De tekniska principerna för att kombinera en transkriptionell inkoherent feedforward-slinga med negativ återkoppling

En modell för inkoherent feedforward-transkriptionsreglering

Det finns fyra olika varianter av inkoherent feedforward (FF)-reglering i ett system med tre noder. I det här dokumentet studerar vi motivet inkoherent feedforward loop typ 1 (I1-FFL), där ingångssignalen (X) aktiverar både den intermediära (Y) och den slutliga utgången (Z), medan Y undertrycker Z (fig. 1a) . Vår modell är en modell för transkriptionsreglering, så att X representerar en ingående transkriptionsfaktor som kan binda till de cis-regulatoriska regionerna för Y och Z med affinitet K1 (fig. 1b). Detta resulterar i transkription och översättning av Y (dubbla pilar i fig. 1b), som också är en transkriptionsfaktor som binder till den regulatoriska regionen i Z med affinitet K2. I vår modell är bindningen av X och Y kooperativ (streckad linje i fig. 1b), så att deras synergistiska bindning beskrivs av K12 = CK1K2. Kooperativ bindning kan också äga rum mellan andra komponenter, men annan kooperativitet än den mellan X och Y krävs inte (se Additional file 1 för analys av kooperativitet). Därför behåller vi bara den enda nödvändiga kooperativa termen för att testa våra hypoteser, och i vår huvudanalys antas därför att alla andra bindningsinteraktioner inte är kooperativa.

I processtyrningsteknik ses X som en störning i systemet; målet med standard-FF-reglering (som använder ett IFFL-motiv) är att avvisa den effekt som X har på Z. Om FF-regleringen är rätt inställd bibehålls utgångsvariabeln på eller nära sitt önskade värde (t.ex, inom 5 %), både i transienten och i den slutliga utgången (fig. 1c). I biologiska system däremot ses X som en ingångssignal, och I1-FFL-motivet är ofta utformat så att nivåerna av Z uppvisar ett transient svar och sedan återgår (nära) sitt ursprungliga värde (fig. 1d). Således representerar topphöjden och skillnaden mellan de ursprungliga och slutliga nivåerna av Z prestationsmått (fig. 1d).

Här modellerar vi I1-FFL som ett system av fördröjningsdifferentialekvationer, som är en utvidgning av modellen från (Eq. 1-3 i Metodik). Observera att X aktiverar både Y och Z, med bindningsaffinitet K1, medan Y undertrycker Z (även om X också är bunden) med bindningsaffinitet K2. Den sista termen i nämnaren av fz är samarbetstermen (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Se Metoder för mer information om modellens härledning.

I detta dokument håller vi x = x0 = 1 för t < 0, vilket resulterar i ett inledande stabilt tillstånd med y0 och z0. Vid tiden t = 0 upplever x en stegvis ökning: x(t ≥ 0) = x1 > 1, vilket resulterar i en initial ökning av både y och z. Efter en viss initial transient börjar dock ökningen av y också att trycka tillbaka z. För de flesta parametervärden resulterar detta i ett toppvärde för z (zpeak), följt av en anpassning tillbaka till ett nytt steady state-värde, z1 (fig. 1d). Här har vi normaliserat toppnivån och anpassningsmåttet som P ≡ (zpeak – z0)/z0 respektive f = (z1 – z0)/z0 (se fig. 1d). I resten av artikeln tar vi τy = τz = 1 och θy = θz = 0,5.

Den inkonsekventa feedforward-slingan av typ I kan ställas in för perfekt anpassning

Förra analysen av ovanstående modell (ekv. 1-3) visade att I1-FFL:s transkriptionsreglering, under rätt förhållanden, kan fungera som en fold-change-detektor (FCD) . Ett av de nödvändiga villkoren för att en modell ska kunna fungera som en FCD är nästan perfekt anpassning (NPA), vilket inträffar när det slutliga tillståndet, z1, ligger inom några få procent av det ursprungliga tillståndet, z0 (t.ex. |f| ≤ ε = 0,05). Medan tidigare arbete analyserade modellen (Eq. 1-3) utifrån FCD, kan modellen (och I1-FFLs i allmänhet) producera flera andra fenotyper, inklusive de mindre restriktiva fenotyperna anpassning och pulsgenerering.

