användas som ett gynnsamt visningssystem är dess väldokumenterade stabilitet. Sporer kan helt enkelt förvaras i rumstemperatur under lång tid utan att deras resistens- och stabilitetsegenskaper minskar. Detta skulle vara en ytterst användbar egenskap för en rad olika biotekniska tillämpningar. Om passagerarproteinet till exempel är ett antigen skulle den rekombinanta sporen kunna bli ett idealiskt värmestabilt oralt vaccin för användning i utvecklingsländer, där värmestabilitet är ett stort problem på grund av dålig distribution och förvaring.

Men även om sporernas stabilitet är väldokumenterad har stabiliteten hos heterologa proteiner som exponeras på sporernas yta undersökts först nyligen. Sporer som uttrycker CotBΔ105-TTFC (se ovan) och föräldrasporer förvarades vid -80°C, -20°C, +4°C och rumstemperatur och undersöktes vid olika lagringstider upp till 12 veckor. I alla fall verkade mängden heterologt protein som fanns på ytan av rekombinanta sporer vara identisk mellan nypreparerade sporer och de som lagrats i upp till 12 veckor (fig. 5). Dessa resultat, som visar att heterologa proteiner kan exponeras stabilt på ytan av rekombinanta sporer, bekräftar det sporbaserade systemet som en mycket lovande visningsmetod som skulle kunna övervinna vissa nackdelar med andra system och som skulle kunna användas inom en rad olika biotekniska områden.

Dot blot-analys av proteiner som extraherats från sporer av vildtyp och från sporer som exponerar CotBΔ 105 -TTFC-chimären. Färskt renade sporer som uttrycker CotBΔ105-TTFC-chimären (t0) eller efter 4, 8 eller 12 veckors (t4, t8 och t12) förvaring i rumstemperatur undersöktes genom dot blotting av extraherade proteiner från sporernas hölje. Koncentrationerna av renad TTFC (i nanogram) och av sporfodsproteiner (i mikrogram) anges. Proteinerna laddades och reagerade med monoklonala anti-TTFC-antikroppar (Boeringher) och sedan med fosfataskonjugerade sekundära antikroppar. Signaler med liknande intensitet erhölls med färskt renade sporer och med sporer som lagrats i rumstemperatur i upp till 12 veckor.

Principbevis för oral vaccinering med stelkramp som modellsjukdom

Sporer som uttrycker CotBΔ105-TTFC har använts för att immunisera möss via oral väg . Serum IgG och fekalt sIgA visade tydlig serokonversion mot TTFC. Doseringsschemat använde tre uppsättningar av tre doser (1,67 × 1010) under 5 veckor och baserades på optimerade regimer för oral immunisering . Titerna av TTFC-specifikt IgG efter 33 dagar (>103) tyder på att dessa var på skyddande nivåer och möss som utmanades med tetanustoxin motsvarande 10 LD50 var helt skyddade. Av åtta möss som utsattes för en dos på 20 LD50 överlevde sju, vilket tyder på att detta var tröskeln för skydd. En liknande undersökning gjordes med nasal immunisering med CotB-TTFC-sporer, men med en lägre dos och tre immuniseringar. Här var de TTFC-specifika IgG-svaren lägre men visade ändå serokonversion. Dessa studier visar att konstruerade sporer som uttrycker ett heterologt antigen kan användas för skyddande immunisering. Även om slemhinnesvar inte är viktiga för skyddet mot Clostridium tetani (en systemisk patogen) är de uppenbarligen viktiga för slemhinnepatogener. Ytterligare studier kommer att behövas för att optimera doseringsregimerna (färre doser och färre sporer), men dessa banbrytande studier har öppnat vägen för utveckling mot specifika slemhinnepatogener. Även om dessa studier är uppmuntrande och visar på humoral respons finns det ännu inga tydliga bevis som tyder på cellulär respons. Det har dock visats att sporer sprids till GALT och återfinns i Peyer’s Patches (PP) och mesenteriska lymfkörtlar . Sporernas lilla storlek (1 μm) gör att de kan tas upp av M-celler och transporteras till PP där de kan interagera med antigenpresenterande celler. De första studierna har visat att sporerna kan gro och finnas kvar under en kort tid i tarmmakrofagerna och att de kan framkalla Th 1-cytokiner in vivo, t.ex. IFN-γ .