Proprietățile fizico-chimice ale nanoemulsiilor pe bază de lecitină obținute prin emulsificare spontană sau omogenizare de înaltă presiune

ARTIGO

Proprietățile fizico-chimice ale nanoemulsiilor pe bază de lecitină obținute prin emulsificare spontană sau omogenizare de înaltă presiune

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nanoemulsiile compuse dintr-un miez de ulei de trigliceride cu lanț mediu stabilizat cu lecitină de rapiță sau de floarea-soarelui au fost preparate prin emulsificare spontană și omogenizare la presiune înaltă. Aceste nanoemulsiuni sunt comparate cu formulări stabilizate cu lecitină de ou. Nanoemulsiile obținute prin omogenizare la înaltă presiune prezintă picături de dimensiuni mai mari (230 până la 440 nm) în comparație cu cele obținute prin emulsificare spontană (190 până la 310 nm). Potențialele zeta ale emulsiilor au fost negative și sub -25 mV. Inversarea potențialului zeta a avut loc între pH 3,0 și 4,0. Rezultatele demonstrează fezabilitatea preparării emulsiilor lipidice care cuprind lecitine din semințe de rapiță sau floarea-soarelui prin emulsificare spontană și omogenizare la presiune înaltă.

Cuvinte cheie: nanoemulsie; lecitină; parenteral; omogenizare la presiune înaltă; emulsificare spontană.

INTRODUCERE

Un regim de nutriție parenterală este compus în principiu din macronutrienți (aminoacizi, carbohidrați și lipide) și micronutrienți (vitamine, electroliți și microelemente), sub prescripția medicului în funcție de starea, vârsta și greutatea pacientului.1 Macronutrienții lipidici, administrați sub formă de emulsii, sunt donatori de energie, furnizori de acizi grași esențiali și purtători de vitamine liposolubile. Acizii grași conținuți în aceste formulări au o importanță metabolică majoră, deoarece sunt componente ale membranei celulare și joacă roluri specifice în semnalizarea și transportul hormonal. Mai mult, ei sunt precursori ai prostaglandinelor, leucotrienilor, tromboxanilor și prostaciclinelor, care modulează procesele inflamatorii, funcția renală și agregarea plachetară.2 O deficiență de acizi grași esențiali la prematurii în timpul dezvoltării creierului are ca rezultat probleme de învățare și afectarea funcției vizuale, care pot fi ireversibile, chiar dacă mai târziu în dezvoltare se asigură o dietă adecvată care conține acizi grași.2

Emulsiile lipidice parentale sunt sisteme eterogene, constituite dintr-o fază uleioasă dispersată omogen într-o fază apoasă (dispersant), prin prezența unui emulgator. O dimensiune mică a picăturilor, de obicei între 200 și 500 nm, caracterizează formulările, din cauza riscului de embolie datorat utilizării unor particule mai mari. Emulsiile trebuie să prezinte, de asemenea, un pH compatibil din punct de vedere fiziologic (în jur de 7), izotonicitate, vâscozitate scăzută și un potențial zeta ridicat (în modul), pentru a preveni apariția fenomenelor de instabilitate.3

Nanoemulsiile lipidice sunt utilizate în mod obișnuit în amestecurile de nutriție parenterală totală, cunoscute sub numele de sisteme 3 în 1, în care toți macronutrienții și micronutrienții sunt adăugați într-o pungă de etilvinilacetat (EVA). Cu toate acestea, aceste amestecuri se confruntă cu o anumită instabilitate fizică legată de prezența electroliților și a altor componente, care pot să precipite sau să interacționeze cu picăturile de emulsie. Precipitarea calciului și a fosfatului sunt raportate pe scară largă în literatura de specialitate. În plus, ionii divalenți (cum ar fi calciul și magneziul) pot interfera cu potențialul zeta al emulsiei și pot induce agregarea/flocalizarea picăturilor lipidice, urmată de coalescență. Acest fenomen este foarte grav, deoarece orice picătură cu diametrul mai mare de 5 µm care pătrunde în fluxul sanguin poate provoca o embolie grasă.4,5