Vår modellanalys visar att det är möjligt att ställa in FFL så att perfekt anpassning (PA) uppnås. Med andra ord, z1 = z0 (blå kurva i fig. 2a, b). Detta villkor uppnås när, för givna K1, K2, värdet av C är lika med CPA, vilket ges av ekv. 5 (se Metoder). Om värdet på C avviker något från CPA förloras PA, men NPA kan bibehållas. Här definierar vi CNPA+ och CNPA- som de värden på C där f = + ε respektive -ε (röda och gyllene kurvor i figur 2a och b). För större delen av detta arbete har vi satt ε = 0,05, men våra resultat påverkas inte nämnvärt av det exakta värdet på ε (se Additional file 1).

Tuning the I1-FFL for near perfect adaptation. a Dynamik i utdata, z(t), vid en stegvis ökning av x från 1 till 10 vid tiden t = 0. Blå kurva: perfekt anpassning. Röda och gula kurvor: nästan perfekt anpassning, så att |f| = 0,05. b Normaliserad utgång av z(t). När kurvorna normaliseras är det tydligt att de röda och gula kurvorna ger en nästan perfekt anpassning. c Värmekarta över det värde på C som krävs för perfekt anpassning givet K1, K2, för en stegvis ökning av x från 1 till 10. Röda kurvor (här och på andra ställen) representerar konturer vars värden anges direkt på kartan. Observera att axelgränserna för K1 sträcker sig från stark (10- 2) till mycket svag (106) affinitet, medan de för K2 sträcker sig från mycket stark (10- 6) till svag (102). d Värmekarta för toppmåttet P. När K1 blir för lågt sjunker detta mått till oacceptabelt låga värden. e Absoluta nivåer för toppmåttet i produktionen. Orangefärgade kurvor: P = 0,1 och CPA = 0,01. Dessa kurvor, tillsammans med konturen zpeak = 0,01, avgränsar ett biologiskt realistiskt område av parameterutrymmet. f Värmekarta över det normaliserade intervallet av C-värden under vilket NPA uppnås. Svarta kurvor avgränsar två regioner där NPA kan uppnås med vilket värde på C som helst. I region I är Y och Z frikopplade och förändras endast något vid en ökning av X. Region II beskrivs som en FCD-region, som kräver NPA. I den biologiskt realistiska delen av parametervärdet varierar de värden på C under vilka NPA kan uppnås från 13 till 65 % av CPA

För x1 = 10 visas en värmekarta över CPA-värdena, som en funktion av K1, K2, i figur 2c. Observera att det krävs samarbetsförmåga för att uppnå PA: CPA < 1, även om den närmar sig 1 för K1, K2 ≪ 1 (se tilläggsfil 1 och fig. 2c). Eftersom C representerar en samarbetsfaktor för vikförändring, representerar värden på C < 1 positiv synergi: när X är bundet till Z:s regulatoriska region ökar det Y:s förmåga att binda, och vice versa. En nedre gräns för rapporterade värden för C i andra system är i storleksordningen 0,01 . Eftersom modeller av biologiska processer måste begränsas till biologiskt realistiska fenotyper är det därför osannolikt att PA kan uppnås i den övre högra regionen av parameterutrymmet (fig. 2c).

Moderata värden i parameterutrymmet motsvarar biologiskt realistiska fenotyper

Med tanke på den grova nedre gränsen för C är det rimligt att fråga sig vilka andra begränsningar som kan läggas på modellen. Vi lägger ytterligare två biologiskt realistiska begränsningar på modellen. För det första bör den relativa toppstorleken, P = (zpeak – z0)/z0, vara större än 0,1 för att säkerställa en kvalitativ signalreaktion. En värmekarta över P som en funktion av K1, K2 visas i fig. 2d. Konturen P = 0,1 ligger ungefär vid K1 = 0,25. Detta innebär att om X binder Z:s regulatoriska region för hårt, ger en tiofaldig ökning av x (från 1 till 10) ingen stark topp, eftersom Z-promotorn redan är mättad, även vid låga värden på x.

För det andra måste den absoluta toppen i z vara större än 0,01 (fig. 2e). Eftersom vår modell är skalad så att det högsta möjliga värdet av z är 1, motsvarar detta 1 % av den högsta möjliga koncentrationen av z, givet promotorstyrkan och nedbrytningshastigheten. Vi tar zpeak = 0,01 som minimivärde för att uppnå en biologiskt detekterbar signal; man kan dock luckra upp detta minimivärde något, vilket inte skulle påverka våra resultat nämnvärt. Med dessa tre begränsningar på CPA, P och zpeak anses ett litet område av K1, K2-parameterutrymmet vara ”biologiskt realistiskt”. För att ge ett sammanhang visas alla tre konturerna i figur 2e. Även denna region kan ändras om andra värden för de ”biologiskt realistiska” begränsningarna väljs. Det bör också noteras att den biologiskt realistiska regionen också avgränsar den region av parameterutrymmet där I1-FFL kan fungera som en pulsgenerator eller perfekt adapter (se Additional file 1).

