Reglarea sintezei colesterolului

00:00:08.12Numele meu este Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03și sunt de la Departamentul de Genetică Moleculară
00:00:00:12.01la University of Texas Southwestern Medical Center din Dallas, Texas.
00:00:00:15.17În această prezentare,
00:00:00:17.19Voi vorbi despre reglarea prin feedback a HMG CoA reductazei,
00:00:00:20.27care este enzima care limitează viteza de sinteză a colesterolului.
00:00:00:25.06 Deci, acest diapozitiv arată structura colesterolului
00:00:27.06și câteva dintre caracteristicile acestei molecule importante.
00:00:00:31.01Colesterolul este un sterol,
00:00:33.10care se distinge prin această structură cu patru inele.
00:00:36.00Această structură cu patru inele conferă rigiditate acestei molecule,
00:00:00:39.02care o face o componentă ideală a membranelor celulare.
00:00:00:43.18Acum, deoarece colesterolul are un număr mare
00:00:46.07de legături carbon-carbon și carbon-hidrogen,
00:00:00:49.02această moleculă este practic insolubilă în apă.
00:00:00:52.07Așa că, din acest motiv,
00:00:00:54.13celulele trebuie să fie capabile să mențină colesterolul într-un interval îngust,
00:00:00:58.03astfel încât să fie produs suficient colesterol pentru nevoile celulare ale moleculei
00:01:02.13dar să se evite supraacumularea toxică de colesterol.
00:01:06.16Supraacumularea de colesterol poate fi toxică la nivel celular.
00:01:12.11Acum, acest diapozitiv prezintă câteva dintre funcțiile esențiale ale colesterolului.
00:01:15.10Colesterolul este absolut necesar pentru viață.
00:01:17.26Cum am menționat mai devreme,
00:01:19.27unul dintre cele mai bine recunoscute roluri ale colesterolului
00:01:22.26este rolul său în membranele celulare,
00:01:25.08unde menține fluiditatea optimă a membranei.
00:01:29.00Acum, colesterolul se dovedește a fi un precursor important
00:01:32.01pentru molecule foarte importante, cum ar fi hormonii steroizi,
00:01:34.25care ajută la deosebirea dintre fete și băieți;
00:01:38.19acizii grași, care ajută la digestie și nutriție prin solubilizarea grăsimilor alimentare și a vitaminelor liposolubile;
00:01:47.10și apoi, în sfârșit, colesterolul este abundent în creier,
00:01:50.18unde se găsește în învelișurile de mielină care înconjoară axonii
00:01:53.17și ajută la sinap… transmisiunile sinaptice.
00:01:58.18Acum, celulele din corpul nostru – mamifere… celulele mamiferelor –
00:02:02.01obțin colesterolul din două surse.
00:02:04.21Una dintre surse este ilustrată în acest diapozitiv,
00:02:07.06și anume prin sinteza colesterolului
00:02:09.19din precursorul acetil CoA.
00:02:13.00Acum, conversia acetil CoA în colesterol
00:02:15.21se produce prin acțiunea a peste 20 de enzime.
00:02:20.22Acum, după cum vă puteți imagina,
00:02:22.21sinteza colesterolului implică producerea mai multor intermediari,
00:02:26.16și acești intermediari în sine
00:02:29.14pot fi, de asemenea, transformați în produse finale foarte importante.
00:02:33.11De exemplu, acest compus, farnesil pirofosfat,
00:02:36.29este un precursor pentru un compus important numit dolicol,
00:02:40.25care este implicat în glicozilarea legată de N.
00:02:43.26Este, de asemenea, un precursor pentru heme și ubiquinone,
00:02:46.10care sunt implicate în respirația celulară;
00:02:49.26vitamina K, care este implicată în coagularea sângelui;
00:02:53.12și apoi, în cele din urmă, acest farnesil pirofosfat și geranilgeranil pirofosfat
00:02:58.06se atașează la multe proteine de semnalizare,
00:03:01.16proteine GTP mici,
00:03:03.22direcționându-le către membrane,
00:03:06.12și această modificare este absolut necesară pentru funcționarea normală a celulei.