Caracteristicile fizice și stabilitatea consecventă a emulsiilor lipidice sunt strâns legate de metoda de producție și de compoziția acestora.3,6 Metodele de producție sunt diverse și pot necesita mai mult de o etapă pentru a produce o emulsie cu o dimensiune redusă a picăturilor. Un omogenizator de mare viteză (Ultraturrax®) poate crea mai întâi o emulsie grosieră, de exemplu. Reducerea dimensiunii picăturilor poate fi realizată apoi prin omogenizare la presiune înaltă, microfluidizare sau ultrasonare.7-9 Printre metodele care nu necesită tratare prealabilă se numără emulsificarea spontană, utilizată în principal în studiile de formulare și ușor de realizat la scară de laborator, deoarece nu este necesară utilizarea de echipamente sofisticate.10

Tabelul 1 prezintă compoziția emulsiilor lipidice intravenoase tipice disponibile în comerț. În afară de componentele descrise, formulările trebuie să îndeplinească cerințele pentru produsele injectabile.11

Faza uleioasă a emulsiilor parenterale este compusă din trigliceride cu lanț lung (LCT), care pot fi combinate cu trigliceride cu lanț mediu (MCT), așa cum se arată în tabelul 1. LCT cuprind o mare varietate de uleiuri, cum ar fi uleiul de floarea-soarelui, de ricin, de măsline sau, mai frecvent, de soia. Aceste uleiuri conțin toate lanțuri de acizi grași mai lungi de 12 atomi de carbon. MCT se obțin prin esterificarea acizilor grași din uleiul de cocos. Emulgatorii de elecție pentru stabilizarea emulsiilor injectabile sunt lecitinele, deoarece sunt biocompatibile și biodegradabile. Lecitinele sunt amestecuri naturale de fosfolipide polare și neutre, obținute din surse animale sau vegetale.12 Compoziția fosfolipidică a lecitinelor din surse vegetale poate fi variabilă datorită extracției, culturii și altor condiții de procesare.13 Acestea conțin în principal fosfolipide amfoterice, cum ar fi fosfatidilcolina și fosfatidiletanolamina, dar pot fi prezente și fosfolipide negative.

Emulsiile lipidice disponibile în comerț pentru nutriția parenterală sunt cel mai adesea compuse din lecitină din gălbenuș de ou sau, rareori, din lecitină din soia (Solipid® E&S). În ciuda numeroaselor beneficii ale suplimentării cu lipide, există rapoarte privind efectele clinice adverse legate de suplimentarea pe termen lung, din cauza limitărilor metabolice și a reacțiilor imune la pacienții aflați în stare critică.14,15 S-a raportat că reacțiile adverse la emulsiile lipidice parenterale sunt legate de prezența lecitinei din soia și a lecitinei din gălbenuș de ou.16-18 Interacțiunile alergice medicamentoase-alimentare pot duce la o serie de reacții adverse, de la tulburări gastrointestinale până la anafilaxie.19

În acest context, continuă căutarea de materii prime alternative pentru a găsi înlocuitori hipoalergenici care să fie mai siguri pentru administrarea parenterală la pacienți. Această lucrare prioritizează căutarea unor lecitine diferite cu scopul de a găsi noi alternative pentru emulsiile lipidice destinate nutriției parenterale, sau chiar ca purtători de medicamente, pentru a oferi cele mai sigure opțiuni pacienților (în special prematurilor) cu hipersensibilitate la emulgatorii pe bază de ouă sau soia. Am căutat să dezvoltăm nanoemulsiuni lipidice parenterale stabilizate cu lecitină de rapiță sau de floarea-soarelui și le-am comparat cu nanoemulsiile care conțin lecitină de ou. În plus, prepararea prin emulsificare spontană este comparată cu omogenizarea la presiune înaltă, utilizată în mod obișnuit pentru producția industrială de emulsii lipidice parenterale.