NPA:s känslighet för I1-FFL-parametrar

Robusthet är ett ytterligare mål som ofta åläggs biologiska system . Därför analyserade vi intervallet av värden C om CPA för vilka NPA bibehålls. Vi definierar ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, och ritade en värmekarta över ΔCFF/CPA i figur 2f (se tilläggsfil 1 för härledning av CNPA+ och CNPA-). Det finns två regioner i parameterutrymmet K1, K2 där NPA uppnås oavsett värdet på C (se tilläggsfil 1 och fig. 2f), och ingen av dem ligger i den biologiskt realistiska regionen av parameterutrymmet (vit streckad region i fig. 2f). I region I är värdet på K1 tillräckligt lågt så att även vid x0 = 1 är de reglerande regionerna för både Y och Z mättade med X, och därmed är Y och Z relativt okänsliga för X (se tilläggsfil 1). I region I är dessutom K2 tillräckligt stor för att Y har liten påverkan på Z. En ökning av x förändrar alltså inte värdet av z nämnvärt, vilket innebär att medan z1 ≈ z0 (så att |f| < ε), finns det ingen topp i värdet av z (se Additional file 1: Figur S1). Detta scenario kan inte riktigt beskrivas som NPA. IFFL:s noder är faktiskt frikopplade i denna region, så att IFFL:s biologiska fenotyp, eller funktion, inte kan särskiljas från två noder som agerar oberoende av varandra.

Region II har tidigare rapporterats som inte bara den region där NPA lätt kan uppnås, utan också där I1-FFL kan fungera som en detektor för fold-ändring (Additional file 1: Figur S2A) . I denna regim, där K1 ≫ 1, K2 ≪ 1 och K1K2 < 1, är bindningen av X linjär och z beror på förhållandet x/y . Å andra sidan är Z:s absoluta svar begränsat till 0,01 % av sitt maximum (Additional file 1: Figur S2B).

I det biologiskt realistiska området av parameterutrymmet är ΔCFF däremot begränsat till 13 % — 65 % av CPA (Fig. 2f). För K1 = 1, K2 = 0,1 till exempel kan systemet, för att bibehålla målet med NPA, endast tolerera en ∼ 30 % störning av CPA. Med andra ord är I1-FFL-modellen relativt känslig för förändringar av C när det gäller NPA. För att öka systemets robusthet övervägde vi ett kombinerat feedforward/feedback-system (FF/FB).

Transkriptionella negativa återkopplingscykler

I tekniken kan feedforward-regleralgoritmens känslighet för modellparametrar mildras genom en negativ återkopplingsslinga (se Ekv. 6-8 i Metoder). Negativ återkoppling har visat sig ge robusthet åt I1-FFL-prestandamål, t.ex. stigningstid och avklingningstid, i en förenklad modell av genreglering . I motsats till den höga frekvensen av transkriptionella FFL-motiv har det emellertid tidigare rapporterats att det inte finns några transkriptionella cykler (utöver autoreglering) i modellorganismen E. coli . Ytterligare studier tyder på att transkriptionell negativ återkoppling är sällsynt, möjligen på grund av den tröga karaktären hos dubbeltranskriptionella slingor, samtidigt som man erkänner den utbredda användningen av blandade negativa återkopplingsslingor där den ena grenen är transkriptionell och den andra grenen är baserad på protein-proteininteraktioner . För att undersöka saken närmare analyserade vi en nyligen uppdaterad datamängd av transkriptionella interaktioner i E. coli och fann 17 exempel på cykler med längden 2, varav fem med positiv återkoppling, nio med negativ återkoppling och tre med blandad återkoppling . Av dessa interaktioner var en av de negativa återkopplingscyklerna inbäddad i flera I1-FFL-strukturer (se Additional file 2).

Ett kombinerat feedforward/feedback-system är mer robust än ett med enbart feedforward

Med tanke på förutsägelsen om effektiviteten hos en FB-slinga för att utöka NPA:s robusthet i ett IFFL-motiv, undersökte vi ett kombinerat FF/FB-system. Vi lade till en fjärde nod, W, som aktiveras av Z och som undertrycker Z (fig. 3a, b). Dessa interaktioner introducerar flera nya parametrar i modellen (se Metoder), inklusive två affinitetsbindningsparametrar (K3, K4) och en transkriptions/translationsfördröjning i W (θw; se fig. 3b).