00:03:13.04Acum, acest diapozitiv arată că sinteza colesterolului
00:03:16.02se produce în diferite țesuturi, în ritmuri diferite.
00:03:19.29Acum, ficatul și glandele suprarenale
00:03:23.14sintetizează cel mai mult colesterol din corpul nostru.
00:03:25.10Și ar trebui să precizez că acest lucru a fost realizat de fapt la șoareci,
00:03:28.06dar efecte similare sunt observate la oameni
00:03:31.07și la alte primate.
00:03:33.19Fața… ficatul sintetizează cantități mari de colesterol
00:03:36.24pentru producerea în principal a lipoproteinelor
00:03:39.14și, de asemenea, pentru sinteza acizilor biliari.
00:03:42.10Glandele suprarenale produc colesterol
00:03:45.28în primul rând pentru sinteza hormonilor steroizi,
00:03:48.13în timp ce intestinul sintetizează colesterolul pentru…
00:03:51.27pentru diviziunea celulară.
00:03:54.12Un număr mare de celule din intestin sunt eliminate în fiecare zi
00:03:57.12și trebuie să fie înlocuite cu celule noi,
00:03:59.27care necesită o cantitate marcantă de sinteză a colesterolului.
00:04:03.28Ar trebui să subliniez, de asemenea, că intestinul este, de asemenea, o sursă de producție de lipoproteine.
00:04:09.21 Deci, acum a doua sursă de colesterol
00:04:12.12este de fapt din lipoproteinele
00:04:15.16care sunt produse de ficat și intestin.
00:04:18.06Așa că, aici este prezentat un model de lipoproteină cu densitate scăzută.
00:04:23.02Este principalul transportor de colesterol din plasma umană.
00:04:28.02Așa că, lipoproteina cu densitate scăzută, sau LDL,
00:04:31.14consistă dintr-un miez care este compus din colesterol liber.
00:04:36.19Așa că, colesterolul hidrofob formează miezul particulei LDL.
00:04:41.19Acum, acest colesterol hidrofob
00:04:44.01este înconjurat de un înveliș care este compus dintr-un fosfolipid
00:04:47.02cu diferite cantități de colesterol esterificat
00:04:51.13 – acesta este colesterolul la care a fost atașat un acid gras –
00:04:55.14 care este intercalat în învelișul fosfolipidic.
00:04:59.03Acum, această întreagă particulă LDL
00:05:02.18este înconjurată de o proteină numită apolipoproteină B.
00:05:08.02 Deci, acest diapozitiv descrie de fapt
00:05:10.17modul în care celulele dobândesc colesterolul din aceste două surse:
00:05:13.13sinteza endogenă și de la LDL.
00:05:18.19 Deci, receptorii LDL
00:05:21.09 – sunt pe suprafața celulelor –
00:05:23.20se leagă de LDL prin interacțiunea cu această particulă de apolipoproteină B
00:05:29.12care înconjoară învelișul lipoproteinei.
00:05:32.25După ce particula LDL se leagă de receptorul LDL,
00:05:35.27întregul complex este internalizat în gropi acoperite.
00:05:40.06Și aceste gropi acoperite sunt apoi direcționate către lizozomi,
00:05:43.07unde particula LDL este degradată și colesterolul
00:05:47.15 – colesterolul liber –
00:05:49.25este acum eliberat și furnizat celulei pentru diverse utilizări.
00:05:54.18 Deci, din nou, aceste două surse de colesterol celular
00:05:58.03 – fie de la receptor… endocitoza LDL mediată de receptorul LDL,
00:06:03.07sau prin sinteza endogenă —
00:06:06.02pot fi folosite interschimbabil.