MATERIALE ȘI METODE

Produse chimice și reactivi

MCT, ulei de soia și lecitină de gălbenuș de ou (Lipoid E80®), de rapiță (Lipoid R100®) și de floarea-soarelui (Lipoid H100®) au fost obținute de la Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germania), care a donat cu amabilitate lecitinele de rapiță și de floarea-soarelui. Glicerolul și etanolul au fost obținute de la Merck (Brazilia) și, respectiv, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Apa ultrapură a fost obținută dintr-un aparat Milli-Q® (Millipore, Billerica, SUA).

Prepararea nanoemulsiilor

Emulsiile lipidice au fost preparate în triplu exemplar prin două metode: emulsificare spontană și omogenizare de înaltă presiune. Formulările obținute prin emulsificare spontană au fost preparate în conformitate cu o procedură descrisă anterior.10,20 Pe scurt, uleiul de soia a fost amestecat cu MCT, lecitină și etanol. Glicerolul a fost dizolvat în apă, în care faza etanolică a fost adăugată lent sub agitare magnetică moderată timp de 30 min. Solventul a fost apoi eliminat prin distilare sub presiune redusă într-un evaporator rotativ. Formulările obținute prin omogenizare la presiune înaltă au fost preparate așa cum a fost descris anterior.21 În primul rând, lecitina a fost dispersată în apă care conținea glicerol și amestecată sub agitare magnetică la 40 ºC, până când s-a obținut o fază apoasă omogenă. Faza uleioasă a fost alcătuită din ulei de soia și MCT. Ambele faze, ulei și apă, au fost amestecate sub agitare magnetică (15 min, la temperatura camerei) pentru a obține o emulsie grosieră. Emulsiile grosiere au fost apoi amestecate la 9500 rpm timp de 2 minute cu ajutorul unui mixer IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, SUA) pentru a forma preemulsii brute, care au fost supuse individual unei omogenizări de înaltă presiune (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canada) la 750 bar (10 000 psi) timp de 10 cicluri pentru a produce emulsia finală. Valoarea pH-ului tuturor formulărilor a fost ajustată la 8,0 cu o soluție de NaOH de 0,01 mol L-1 . Emulsiile au fost depozitate la 4 ºC. Formulările și constituenții acestora sunt prezentate în tabelul 2.

Caracterizarea fizico-chimică a nanoemulsiilor

Valorile pH-ului formulărilor au fost determinate direct în probe imediat după preparare, folosind un potențiometru calibrat (Digimed, São Paulo, Brazilia) la temperatura camerei. Dimensiunea medie a picăturilor și indicele de polidispersitate au fost măsurate prin spectroscopie de corelație fotonică (PCS), iar potențialul zeta a fost determinat prin mobilitate electroforetică, cu ajutorul unui Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, Marea Britanie) la 25 ºC. Pentru aceste măsurători, nanoemulsiile au fost diluate în soluție de NaCl de 1 mmol L-1 în intervalul de pH de la 2,0 la 8,0 unități. Vâscozitatea a fost evaluată prin vâscozitate capilară la 25 ºC (constanta vâscozimetrică, k = 0,0212), la 25 ± 0,1 ºC. S-a înregistrat timpul, în secunde, în care lichidul curge de la semnul superior la cel inferior într-un tub capilar. Toate formulările au fost analizate în triplu exemplar.

Analiză morfologică

Examinarea morfologică a fost realizată prin microscopie electronică de transmisie (TEM). O picătură din nanoemulsie a fost plasată pe o grilă de cupru acoperită cu carbon (200 mesh), colorată negativ cu o soluție de acetat de uranil 2,0 % și lăsată să se usuce timp de 24 de ore înainte de examinare. S-a folosit un instrument JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Japonia), care funcționează la 80 kV.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

În studiul de față, dezvoltăm emulsii lipidice destinate nutriției parenterale sau transportului de medicamente, stabilizate cu două lecitine obținute din surse vegetale (rapiță (R) și floarea-soarelui (S)), ca alternative la lecitina de gălbenuș de ou (E), un stabilizator tradițional pentru emulsii parenterale. Pentru a compara noile formulări cu cele tradiționale, toate celelalte componente ale emulsiei au fost menținute la concentrații similare cu cele ale emulsiilor lipidice din comerț. Această lucrare compară, de asemenea, două metode de producție diferite: emulsificarea spontană și omogenizarea la presiune înaltă.

