Alkalisk fosfatas isoenzym

Genomisk struktur, proteinkemi och enzymologi för alkaliskt fosfatas

ALP (ortofosfor-monoesterfosfohydrolas, alkaliskt optimum, EC 3.1.3.1) finns överallt i naturen hos växter och djur (McComb et al., 1979). Hos människor kodas fyra ALP-isoenzymer av fyra separata gener (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Tre av isoenzymerna har i huvudsak vävnadsspecifikt uttryck och betecknas som intestinal, placental och germ-cell (placental-liknande) ALP. Det fjärde ALP-isoenzymet uttrycks ubiquitärt och betecknas därför som TNSALP (Stigbrand och Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Skelett-, lever- och njurvävnad är särskilt rik på TNSALP. De distinkta fysikalisk-kemiska egenskaperna (värmestabilitet, elektroforetisk rörlighet etc.) bland ALP:er som renats från mänskliga ben, lever och njurar går förlorade när de utsätts för glykosidaser (Moss och Whitaker, 1985), och TNSALP är därför en familj av ”sekundära” isoenzymer (jag kommer att kalla dem ”isoformer”). De kodas av samma gen, har identisk polypeptidsekvens och skiljer sig endast genom posttranslationella modifieringar som involverar kolhydrater (Harris, 1980).

Genmappningssymbolen för TNSALP är ALPL (”ALP-liver”), även om funktionen för leverisoformen av TNSALP inte är känd (se senare). ALPL ligger nära spetsen av den korta armen på kromosom 1 (1p36.1-p34), medan generna för tarm-, placenta- och könscells-ALP:erna ligger vid spetsen av den långa armen på kromosom 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL verkar representera den ursprungliga genen, medan de vävnadsspecifika ALP:erna troligen bildades genom genduplikation (Harris, 1990). ALPL är något större än 50 kb och innehåller 12 exoner, varav 11 översätts för att bilda det mogna enzymet som består av 507 aminosyrarester (Weiss et al., 1988b). TATA- och Sp1-sekvenser kan vara reglerande element, men det basala uttrycket tycks återspegla ”housekeeping”-promotoreffekter, medan differentiellt uttryck i olika vävnader kan förmedlas av en posttranskriptionell mekanism (Kiledjian och Kadesch, 1990). ALPL har två promotorer och två motsvarande 5′-nonkodande exoner, 1a och 1b. Deras uttryck resulterar i två olika mRNA med olika 5′-untranslated regioner (Nosjean et al., 1997). Transkriptionen sker företrädesvis från promotorn uppströms (1a) i osteoblaster och från promotorn nedströms (1b) i lever och njure (Millán, 2006).

De vävnadsspecifika ALP-generna är mindre än ALPL, främst på grund av kortare introner. Aminosyrasekvenser som härletts från deras cDNA:er tyder på 87 % positionsidentitet mellan placental och intestinal ALP men endast 50-60 % identitet mellan de vävnadsspecifika ALP:erna och TNSALP (Harris, 1990).

Aminosyrarestsekvensen för TNSALP visar på fem potentiella N-länkade glykosyleringsställen (Weiss et al., 1988). N-glykosylering är nödvändig för katalytisk aktivitet. O-glykosylering karakteriserar ben-, men inte leverisoformen (Nosjean et al., 1997).

År 2000 beskrevs kristallstrukturen för human placental ALP med en upplösning på 1,8 Å (Le Due et al., 2000). Den aktiva platsen för TNSALP skulle härröra från en nukleotidsekvens som är bevarad i ALP i hela naturen (Henthorn och Whyte, 1992), speglar sex exoner och består av 15 aminosyrarester (Zurutuza et al., 1999).

ALP är Zn++-metalloenzymer (McComb et al., 1979). Katalytisk aktivitet kräver en multimerisk konfiguration av identiska underenheter där varje monomer har en aktiv plats och två Zn++-atomer som stabiliserar den tertiära strukturen (Kim och Wycoff, 1991).

ALP:er anses i allmänhet vara homodimera i cirkulationen (McComb et al., 1979). TNSALP, i sin symmetriska dimeriska form, har αβ-topologi för varje underenhet inklusive ett tiosträngat β-blad i dess centrum (Hoylaerts och Millán, 1991). I vävnader är dock ALPs bundna (se senare) till cellytor, kanske som homotetramer (Fedde et al., 1988).

In vitro har ALPs breda substratspecificiteter och pH-optima som beror på typen och koncentrationen av den fosforförening som genomgår katalysen (McComb et al., 1979). Katalytisk aktivitet kräver Mg++ som en kofaktor (McComb et al., 1979). Såväl PPi som fosfoestrar kan hydrolyseras (Xu et al., 1991). Reaktionen innefattar fosforylering-defosforylering av en serinrest. Dissociation av det kovalent bundna Pi verkar vara det hastighetsbegränsande steget. Pi är faktiskt en potent kompetitiv hämmare av ALP (McComb et al., 1979; Kim och Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Det kan dock också vara så att Pi stabiliserar enzymet (Farley, 1991).

Oklarheter kvarstår om biosyntesen av ALP i högre organismer. Gensekvenserna för de mänskliga ALP-isoenzymerna visar att de framväxande polypeptiderna har en kort signalsekvens med 17-21 aminosyrarester (Harris, 1990) och en hydrofob domän vid sin karboxylterminus (Weiss et al., 1988b). Intracellulär nedbrytning av ALPs kan involvera proteasomer (Cai et al., 1998). Dessa ALP:er knyter dock an till den yttre ytan av plasmamembranen bundna till den polära huvudgruppen av en fosfatidylinositol-glykanenhet (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) och kan frigöras av fosfatidylinositolspecifikt fosfolipas (Fedde et al., 1988). Deras exakta interaktion med fosfatidylinositol kan dock skilja sig åt mellan ALP-isoenzymerna (Seetharam et al., 1987).

Lipidfri ALP är den del som normalt finns i cirkulationen. Mekanismerna för frisättning av ALP från cellytor är dock inte kända. Processen skulle kunna involvera ett fosfatidos av C- eller D-typ, detergentverkan, proteolys, membranfraktionering eller lipolys (Alpers et al., 1990).

I friska män och kvinnor härrör nästan all ALP-aktivitet i serum eller plasma från ungefär lika stora mängder av ben- och leverisoformerna av TNSALP (Millán et al., 1980). Spädbarn och barn, särskilt nyfödda och ungdomar, har högre blodomloppsnivåer av benisoformen (McComb et al., 1979). Vissa personer med blodgrupperna B och O som är ”sekretorer” ökar den lilla mängden intestinal ALP i cirkulationen efter intag av en fet måltid (Langman et al., 1966; McComb et al., 1979). Typiskt sett bidrar dock intestinal ALP endast med några få procent till serumets totala ALP-aktivitet (högst 20 %) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). Placental ALP uttrycks vanligen och cirkulerar endast under graviditetens sista trimester (Birkett et al., 1966). Olika cancerformer släpper dock ut placenta- eller könscells-ALP (”placental-liknande”) i blodomloppet (Millán, 1988). Clearance av cirkulerande ALP, liksom för många andra glykoproteiner, involverar troligen upptag och nedbrytning i levern (Young et al., 1984).