00:06:09.01Așa că, de exemplu, dacă LDL devine limitativă,
00:06:12.00celula trece la sinteza endogenă pentru sursele sale de colesterol.
00:06:18.02Și dacă sinteza endogenă este blocată,
00:06:20.05atunci celulele pot folosi acum LDL exogen
00:06:23.01pentru sursa lor de colesterol.
00:06:27.00Atunci, am vorbit despre funcția esențială a colesterolului.
00:06:30.10Este important în membranele celulare.
00:06:32.11Este un precursor important al hormonilor steroizi
00:06:34.28și al acizilor biliari.
00:06:36.16Există însă și o parte rea a colesterolului,
00:06:38.13și aceasta este ilustrată în această diapozitivă.
00:06:41.00De mai mulți ani, nivelurile ridicate de colesterol LDL din sânge
00:06:46.14sunt asociate cu un risc de boli coronariene
00:06:49.19și atacuri de cord.
00:06:51.16Deci, arătat aici puteți vedea că
00:06:54.27nivelul colesterolului din sânge
00:06:57.26se corelează literal cu riscul de boală coronariană.
00:07:01.09Și asta pentru că un nivel ridicat de colesterol
00:07:04.21se poate depozita de fapt în arterele care duc la… la inimă.
00:07:08.12Și, în timp, această depunere
00:07:11.15rezultă într-o boală numită ateroscleroză,
00:07:13.09în care această depunere de colesterol
00:07:15.04poate duce la producerea de plăci
00:07:17.12care în cele din urmă pot bloca circulația sângelui către inimă,
00:07:19.18creând astfel un atac de cord.
00:07:23.06Acum, unul dintre cele mai prescrise medicamente
00:07:28.16pentru a reduce colesterolul LDL
00:07:31.11este un grup de medicamente numite statine.
00:07:33.03Este prezentată aici structura de bază tipică a statinelor
00:07:37.26și unele dintre diferitele forme de statine
00:07:41.29care au fost utilizate în clinică.
00:07:44.22De-a lungul anilor, statinele
00:07:47.12au devenit una dintre cele mai… cele mai bine vândute medicamente…
00:07:49.10medicamente din Statele Unite
00:07:51.20din cauza capacității lor de a reduce colesterolul LDL din sânge.
00:07:57.19Deci, prezentat în acest experiment este un rezumat a cel puțin patru studii
00:08:02.23care relevă faptul că statinele reduc într-adevăr colesterolul LDL
00:08:06.06și că această reducere duce la o incidență redusă
00:08:10.04de boli coronariene.
00:08:12.11Deci, arătate aici în cercurile închise sunt studiile clinice
00:08:15.11în care pacienții au fost tratați fie cu o statină, prezentată în… prezentată în cercurile închise,
00:08:20.22sau cu un placebo.
00:08:22.11Și în fiecare dintre aceste studii, tratamentul cu statine a dus la
00:08:25.17o scădere a nivelului de colesterol LDL,
00:08:28.06și această scădere a nivelurilor de colesterol LDL
00:08:31.19a dus la o reducere a evenimentelor coronariene, adică a atacurilor de cord.
00:08:35.13Atunci, întrebarea devine, știți, cum funcționează statinele?
00:08:38.21Și ce fac statinele?
00:08:40.28Atunci, am răspuns mai întâi, ce fac statinele?
00:08:43.16Atunci, statinele inhibă enzima HMG CoA reductaza.
00:08:47.05HMG CoA reductaza catalizează
00:08:50.20pasul care limitează viteza de sinteză a colesterolului.
00:08:53.28Este de fapt al patrulea pas în calea de sinteză a colesterolului.
00:08:58.06 Așadar, statinele inhibă competitiv HMG CoA reductaza
00:09:01.20imitând produsul reacției reductazei,
00:09:05.13mevalonatul.
00:09:07.20Atunci, această inhibare competitivă a reductazei
00:09:10.19fundamentează capacitatea statinelor de a reduce
00:09:14.18colesterolul LDL din sânge.