Tabelul 3 prezintă proprietățile fizico-chimice ale nanoemulsiilor rezultate. Formulările obținute prin emulsificare spontană prezintă o dimensiune medie a picăturilor cuprinsă între 220 și 300 nm, determinată prin PCS. În teorie, acesta este un interval de stabilitate ridicată a emulsiei.11,22,23 Pe măsură ce dimensiunea picăturilor este redusă, rata de autodifuzie crește până la un punct în care picăturile foarte mici pot fi împiedicate să se spumeze prin amestecare difuzională.7,23 Nanoemulsiile care conțin lecitină din semințe de rapiță sau de floarea-soarelui prezintă o dimensiune medie a picăturilor mai mică în comparație cu cele care conțin lecitină din gălbenuș de ou. Rezultate similare au fost descrise pentru nanoemulsiile obținute prin aceeași metodă, compuse exclusiv din MCT, ca fază uleioasă, și stabilizate cu 2 % (m/m) de lecitină de ou.24 Pe baza acestor date, se poate concluziona că o concentrație de 1,2 % ar fi suficientă pentru a emulsiona amestecul de ulei de soia, MCT și apă. Cu toate acestea, deși s-a obținut o dimensiune mică a picăturilor și un indice de polidispersitate scăzut, emulsiile nu au rămas stabile din punct de vedere fizic mai mult de o săptămână după preparare, după care a putut fi observată vizual separarea fazelor (coalescență). Procesul de coalescență este un fenomen de instabilitate ireversibilă, deoarece picăturile de ulei își pierd interfețele și fuzionează în picături mai mari.25

Compoziția calitativă și cantitativă a nanoemulsiilor, pe lângă tipul de emulgator și metoda de emulsionare, poate influența în mod direct dimensiunea picăturilor.7,23 Prin urmare, a fost testată o a doua metodă de preparare a nanoemulsiilor. Omogenizarea de înaltă presiune este utilizată în mod obișnuit în industria farmaceutică pentru producerea unor astfel de formulări, deși la scară industrială. Dintre diferitele metode disponibile pentru emulsificare, această metodă este preferată datorită distrugerii eficiente a picăturilor. Aceasta este o metodă cu energie ridicată, în care reducerea dimensiunii se realizează prin forțarea unei emulsii grosiere sub presiune ridicată printr-o supapă de omogenizare, deformând și reducând astfel dimensiunea picăturilor.26 Emulsionarea spontană este o metodă cu costuri reduse, ușoară și fiabilă și este utilizată de obicei în studiile experimentale în locul unui omogenizator de înaltă presiune, care este mult mai complex și mai scump.

După cum se demonstrează în tabelul 3, omogenizarea de înaltă presiune a produs dimensiuni mai mari ale picăturilor în nanoemulsiile care cuprind lecitină de rapiță (296 ± 18 nm) sau de floarea-soarelui (417 ± 25 nm), în comparație cu metoda anterioară și în raport cu emulsiile de control cu lecitină de ou (243 ± 12 nm). Cu toate acestea, trebuie subliniat faptul că, chiar dacă omogenizarea la presiune înaltă a fost mai puțin eficientă în ceea ce privește distrugerea picăturilor, aceasta a conferit o mai mare stabilitate formulărilor. Spre deosebire de emulsiile obținute prin emulsionare spontană, acestea au fost stabile din punct de vedere vizual timp de cel puțin 30 de zile. Aceste rezultate confirmă importanța metodei de preparare în conferirea stabilității emulsiei.

