Izoenzima fosfatazei alcaline

Structura genomică, chimia proteinelor și enzimologia fosfatazei alcaline

ALP (fosfohidrolază ortofosforică-monoesterică, optimă alcalină, EC 3.1.3.1) se găsește în întreaga natură, în plante și animale (McComb et al., 1979). La om, patru izoenzime ALP sunt codificate de patru gene separate (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Trei dintre izoenzime au în esență o expresie specifică țesutului și sunt denumite ALP intestinală, placentară și a celulelor germinale (asemănătoare placentei). A patra izoenzimă ALP este exprimată la nivel ubiquitous și, prin urmare, este desemnată TNSALP (Stigbrand și Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Țesuturile scheletic, hepatic și renal sunt deosebit de bogate în TNSALP. Proprietățile fizico-chimice distincte (stabilitate termică, mobilitate electroforetică etc.) dintre ALPs purificate din oase, ficat și rinichi umani se pierd la expunerea la glicozide (Moss și Whitaker, 1985), iar TNSALP este, prin urmare, o familie de izoenzime „secundare” (le voi numi „izoforme”). Ele sunt codificate de aceeași genă, au o secvență polipeptidică identică și diferă doar prin modificări posttranslaționale care implică carbohidrați (Harris, 1980).

Simbolul de cartografiere a genei pentru TNSALP este ALPL („ALP-liver”), deși funcția izoformei hepatice a TNSALP nu este cunoscută (vezi mai târziu). ALPL este localizată aproape de vârful brațului scurt al cromozomului 1 (1p36.1-p34), în timp ce genele pentru ALP-urile intestinale, placentare și ale celulelor germinale se află la vârful brațului lung al cromozomului 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL pare să reprezinte gena ancestrală, în timp ce ALP-urile specifice țesuturilor s-au format probabil prin duplicarea genelor (Harris, 1990). ALPL este ceva mai mare de 50 kb și conține 12 exoni, dintre care 11 sunt traduși pentru a forma enzima matură care constă din 507 reziduuri de aminoacizi (Weiss et al., 1988b). Secvențele TATA și Sp1 pot fi elemente de reglare, dar expresia bazală pare să reflecte efectele promotorului „de menținere”, în timp ce expresia diferențială în diferite țesuturi poate fi mediată de un mecanism posttranscripțional (Kiledjian și Kadesch, 1990). ALPL are doi promotori și doi exoni 5′ necodificatori corespunzători, 1a și 1b. Exprimarea lor are ca rezultat două ARNm diferite cu regiuni netranslate 5′ diferite (Nosjean et al., 1997). Transcrierea are loc preferențial de la promotorul din amonte (1a) în osteoblaste și de la promotorul din aval (1b) în ficat și rinichi (Millán, 2006).

Genele ALP specifice țesuturilor sunt mai mici decât ALPL, în principal datorită intronilor mai scurți. Secvențele de aminoacizi deduse din cADN-urile lor sugerează o identitate pozițională de 87% între ALP placentară și intestinală, dar numai 50%-60% identitate între ALP specifice țesuturilor și TNSALP (Harris, 1990).

Secvența de reziduuri de aminoacizi a TNSALP indică cinci potențiale situsuri de glicozilare N-legate (Weiss et al., 1988). N-glicozilarea este necesară pentru activitatea catalitică. O-glicozilarea caracterizează izoforma osoasă, dar nu și pe cea hepatică (Nosjean et al., 1997).

În anul 2000, structura cristalină pentru ALP placentară umană a fost delimitată la o rezoluție de 1,8Å (Le Due et al., 2000). Situl activ al TNSALP ar deriva dintr-o secvență nucleotidică conservată în ALPs în întreaga natură (Henthorn și Whyte, 1992), reflectă șase exoni și cuprinde 15 reziduuri de aminoacizi (Zurutuza et al., 1999).