00:09:18.07Atunci, cum acționează statinele?
00:09:20.17Atunci, din nou, prin inhibarea competitivă a HMG CoA reductazei,
00:09:24.01aceasta duce la scăderea cantităților de mevalonat
00:09:27.09și, bineînțeles, la o scădere a colesterolului.
00:09:30.18Această scădere a colesterolului duce la o creștere
00:09:33.12a transcrierii genei
00:09:36.06care codifică receptorul LDL.
00:09:37.25Și ca urmare, numărul receptorilor LDL de pe suprafața…
00:09:41.14în special a celulelor hepatice,
00:09:43.15și această creștere a receptorilor LDL duce
00:09:48.01la o absorbție crescută sau îmbunătățită a LDL din sânge.
00:09:52.25Și această reducere a LDL din sânge
00:09:55.26este responsabilă de scăderea bolii coronariene
00:09:58.20la pacienții tratați cu statine.
00:10:02.12Cu toate acestea, efectele clinice ale statinelor
00:10:05.26sunt de fapt estompate de
00:10:09.06creșterea compensatorie a HMG CoA reductazei
00:10:11.10care însoțește terapia cu statine.
00:10:13.19Și acest lucru este ilustrat în acest diapozitiv.
00:10:15.13Este un imunoblot al proteinei HMG CoA reductazei
00:10:19.03în ficatul șoarecilor care au fost hrăniți cu o statină,
00:10:22.17sau chiar în celulele cultivate
00:10:25.00care au fost tratate cu statine in vitro.
00:10:26.24Și după cum puteți vedea,
00:10:28.20tratamentul cu statine provoacă o acumulare marcată
00:10:31.09de HMG CoA reductază.
00:10:33.10Și această acumulare, așa cum am menționat mai devreme,
00:10:35.24înlătură efectele clinice ale statinelor.
00:10:38.12Atunci, următoarea noastră întrebare este, de ce determină statinelor
00:10:41.27HMG CoA reductaza să se acumuleze la un nivel atât de ridicat?
00:10:44.14Ceea ce ar trebui să precizez că a fost estimat a fi
00:10:47.02de cel puțin 200 de ori.
00:10:49.29Așa că, în mod normal, HMG CoA reductaza
00:10:51.25este supusă unui număr enorm de reglementări de feedback.
00:10:55.02Și această reglare prin feedback este mediată în parte
00:10:57.29prin steroli.
00:11:00.02Acum, tratamentul cu statine, așa cum am menționat mai devreme,
00:11:02.05blochează activitatea HMG CoA reductazei,
00:11:04.12și împiedică sinteza acestor molecule de steroli.
00:11:07.29Și, bineînțeles, această împiedicare a sintezei de steroli
00:11:10.26este de fapt responsabilă pentru stimularea receptorilor LDL
00:11:14.17și reducerea ulterioară a colesterolului LDL.
00:11:18.09Cu toate acestea, deoarece statinele
00:11:21.03blochează sinteza de steroli,
00:11:22.18întrerupe reglarea prin feedback a reductazei.
00:11:25.14Și ca urmare, se produc trei evenimente.
00:11:27.28În primul rând, din cauza acestei reduceri a colesterolului
00:11:31.09și a altor produse ale căii de sinteză a colesterolului,
00:11:35.08se produce o transcripție îmbunătățită a genei reductazei,
00:11:39.07se produce o traducere îmbunătățită
00:11:41.28a ARNm al reductazei,
00:11:43.28a ARNm al reductazei,
00:11:43.17și apoi, în cele din urmă, există o stabilitate sporită
00:11:45.24a proteinei reductazei.
00:11:47.13 Deci, aceste trei evenimente sunt responsabile
00:11:49.19pentru acea creștere marcantă a proteinei reductazei
00:11:52.03pe care v-am arătat-o în diapozitivul anterior.