Considerând aplicațiile intravenoase, distribuția dimensională a picăturilor de emulsie lipidică poate fi chiar mai importantă decât dimensiunea medie a picăturilor. O populație mică de picături mari de ulei poate fi suficientă pentru a provoca o embolie grasă la pacienți.4,5 Distribuțiile dimensiunilor picăturilor din formulele preparate sunt prezentate în figura 1.

În figura 1, se observă două populații în formulele compuse din lecitină de rapiță (obținută prin emulsificare spontană, figura 1C) și lecitină de floarea-soarelui (obținută fie prin emulsificare spontană, fie prin omogenizare la presiune înaltă, figurile 1E și 1F). Ca urmare, pentru aceste formulări se obține un indice de polidispersitate mai mare de 0,20.

Stabilitatea emulsiilor poate fi corelată cu compoziția și proprietățile peliculei interfaciale a acestora (lecitina), deoarece aceasta determină potențialul zeta al formulărilor și repulsia dintre picături, care este unul dintre mecanismele de stabilizare a emulsiilor.27 Lecitina este un amestec eterogen de fosfolipide; eterogenitatea sa este extrem de benefică datorită fluidității peliculei interfaciale, în comparație cu cea a unui fosfolipid pur.28 Principalele fosfolipide din amestecurile de lecitină sunt fosfatidilcolina și fosfatidiletanolamina, care nu sunt încărcate la pH-ul fiziologic (7,4). Pot fi prezente, de asemenea, cantități mai mici de lipide acide, cum ar fi fosfatidilinositolul, fosfatidilserina și fosfatidilglicerolul. Aceste lipide sunt ionizate la pH 7,0 și induc o sarcină de suprafață negativă pe picăturile de emulsie, ceea ce contribuie la stabilitatea lor. Orice substanță adăugată care interferează cu această sarcină este posibil să modifice stabilitatea sistemului.29 Chiar dacă lecitina de calitate parenterală este foarte purificată, ea conține totuși o cantitate mică de alte fosfolipide, așa cum se arată în tabelul 4, care descrie compoziția celor trei materii prime de lecitină utilizate în acest studiu.

După cum se demonstrează în tabelul 3, se observă un potențial zeta (valoarea modulului) mai mic pentru nanoemulsiile compuse din lecitină de rapiță sau de floarea-soarelui și obținute prin emulsificare spontană. Cu toate acestea, nu se observă diferențe în ceea ce privește potențialele zeta ale nanoemulsiilor produse prin omogenizare la presiune înaltă. Aceste rezultate indică faptul că principalul factor care afectează potențialul zeta este metoda de preparare. Deși grupul nostru a optimizat ambele metode, condițiile experimentale trebuie, de obicei, să fie ajustate, ținând cont de compoziția formulărilor. Parametrii, cum ar fi numărul de cicluri și presiunea, pot fi modificați pentru a obține proprietățile fizico-chimice dorite ale formulărilor finale.30,31

Potențialul zeta al nanoemulsiilor depinde, de asemenea, de ionizarea emulgatorului. O reducere a sarcinii rezultate (în modul) de la 40 mV la mai puțin de 25 mV poate crește ratele de floculare și coagulare.32 Potențialul zeta și dimensiunea medie a picăturilor de nanoemulsii compuse din diferite lecitine și produse prin diferite metode de emulsificare au fost evaluate la în intervalul de pH de la 2,0 la 8,0. Rezultatele sunt prezentate în figura 2.