ALPs sunt Zn++-metaloenzime (McComb et al., 1979). Activitatea catalitică necesită o configurație multimerică de subunități identice, fiecare monomer având un situs activ și doi atomi de Zn++ care stabilizează structura terțiară (Kim și Wycoff, 1991).

ALP-urile sunt în general considerate homodimerice în circulație (McComb et al., 1979). TNSALP, în forma sa dimerică simetrică, are o topologie αβ pentru fiecare subunitate, incluzând o foaie β cu zece fire în centrul său (Hoylaerts și Millán, 1991). Cu toate acestea, în țesuturi, ALP-urile sunt legate (vezi mai târziu) de suprafețele celulare, probabil sub formă de homotetramere (Fedde et al., 1988).

In vitro, ALP-urile au specificități largi de substrat și pH-uri optime care depind de tipul și concentrația fosfocompozitului supus catalizei (McComb et al., 1979). Activitatea catalitică necesită Mg++ ca și cofactor (McComb et al., 1979). PPi, precum și fosfoesterii pot fi hidrolizați (Xu et al., 1991). Reacția implică fosforilarea-defosforilarea unui reziduu de serină. Disocierea Pi legat covalent pare să fie etapa care limitează viteza. De fapt, Pi este un puternic inhibitor competitiv al ALP (McComb et al., 1979; Kim și Wyckoff, 1991; Coburn et al., 1998). Cu toate acestea, este posibil, de asemenea, ca Pi să stabilizeze enzima (Farley, 1991).

Continuă să existe incertitudini cu privire la biosinteza ALP în organismele superioare. Secvențele genice ale izoenzimelor ALP umane indică faptul că polipeptidele născute au o scurtă secvență semnal de 17-21 de resturi de aminoacizi (Harris, 1990) și un domeniu hidrofob la extremitatea lor carboxil terminală (Weiss et al., 1988b). Degradarea intracelulară a ALP-urilor poate implica proteazomii (Cai et al., 1998). Cu toate acestea, aceste ALP se leagă de suprafața externă a membranelor plasmatice legate de grupul polar de cap al unei fracțiuni fosfatidilinositol-glican (Whyte et al., 1988; Whyte, 1994) și pot fi eliberate de fosfolipaza specifică fosfatidilinositolului (Fedde et al., 1988). Cu toate acestea, interacțiunea lor precisă cu fosfatidilinositolul poate diferi între izoenzimele ALP (Seetharam et al., 1987).

Lipid free ALP este fracțiunea care se găsește în mod normal în circulație. Cu toate acestea, mecanismele de eliberare a ALP de pe suprafețele celulare nu sunt cunoscute. Procesul ar putea implica o fosfatidază de tip C sau D, acțiunea detergentului, proteoliza, fracționarea membranei sau lipoliza (Alpers și colab., 1990).

La bărbații și femeile sănătoase, aproape toată activitatea ALP din ser sau plasmă provine din cantități aproximativ egale de izoforme osoase și hepatice ale TNSALP (Millán și colab., 1980). Sugarii și copiii, în special nou-născuții și adolescenții, au niveluri mai ridicate în sânge ale izoformei osoase (McComb et al., 1979). Unele persoane cu grupe sanguine B și O, care sunt „secretoare”, cresc cantitatea mică de ALP intestinală în circulație după ce au ingerat o masă grasă (Langman și colab., 1966; McComb și colab., 1979). În mod obișnuit, însă, ALP intestinală contribuie doar cu câteva procente la activitatea ALP serică totală (maximum 20%) (McComb et al., 1979; Mulivor et al., 1985). ALP placentară este de obicei exprimată și circulă numai în ultimul trimestru de sarcină (Birkett et al., 1966). Cu toate acestea, diverse tipuri de cancer eliberează în sânge ALP placentară sau de celule germinale („asemănătoare cu cea placentară”) (Millán, 1988). Eliminarea ALP circulantă, ca și în cazul multor alte glicoproteine, implică probabil absorbția și degradarea de către ficat (Young et al., 1984).

.