00:11:55.18Deci, de-a lungul anilor,
00:11:57.06laboratorul meu a fost interesat să încerce să înțeleagă
00:11:59.27mecanismele moleculare care stau la baza
00:12:02.22această stabilitate sporită a proteinei,
00:12:04.09și acesta va fi subiectul restului acestei prezentări.
00:12:09.16 Deci, acest diapozitiv ilustrează faptul că sterolii
00:12:13.08accelerează într-adevăr degradarea
00:12:15.26a HMG CoA reductazei.
00:12:17.14 Deci, în acest experiment,
00:12:19.11am folosit analiza clasică pulse-chase
00:12:20.29pentru a monitoriza stabilitatea reductazei în celulele
00:12:23.16care au fost tratate în absența sau în prezența sterolilor.
00:12:26.00Acum, ceea ce facem aici este că, de obicei, marcăm celulele cu radioactivitate,
00:12:29.27un mic subset de molecule de HMG CoA reductază.
00:12:33.25Apoi îndepărtăm acea radioactivitate,
00:12:35.25și apoi urmărim pres…
00:12:37.25stabilitatea proteinei reductazei
00:12:39.26în absența sau în prezența sterolilor.
00:12:44.10Și după cum puteți vedea aici,
00:12:46.08când celulele sunt urmărite în medii
00:12:49.07care nu conțin radioactivitate,
00:12:51.01în absența sterolilor
00:12:52.28reductaza este destul de stabilă în timp.
00:12:55.16Cu toate acestea, după cum puteți vedea,
00:12:57.21adăugarea de steroli în mediul de urmărire
00:12:59.26 determină ca nivelurile de reductază să scadă semnificativ.
00:13:02.20Încă o dată, acest lucru indică degradarea accelerată de steroli
00:13:06.04de HMG CoA reductaza.
00:13:09.16Acum, pentru a înțelege mecanismele moleculare
00:13:11.22pentru această degradare a reductazei indusă de steroli,
00:13:14.15trebuie să înțelegem structura proteinei HMG CoA reductazei.
00:13:18.05Și structura domeniului reductazei
00:13:20.14este de fapt ilustrată în această diapozitivă.
00:13:22.18 Deci, HMG CoA reductaza
00:13:24.16este alcătuită din două domenii distincte.
00:13:26.28Are un domeniu N-terminal
00:13:29.06care ancorează proteina în membranele reticulului endoplasmatic,
00:13:32.14sau ER.
00:13:35.00Acum, acest domeniu N-terminal,
00:13:36.29la care ne referim ca fiind domeniul membranar,
00:13:39.04conține opt regiuni care se întind pe membrană.
00:13:42.05Și este urmat de al doilea domeniu al HMG CoA reductazei,
00:13:45.07pe care îl numim domeniul catalitic.
00:13:47.24Atunci, domeniul catalitic face proeminență în citosolul celulelor
00:13:51.24și conține toată activitatea enzimatică a HMG CoA reductazei.
00:13:56.03De fapt, o versiune trunchiată a reductazei
00:13:59.29care conține doar domeniul catalitic
00:14:02.13poate salva complet sinteza de mevalonat
00:14:06.28în celulele care nu au HMG CoA reductază.
00:14:10.13 Deci, domeniul catalitic este atât necesar cât și suficient
00:14:13.01pentru sinteza mevalonatului.
00:14:15.29Ceea ce ridică apoi întrebarea,
00:14:17.28de ce este această proteină legată de membrană?
00:14:19.26Și se pare că reductaza
00:14:22.02este de fapt o proteină legată de membrană încă de la drojdie.
00:14:25.18 Deci, funcția domeniului membranar al reductazei
00:14:28.26a fost ilustrată în acest experiment timpuriu
00:14:31.27care a comparat stabilitatea domeniului catalitic
00:14:35.08 – care, amintiți-vă, conține toată activitatea enzimatică –
00:14:37.26cu cea a enzimei de lungime completă.