Carcina de suprafață a tuturor formulărilor scade la zero între pH 3,0 și 4,0, așa cum s-a observat anterior pentru Intralipid®, o emulsie de trigliceride stabilizată cu lecitină de ou.25 Potențialul zeta depinde de pH, deoarece H+ este un ion care determină potențialul pe suprafețele fosfolipidice, cu un pH izoelectric de 3,1.33 O reducere a pH-ului are ca rezultat o scădere (mai puțin negativă) a potențialului zeta și o rată mai rapidă de floculare.34 Dimensiunea medie a picăturilor prezintă o mică creștere la pH-ul de inversare a potențialului zeta. Din figura 3 se poate concluziona că pH-ul nanoemulsiilor ar trebui să fie de preferință mai mare de 7,0, deoarece la această valoare a pH-ului se atinge un platou, unde se observă o repulsie maximă între picăturile de ulei.

În cele din urmă, morfologia picăturilor de ulei din nanoemulsiile preparate prin omogenizare la presiune înaltă a fost examinată prin TEM. Figura 3 relevă particule omogene și sferice, arătând că picăturile de emulsie au o dimensiune medie a picăturilor în intervalul nanometric. Aceste rezultate coroborează analiza anterioară a dimensiunii picăturilor.

Nanoemulsiile sunt sisteme cu vâscozitate scăzută și comportament newtonian. Evaluarea vâscozității emulsiei este crucială, deoarece administrarea intravenoasă a emulsiilor cu vâscozitate ridicată poate fi foarte dureroasă pentru pacient.23,32 Nanoemulsiile compuse din lecitine diferite prezintă vâscozități similare. Așa cum era de așteptat, nu se observă nicio relație între dimensiunea medie a picăturilor și vâscozitatea nanoemulsiilor, deoarece toate formulările conțineau doar 10 % miez de ulei.35 În schimb, se observă unele diferențe de vâscozitate pentru formulările obținute prin diferite metode de preparare: emulsificarea spontană a produs emulsii ușor mai vâscoase.

Este demn de menționat faptul că compozițiile nanoemulsiilor studiate în această lucrare se bazează pe cele ale nanoemulsiilor comerciale care utilizează lecitină de ou ca emulgator. Utilizarea unui alt emulgator poate necesita optimizarea concentrației acestuia și/sau a condițiilor de emulsionare. Nanoemulsiile injectabile comerciale compuse din lecitină de soia (Solipid®) necesită o concentrație de 1,5 % a emulgatorului, de exemplu. Uneori se utilizează co-emulsificatori suplimentari pentru a stabiliza emulsiile și pentru a favoriza o polidispersitate mai mică și picături mai mici. Cu toate acestea, aplicarea lor este limitată la emulsiile lipidice ca purtători de medicamente, deoarece în acest scop se administrează cantități mici de formulări: co-emulsificatorii nu sunt utilizați frecvent în emulsiile pentru nutriția parenterală, din cauza volumelor mari de aceste formulări administrate și a problemelor de siguranță, în special în cazul copiilor prematuri. Oleatul de sodiu este utilizat în mod obișnuit pentru stabilizarea formulărilor de emulsii lipidice injectabile,36 acționând ca agent tensioactiv anionic și agent de solubilizare.27

CONCLUZII

Rezultatele demonstrează fezabilitatea preparării emulsiilor lipidice injectabile compuse din lecitine de rapiță sau de floarea-soarelui prin emulsificare spontană și omogenizare la înaltă presiune, ca alternative la nanoemulsiile tradiționale de lecitină de ou pentru pacienții care sunt sensibili la derivații de ou. Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a optimiza condițiile de emulsionare pentru a îmbunătăți stabilitatea pe termen lung a formulărilor.

RECOMANDĂRI

Autorii doresc să mulțumească Consiliului Național pentru Dezvoltare Științifică și Tehnologică (CNPq) pentru sprijinul financiar și Lipoid GmbH pentru materialele furnizate.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na práctica clínica, ed. I, Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. În: Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, cap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. În Food Emulsifiers: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, cap. 5. 10.

13. Schneider, M. În: Lecitine: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. În Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, New Jersey, 2005, vol. 3, cap. 3. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. În Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, Cap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria și practica în industria farmaceutică; ed. a 3-a, Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf., B 2006,51,54.

Recepționat 03/02/2014; acceptat 17/04/2014; publicat pe web 15/07/2014

.