Apoenzym

5.11.3 Proteinets roll – Interaktioner mellan enzym, koenzym och substrat

I samtliga fall binds koenzymet till apoenzym utan att absorptionsspektrumet ändras i grunden. Denna observation tyder på att enzymet inte förvränger corrinringen från dess grundtillståndskonformation i lösning. Ingen information om identiteten hos den α-axiala liganden finns dock tillgänglig från det UV-visionella absorptionsspektrumet av koenzym-proteinkomplexet. Studier har visat att den α-axiala 5,6-dimetylbenzimidazol-liganden är ersatt med en histidin-sidokedja från respektive protein i minst tre kobalaminberoende enzymer: metioninsyntas,4,7 metylmalonyl-CoA-mutas,8,45,46 och glutamatmutas.47 Däremot upptar 5,6-benzimidazolliganden från kobalamin fortfarande den α-axiala ligandpositionen i AdoCbl bundet till dioldehydras48 och ribonukleotidreduktas (se kapitel 5.08).

För att tillgodose koordinationen av histidin-sidekedjan måste ”nukleotidslingan” av 5,6-dimetylbenzimidazolbasen, ribofuranosylfosfodiestern och propionamid-sidekedjan svänga bort från corrinringen och infogas i en bindningsficka i proteinet. Konsensussekvensen DxHxxG har identifierats i kobalaminberoende enzymer som ersätter α-axialliganden med en histidin-sidekedja.7,49,50 Det histidin som koordinerar till koboltatomen interagerar med största sannolikhet med aspartatresterna genom en vätebindning. Utöver rollen som en koordinerande ligand är den exakta funktionen hos His/Asp-dyaden som modulerare av enzymatisk aktivitet ännu inte klarlagd.49 Andra rester i den aktiva platsen kan också delta i ett utvidgat vätebindningsnätverk för att styra reaktiviteten vid metallcentret.7

Adenosylkobalaminberoende enzymer måste öka hastigheten för homolysen av CoC-bindningen med minst en faktor 1012 för att uppnå den observerade katalyshastigheten.14 Labilisering av adenosylkobalamin kräver försvagning av CoC-bindningen för att möjliggöra homolytisk fission. Även om det inte är ett bevisat koncept i kobalaminberoende enzymer skulle tillräcklig energi för att förvränga (försvaga) CoC-bindningen lätt kunna komma från utnyttjandet av överskottsbindningsenergi som härrör från flera vätebindningsinteraktioner till kobalaminkofaktorn, inklusive amidsidsidekedjorna som pryder corrinringen.51 Amidsidsidekedjorna är också viktiga igenkänningselement för att binda till de icke-enzymatiska kobalamintransportproteinerna transkobalamin, haptokorrin och intrinsic factor.52 Avlägsnande eller kemisk derivatisering av specifika amidsidekedjor ändrar bindningen till transkobalamin med 3-40 gånger52 och fullständigt avlägsnande av c-amidsidekedjan gör det möjligt att införa ytterligare en dubbelbindning i det makrocykliska skelettet, vilket gör att corrinringen plattas ut med en åtföljande rödförskjutning av absorptionsmaximum53 .

Förutom att främja den önskade reaktionen utför adenosylkobalaminberoende enzymer en andra viktig funktion genom att förhindra de oönskade sidoreaktioner som ofta åtföljer radikala reaktioner.54 Denna funktion av negativ katalys54 kräver en mycket begränsad fri energiyta som skulle kunna föreställas som en djup canyon genom vilken reaktionen fortskrider längs den fria energiytan. Denna kanjon måste ha branta väggar för att förhindra sidoreaktioner och begränsa den mycket reaktiva radikala intermediären. I slutet av reaktionssekvensen släcks den radikala intermediären genom rekombination av 5′-deoxyadenosylradikalen och kob(II)alamin, vilket återskapar grundtillståndet (vilotillståndet) för kofaktorn adenosylkob(III)alamin. Om enzymet investerar 25 kcal mol-1 för att främja homolysen av C-Co-bindningen för att påbörja den katalytiska cykeln måste denna energi återvinnas i slutet av reaktionssekvensen. Återvinning av energin skulle inte vara möjlig om en oönskad sekvens av omarrangemang inträffade för att producera en radikal som är termodynamiskt stabilare än 5′-deoxyadenosylradikalen. Därför måste enzymet förhindra att alkylradikalen omorganiseras till en intermediär med låg energi eller migrerar genom proteinställningen för att bilda en stabil radikal som inte kan delta i katalysen.55