00:14:40.20Și, din nou, a fost folosită o simplă analiză cu impulsuri
00:14:42.21pentru a monitoriza stabilitatea acestor două proteine.
00:14:47.13Așa cum puteți vedea în panoul din stânga,
00:14:49.03domeniul catalitic trunchiat produce
00:14:53.14o proteină foarte stabilă care… important,
00:14:57.08degradarea sa nu este influențată de steroli.
00:14:59.20În schimb, proteina de lungime completă – care, din nou, conține domeniul membranar –
00:15:03.07este mai puțin stabilă, chiar și în absența sterolilor.
00:15:06.13Și puteți vedea că sterolii accelerează marcant
00:15:09.25degradarea HMG CoA reductazei,
00:15:12.09ceea ce indică faptul că domeniul membranar…
00:15:15:15.12funcția domeniului membranar
00:15:17.25este pentru această degradare accelerată de steroli sau indusă de steroli.
00:15:22.08 Deci, ceea ce au indicat studiile anterioare
00:15:25.25.12este că domeniul membranar al reductazei
00:15:28.03este necesar și suficient pentru degradarea accelerată de steroli,
00:15:30.25și au sugerat că domeniul membranar,
00:15:33.16direct sau indirect,
00:15:35.16poate sesiza nivelurile intracelulare de steroli.
00:15:38.00Și sesizarea are ca rezultat, probabil,
00:15:41.02o modificare conformațională în domeniul membranar al reductazei
00:15:43.29care face ca proteina să fie susceptibilă la o degradare rapidă.
00:15:48.14Și, bineînțeles, deoarece statinele blochează sinteza colesterolului,
00:15:52.01statinele blochează într-adevăr acest
00:15:54.22ceeaceea ce numim degradare asociată cu ER – sau ERAD –
00:15:57.08din HMG CoA reductaza.
00:16:02.23Deci, o descoperire cheie în înțelegerea noastră
00:16:04.23despre ERAD a HMG CoA reductazei
00:16:06.15a venit odată cu descoperirea unei perechi de proteine
00:16:08.28 – proteine de membrană ER –
00:16:10.23numite Insig-1 și Insig-2.
00:16:14.15Aceste proteine Insig, în scopul acestei discuții,
00:16:16.27sunt foarte redundante.
00:16:18.14Ele îndeplinesc roluri redundante în degradarea, sau ERAD,
00:16:22.06a HMG CoA reductazei.
00:16:24.00Sunt identice… sunt aproximativ 85% identice,
00:16:26.23și sunt proteine foarte hidrofobe.
00:16:29.24Acum, rolul Insigs în ERAD a HMG CoA reductazei
00:16:34.28a fost ilustrat pentru prima dată în acest experiment.
00:16:37.19Acum, aici am folosit din nou analiza pulse-chase
00:16:40.15pentru a măsura degradarea accelerată de steroli
00:16:43.29a reductazei în celule
00:16:47.02care au fost fie transfectate cu molecule de control,
00:16:51.06numite siRNAs,
00:16:53.05sau celule care au fost transfectate cu siRNAs
00:16:55.26care ar duce la reducerea expresiei
00:16:58.13a expresiei
00:16:58.13atât a Insig-1 cât și a Insig-2.
00:17:02.07Și după cum puteți vedea în panoul din stânga,
00:17:04.13în celulele transfectate cu siARN-uri de control,
00:17:08.04sterolii accelerează în mod marcat degradarea
00:17:12.07a HMG CoA reductazei.
00:17:14.13 Așadar, cercurile deschise sunt experimentele efectuate în absența,
00:17:17.09și cercurile închise sunt experimentele efectuate
00:17:20.15în prezența sterolilor.
00:17:22.12Și ceea ce se poate observa cu ușurință este faptul că knockdown-ul lui Insig-1 și Insig-2
00:17:26.23abolește complet degradarea accelerată de steroli,
00:17:30.02indicând că aceste proteine
00:17:32.28joacă un rol cheie în acest proces.