Beteende hos det kombinerade FF/FB-systemet. a Tillägget av W till nätverksmotivet resulterar i en negativ återkopplingsslinga som involverar Z och W. b Illustration av mekanismen för negativ återkoppling. Z aktiverar W och undertrycks av W. Illustration av Y visas inte (se fig. 1b). c Dynamiken i produktionen, z(t), vid en stegvis ökning av x från 1 till 10 vid tiden t = 0 för det kombinerade FF/FB-systemet. Blå kurva: perfekt anpassning. Röda och gula kurvor: nästan perfekt anpassning, så att |f| = 0,05. d Normaliserad utgång av z(t). När kurvorna normaliseras är det tydligt att de röda och gula kurvorna är inställda för nästan perfekt anpassning. Det värde på C som krävs för att uppnå NPA är mer avlägset från CPA än för systemet med enbart FF. e Värmekarta över det normaliserade intervallet av C-värden under vilket NPA uppnås. De svarta kurvorna som avgränsar regionerna I och II är analoga med dem som beskrivs i figur 2. I den biologiskt realistiska regionen (definierad för FF/FB-systemet) sträcker sig intervallet av C-värden där NPA kan uppnås från 25 till 100 % av CPA. f Värmekarta över förhållandet mellan intervallet av C-värden där NPA uppnås för FF/FB-systemet jämfört med enbart FF-systemet. Tillägget av en FB-slinga ökar intervallet av värden för C med 21–54%

För att direkt jämföra de två systemen plottade vi förhållandet ΔCFFFB/ΔCFF i fig. 3f. För intervallet av biologiskt realistiska värden är ΔCFFFB 21 % — 54 % större än ΔCFF (förhållandet 1,21 — 1,54). (Observera att det biologiskt realistiska område som visas i figurerna 3e och f gäller FF/FB-systemet, se tilläggsfil 1.) Figur S3.) Med undantag för en liten region av K1, K2-parameterutrymmet (nära region II) är faktiskt FF/FB-systemet alltid överlägset det enda FF-systemet (förhållandet är större än ett). Med tanke på FF/FB-systemets fördel med avseende på NPA-målen undersökte vi därefter om de dynamiska egenskaperna hos FF/FB-systemet också var fördelaktiga.

Som tidigare nämnts försökte vi i vår analys behålla endast de interaktioner som var nödvändiga för att förklara NPA-fenotypen dess robusthet. Som sådan var det endast interaktionerna mellan X och Y som inkluderade kooperativitet. Vi kan också införliva samarbete mellan X och W, eller Y och W, vilket inte påverkar vårt resultat att tillsättandet av FB-modulen till I1-FFL ökar systemets robusthet (Additional file 1: Figur S4). Dessutom är våra resultat inte beroende av det exakta valet av ε (Additional file 1: Figur S5).

Dynamisk analys visar att FF/FB-systemet är överlägset det med enbart FB

Negativa återkopplingsslingor är behäftade med flera nackdelar . För det första resulterar proportionell återkoppling (som är den vanligaste mekanismen som naturligt förekommer i biologiska system) alltid i en förskjutning (se fig. 4a). Med andra ord, efter att en störning har stört systemet, återgår inte utgången till sitt ursprungliga värde. För att mildra detta kan man öka styrkan hos den negativa återkopplingen. Detta leder dock ofta till den andra stora nackdelen med negativ återkoppling: dynamisk instabilitet och/eller ringande svängningar kan bli resultatet av stark negativ återkoppling, särskilt i system med betydande fördröjningar (fig. 4b) . Om den primära störningen däremot kan avvisas helt eller delvis av en FFL kan båda nackdelarna undvikas (fig. 4a och b). För att undersöka dessa principer i ett genregleringssystem jämförde vi beteendet hos en modell med enbart FB med en kombinerad FF/FB-modell. För att illustrera dynamisk instabilitet satte vi Hillkoefficienten för alla DNA-bindningsinteraktioner till n = 2 (se Additional file 1).