En paramagnetisk art bildas inte förrän alla reaktionskomponenter finns närvarande i enzym-substratkomplexet, eftersom bildandet av en radikal som härstammar från ett koenzym i avsaknad av substrat skulle kunna leda till oönskade bi-reaktioner. EPR-experiment med metylmalonyl-CoA-mutas46,55 bekräftar att homolysen av CoC-bindningen sker först efter tillsats av substrat, vilket indikeras av uppkomsten av en produktliknande EPR-signal.46 På samma sätt visar stoppade flödesspektrofotometriska experiment med etanolamin-ammoniaklyas att signaturen av kob(II)alamin uppträder i det synliga spektrumet först efter det att enzym och koenzym har kombinerats med mättande nivåer av substrat.56-59

Fotolys, termolys och enzymfrämjad homolys av CoC-bindningen i adenosylkobalamin resulterar i singulettradikalparet som består av kob(II)alamin och 5′-deoxyadenosylradikalen.60,61 Eftersom alla dessa processer leder till att samma radikalpar bildas, kan information från reaktionsdynamiken i fotolysstudier relateras till föreslagna enzymatiska reaktionsmekanismer. Fotohomolysen av adenosylkobalamin börjar med en elektronisk π → π*-promovering i corrinringen och måste involvera ett mellanliggande laddningsöverföringstillstånd på vägen till CoC-bindningshomolysen.60,61 Picosekundfotolysestudier av adenosylkobalamin avslöjar geminatradikalparrekombinationshastigheter på 109 s-1, med en fraktionell rekombinationseffektivitet i buren, Fc, på cirka 94 %.42,62-64 Nanosekund- och kontinuitetsvågsfotolysestudier av kobalaminer bekräftar en effektiv radikalparrekombination i geminatburen, med ett totalt fotokemiskt kvantutbyte på cirka 20 % för adenosylkobalamin och 35 % för metylkobalamin.65,66 I avsaknad av enzym rekombineras en stor del av de geminerade radikalparen innan en betydande diffusionsavskiljning sker. För att stabilisera 5′-deoxyadenosylradikalen och främja katalysen måste enzymet öka radikalparens separationsavstånd, troligen genom en konformationsförändring. Oavsett mekanismen kräver den höga frekvensen av geminatrekombination i radikalparet att en av enzymets funktioner är att separera radikalerna eller tillfälligt fånga upp en av radikalerna för att förhindra för tidig rekombination.

Och även om de resulterande singlet-radikalparen {5′-deoxyadenosylradikal:kob(II)alamin} har identiska elektroniska tillstånd,59-61,67 kan enzymatisk homolys av CoC-bindningen inte få tillgång till ett exciterat elektroniskt tillstånd och måste börja med en annan process för att försvaga CoC-bindningen och förskjuta jämvikten mot dissociation (se avsnitt 5.11.2). Den belastningsinducerade klyvningen kommer inte bara att resultera i homolys av CoC-bindningen, utan denna process kommer också att öka radikalparens separationsavstånd om en komponent av förvrängningen sker längs den apikala kobaltaxeln. Detta brutala tillvägagångssätt för att sträcka CoC-bindningen kan vara den mest effektiva metoden för att uppnå både homolys och en nettominskning av hastigheten för radikalparrekombination.

Det är också möjligt för enzymet att stärka CoC-bindningen och missgynna homolys genom att komprimera den apikala Co-α-N-interaktionen. De termodynamiska egenskaperna hos adenosylcobinamidanalogerna + och + studerades.68 En starkare CoC-bindning observerades i + med ett kortare CoN-bindningsavstånd jämfört med pyridin som α-axialbas. Den starkare CoC-bindningen leder till en betydande förskjutning mot heterolys som den föredragna vägen. I detta modellsystem måste det studerade enzymet, metylmalonyl-CoA-mutas, antingen förhindra CoC-heterolys eller följa en heterolytisk väg.68

I metioninsyntas är corrin-delen av kobalamin insprängd mellan två domäner av ett 27 kDa-fragment, där nukleotidsvansen tränger in i en djup ficka som bildas av rester av den C-terminala domänen.7,69,70 Denna sekvens innehåller en region med måttlig hydrofobicitet som flankeras av förlängda hydrofila segment.71 Strukturella likheter förväntas bland de domäner som utgör gränssnitt mot corrinringen. Den α/β-domän som binder den nedre halvan av corrinringen och rymmer den förlängda nukleotidsvansen (fosfodiesterdelen och 5,6-dimetylbenzimidazolgruppen) i metioninsyntas och metylmalonyl-CoA-mutas förväntas också i glutamatmutas (vide infra).