00:17:35.27 Așadar, următoarea noastră întrebare este,
00:17:38.02care este mecanismul
00:17:39.26prin care Insigs accelerează ERAD a HMG CoA reductazei?
00:17:47.09 Deci, acest experiment…
00:17:48.21acest diapozitiv arată că inhibitorii proteazomului, proteazomul 26S,
00:17:53.21blochează degradarea indusă de steroli a HMG CoA reductazei.
00:17:57.15Așa că, după cum puteți vedea în acest experiment…
00:18:00.18în primele două benzi, sterolii au provocat o degradare accentuată a reductazei,
00:18:04.17și această degradare este complet blocată
00:18:06.19când aceste celule sunt tratate cu inhibitorul de proteazom.
00:18:12.03 Deci, cu… acest lucru ne permite să creăm un alt model
00:18:15.27în care, din nou, domeniul membranar al reductazei
00:18:18.25direct sau indirect
00:18:21.22simte nivelurile de steroli intracelulari,
00:18:24.15acest lucru face ca reductaza să se lege de Insigs,
00:18:28.12și această legare de Insig duce la reacții care fac ca reductaza
00:18:32.06să fie acum degradată de proteazomul 26S.
00:18:37.22Acum, se știe că majoritatea substraturilor proteazomilor
00:18:41.00necesită ubiquitinarea lor prealabilă.
00:18:44.05Ubiquitinarea este un proces prin care
00:18:46.23proteina mică ubiquitină devine atașată covalent
00:18:50.16la moleculele de substrat.
00:18:52.08Și odată ce un lanț de ubiquitine
00:18:54.16este atașat la substraturi,
00:18:56.08devine recunoscut de proteazomi pentru degradare.
00:19:00.25Acum, acest lucru se numește polubiquitinare,
00:19:02.25și polubiquitinarea proteinelor
00:19:05.14necesită acțiunea a cel puțin trei tipuri diferite de enzime.
00:19:07.29Acesta este ilustrat în acest diapozitiv.
00:19:11.09În prima etapă,
00:19:13.15ubiquitina devine activată
00:19:15.20într-un mod dependent de ATP de către o enzimă numită E1,
00:19:19.11sau proteina de activare a ubiquitinei.
00:19:22.15În etapa următoare, ubiquitina este transferată de la E1 la…
00:19:27.13la o altă enzimă numită E2, sau enzima de conjugare a ubiquitinei.
00:19:32.16În etapa finală, E2 se combină cu o E3,
00:19:36.24sau ubiquitină ligază,
00:19:39.08care, la rândul ei, se asociază cu substratul,
00:19:42.09prezentat aici în verde.
00:19:44.11Ceea ce face E3 este că facilitează transferul de ubiquitină
00:19:47.27de la enzima de conjugare a ubiquitinei
00:19:50.00la un reziduu de lizină din proteina substrat,
00:19:53.08generând un substrat ubiquitinat.
00:19:57.28Acum, acest proces are loc de mai multe ori,
00:20:00.02până când un lanț de ubiquitină este construit pe proteina substrat.
00:20:06.02Ceasta poate fi acum recunoscută de proteazomi pentru degradare.
00:20:10.18 Deci, având în vedere că aceste proteine Insig
00:20:12.26sunt necesare pentru degradarea reductazei,
00:20:15.08și că reductaza este de fapt degradată de proteazomi,
00:20:19.02întrebarea următoare este dacă reductaza este ubiquitinată?
00:20:23.20Această întrebare și-a găsit răspunsul în acest experiment
00:20:26.11prezentat în acest diapozitiv.
00:20:28.21 Deci, ceea ce am făcut în acest experiment este că am tratat celulele
00:20:31.15în absența și în prezența sterolilor
00:20:33.20și a inhibitorului de proteazom.