Dynamiken hos systemen med enbart FB och kombinerade FF/FB. a En (proportionell) negativ återkoppling ensam (blå kurva) resulterar vid störning alltid i en förskjutning från det ursprungliga värdet. Ett jämförbart kombinerat FF/FB-system kan också uppvisa förskjutning, men I1-FFL i FF/FB-systemet kan ställas in för perfekt anpassning. FF/FB-systemet kan också ha en snabbare närmande till stabilt tillstånd. b Tillägget av en I1-FFL till FB-systemet kan resultera i en stabilare dynamik. För detta val av parametrar är det enda FB-systemet instabilt, medan FF/FB-systemet är stabilt. c Värmekarta över realdelen av det huvudsakliga egenvärdet (α) för det enda FB-systemet. Den svarta kurvan är konturen för vilken α = 0, vilket anger stabilitetsgränsen för det enda FB-systemet. Mindre värden på K4 resulterar i ett instabilt system (se del B). Här och på andra ställen anges värden på α för andra konturer (röda kurvor) direkt på plotten. d Samma som C, men för det kombinerade FF/FB-systemet. e Värmekarta över Δα, skillnaden mellan realdelarna av de viktigaste egenvärdena för de två systemen. Till höger om nollkonturen är värdena för Δα större än noll, vilket tyder på att FF/FB-systemet närmar sig stabilt tillstånd snabbare. Svarta och vita kurvor anger stabilitetsgränserna för enbart FB- respektive FF/FB-systemen (se även delarna C, D)

För att bestämma stabiliteten för både enbart FB-systemet och det kombinerade FF/FB-systemet beräknade vi α, den reella delen av huvudegnavärdet (se tilläggsfil 1), för varierande värden på K3, K4 (för FF/FB-systemet ställde vi in K1 = 1, K2 = 0,1; fig. 4c, d). Inget av systemen är klart överlägset det andra, men för måttlig aktivering av W genom Z (K4 ≈ 0,1 eller mer) tenderar stark negativ återkoppling (K3 < 0,1) att resultera i ett instabilt system med enbart FB, medan FF/FB-systemet alltid är stabilt. Faktum är att αFB – αFFFB > 0 för denna region med måttlig aktivering av W (fig. 4e). Även när båda systemen är stabila innebär αFFFB < αFB att FF/FB-systemet når stabilt tillstånd snabbare (se t.ex. figur 4a). Att lägga till ett andra lager av kontroll kan dock ofta leda till kompromisser, där en fördel som uppnås på ett område resulterar i en nackdel på ett annat. Därför kommer vi att jämföra prestandan hos modellerna med enbart FB och kombinerad FF/FB med avseende på två andra mål: normaliserad topp, P, och absolut topp, zpeak.

Ett kombinerat FF/FB-system uppnår en kompromiss för flera mål

För att jämföra prestandan hos systemet med enbart FB med det kombinerade systemet med enbart FB, beräknade vi toppvärdet för z i båda systemen medan vi varierade K3, K4 från 0,01 till 1. Först fann vi att det normaliserade toppvärdet, P, för det enda FB-systemet varierade från ungefär 0,7 till 1 (fig. 5a). Å andra sidan är den normaliserade toppen för FF/FB-systemet nästan oberoende av K3- och K4-värdena och är ungefär 1,256 (se Additional file 1: Figur S6). Därför presterar FF/FB-systemet bättre än enbart FB-systemet även på detta mått: FF/FB-systemet är 30-80 % bättre än enbart FB-systemet (fig. 5b).

För jämförelse av prestandamått för det enda FB-systemet med det kombinerade FF/FB-systemet. a Värmekarta över den normaliserade toppen, P, för det enda FB-systemet. Denna parameter (och andra som definieras i denna figur) är odefinierad för instabila system. b Förhållandet mellan P för FF/FB-systemet och P för enbart FB. Enligt detta mått presterar FF/FB-systemet alltid bättre än enbart FB-systemet. Metriken PFFFB är dock i stort sett konstant på 0,46, oavsett värdena för K3 och K4 (se tilläggsfil 1). c Värmekarta över den absoluta toppen, Zpeak, för FF/FB-systemet och varierande värden för K3 och K4. Observera att det absoluta toppvärdet i bästa fall är 0,06. Även om detta är lågt är det tillräckligt. d Förhållandet mellan den absoluta toppen för FF/FB-systemet och den för enbart FB. Enligt detta mått presterar det enda FB-systemet alltid bättre än FF/FB-systemet (förhållandet är mindre än ett). Med tanke på de andra prestationsmålen för vilka FF/FB-systemet är överlägset är detta dock en acceptabel kompromiss

En stor nackdel med det kombinerade systemet är att med två reprimatorer av utgången (Y och W) är nivåerna av utgången (i förhållande till dess högsta möjliga nivåer) låga. För de valda parametervärdena (K1 = 1, K2 = 0,1) förblir zpeak över den nedre gränsen på 0,01 (se figur 2e). Detta är dock betydligt lägre än det värde på zpeak som ses i systemet med enbart FB (fig. 5d). Sammantaget är det kombinerade FF/FB-systemet överlägset i sin dynamik och sitt normaliserade toppvärde, samtidigt som det kompromissar med det absoluta toppvärdet.