00:20:37.05După aceste tratamente,
00:20:39.11am imunoprecipitat reductaza
00:20:41.21și apoi sondăm aceste imunoprecipitate fie pentru reductaza totală,
00:20:20:43.20afișată pe panoul de jos,
00:20:45.18sau reductaza ubiquitinată.
00:20:49.07Așa că, după cum puteți vedea în primul culoar,
00:20:51.01chiar dacă reductaza este trasă în jos în aceste experimente,
00:20:55.11nu observăm nici o reactivitate cu ubiquitinarea.
00:20:58.14Cu toate acestea, sterolii fac ca reductaza să devină ubiquitinată.
00:21:03.09Și această ubiquitinare este semnificativ crescută
00:21:07.22dacă includem și inhibitori ai proteazomului.
00:21:09.27 Deci, ceea ce ne indică acest lucru este că sterolii
00:21:12.16într-adevăr, determină ca reductaza să devină ubiquitinată,
00:21:14.20și această proteină ubiquitinată este acum degradată de proteazomi,
00:21:17.18, așa cum indică stabilitatea reductazei ubiquitinate
00:21:21.21de către acești inhibitori ai proteazomului.
00:21:24.27 Următoarea noastră întrebare este,
00:21:27.07sunt Insigs necesare pentru această ubiquitinare indusă de sterol a reductazei?
00:21:32.16Și din nou, ne întoarcem la siARN-uri.
00:21:35.08Celulele au fost transfectate fie cu siARN-ul de control
00:21:38.18sau siARN-uri împotriva Insig-1 și -2.
00:21:41.03Apoi tratăm aceste celule în absența sau în prezența sterolilor,
00:21:43.20și apoi sondăm reductaza ubiquitinată.
00:21:47.16Și după cum puteți vedea în primele două benzi,
00:21:49.10reductaza este frumos ubiquitinată în prezența sterolilor,
00:21:52.08și în urma eliminării lui Insig-1 și Insig-2
00:21:56.02abolește complet această ubiquitinare.
00:22:01.01 Deci, acest lucru ne permite acum să umplem mai multe goluri în modelul nostru
00:22:04.07pentru ERAD mediată de Insig a HMG CoA reductazei.
00:22:09.14Acum, se pare că un subset de molecule Insig
00:22:12.00se asociază de fapt cu un complex E3/E2 ubiquitin ligază.
00:22:16.27Încă o dată, în prezența sterolilor,
00:22:20.15domeniul membranar al reductazei
00:22:23.03sensibilizează sterolul,
00:22:24.25și această sensibilizare face ca reductaza să se lege de Insigs,
00:22:27.28și bineînțeles aceste Insigs
00:22:31.13poate face legătura între reductază și complexul E3/E2 ubiquitin ligază.
00:22:36.26Această legătură duce apoi la ubiquitinarea reductazei
00:22:40.00la două reziduuri de lizină din domeniul membranar.
00:22:43.17Și această ubiquitinare determină apoi ca reductaza
00:22:46.17să fie îndepărtată din membrana ER
00:22:50.09și ulterior degradată de proteazomi,
00:22:52.22prin intermediul unui proces pe care nu suntem complet…
00:22:55.07prin intermediul unui proces care nu este complet înțeles.
00:23:00.20 Deci, pe scurt, v-am spus astăzi
00:23:03.16-leacă HMG CoA reductaza este enzima care limitează viteza
00:23:06.07în calea de sinteză a colesterolului,
00:23:08.01și că este o țintă a acestor medicamente cu statine care scad colesterolul.
00:23:11.26Reductaza este controlată printr-un sistem de reglare foarte complex
00:23:15.16feedback
00:23:18.01care este mediat de colesterol și alte tipuri de steroli.
00:23:20.18Și că statinele perturbă acest sistem de reglare prin feedback,
00:23:24.03în parte prin blocarea acestei ubiquitinări mediate de Insig
00:23:27.10și ERAD a HMG CoA reductazei.

.