ISH: protocol de hibridizare in situ

Stocarea probelor

Prezervarea ARN
Prezervarea ARN este îngreunată de prezența enzimei RNază. Această enzimă se găsește pe sticlărie, în reactivi și pe operatori și pe hainele acestora. RNaza distruge rapid orice ARN din celulă sau sonda de ARN în sine, astfel încât utilizatorii trebuie să se asigure că utilizează tehnici, mănuși și soluții sterile pentru a preveni contaminarea cu RNază a sondei sau a ARN-ului tisular.

Stocarea generală a probelor atunci când se utilizează secțiuni congelate
Pentru cele mai bune rezultate pe lamele mai vechi, nu păstrați lamelele uscate la temperatura camerei. În schimb, păstrați-le în etanol 100% la -20°C sau într-o cutie de plastic acoperită cu folie saran la -20°C sau -80°C. O astfel de depozitare conservă lamelele timp de mai mulți ani.

Alegerea sondei

Sondele de ARN

Sondele de ARN trebuie să aibă o lungime de 250-1.500 de baze; sondele de aproximativ 800 de baze prezintă cea mai mare sensibilitate și specificitate. Șabloanele de transcripție ar trebui să permită transcrierea atât a ARN-urilor sondă (filament antisens), cât și a ARN-urilor de control negativ (filament sens). Clonați într-un vector cu promotori opozabili pentru a realiza acest lucru. Șabloanele circulare trebuie să fie liniarizate înainte de a realiza o sondă, deși pot fi utilizate și șabloane PCR.

Sondele de ADN

Sondele de ADN oferă o sensibilitate ridicată pentru hibridizarea in situ. Ele nu se hibridizează la fel de puternic cu moleculele de ARNm țintă în comparație cu sondele de ARN, astfel încât formaldehida nu ar trebui să fie utilizată în spălările ulterioare hibridizării.

Specificitatea sondei este importantă. Dacă se cunoaște secvența nucleotidică exactă a ARNm sau ADN din celulă, se poate proiecta o sondă complementară precisă. Dacă >5% din perechile de baze nu sunt complementare, sonda se va hibridiza doar vag cu secvența țintă. Acest lucru înseamnă că este mai probabil ca sonda să fie spălată în timpul etapelor de spălare și de detectare și este posibil să nu fie detectată corect.

Protocol de hibridizare in situ cu sonde de ARN marcate cu Digoxigenină (DIG)

Acest protocol descrie utilizarea de sonde de ARN monocatenar marcate cu DIG pentru a detecta expresia genei de interes în secțiuni încorporate în parafină.

1) Deparafinarea

Pentru secțiuni congelate, începeți la pasul 2. Dacă se utilizează secțiuni fixate în formaldehidă și încorporate în parafină, continuați cu acest pas.

Înainte de a continua, lamelele trebuie să fie deparafinate și rehidratate. Îndepărtarea incompletă a parafinei poate cauza o colorare slabă a secțiunii.

Puneți lamelele într-un suport și efectuați următoarele spălări:

• Xilen: 2×3 min
• Xilen 1:1 cu etanol 100%: 3 min
• Ethanol 100%: 2×3 min
• Ethanol 95%: 2×3 min
• Ethanol 95%: 3 min
• 70 % etanol: 3 min
• 50 % etanol: 3 min
• Rezolvați cu apă rece de la robinet

Păstrați lamelele în apă de la robinet până la recuperarea antigenului. Din acest moment, lamelele nu se pot usca, deoarece acest lucru va cauza legarea nespecifică a anticorpilor și o colorare de fond mare.

2) Recuperarea antigenului

Digerarea cu 20 µg/mL de proteinază K în Tris 50 mM preîncălzit timp de 10-20 min la 37°C. Timpul de incubare și concentrația de proteinază K pot necesita optimizare.

Recomandăm să încercați un experiment de titrare a proteinazei K pentru a determina condițiile optime. O digestie insuficientă va reduce semnalul de hibridizare, iar o digestie excesivă va duce la o morfologie slabă a țesutului, ceea ce va face localizarea semnalului de hibridizare foarte dificilă. Concentrația optimă de proteinază K va varia în funcție de tipul de țesut, durata de fixare și dimensiunea țesutului.

3) Clătiți lamelele de 5 ori în apă distilată.
4) Scufundați lamelele în acid acetic 20% (v/v) rece ca gheața timp de 20 sec. Acest lucru permeabilizează celulele pentru a permite accesul la sondă și la anticorp.
5) Se deshidratează lamelele prin spălare timp de aproximativ 1 min pe spălare în etanol 70%, etanol 95% și etanol 100%, apoi se usucă la aer.
6) Se adaugă 100 µL de soluție de hibridizare pe fiecare lamă.

Soluție de sare (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Soluția lui Denhardt (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polivinilpirolidină)
• 10 g albumină serică bovină (BSA)

.

• 500 ml dH2O steril

7) Incubați lamelele timp de 1 h într-o cameră de hibridizare umidificată la temperatura de hibridizare dorită. Temperaturile tipice de hibridizare variază între 55-62°C.
8) Diluați sondele în soluție de hibridizare în tuburi PCR. Încălziți la 95°C timp de 2 min într-un bloc PCR pentru a denatura sonda de ARN sau ADN. Răciți imediat la gheață pentru a preveni reanalizarea.
9) Scurgeți soluția de hibridizare. Adăugați 50-100 μL de sondă diluată pe secțiune, acoperind întreaga probă. Incubați în camera de hibridizare umidificată la 65°C peste noapte. Acoperiți proba cu o lamelă de acoperire pentru a preveni evaporarea.

În timpul acestei etape, sonda ARN se va hibridiza cu ARNm corespunzător, sau sonda ADN se va hibridiza cu ADN-ul celular corespunzător. Optimizați temperatura de hibridizare în funcție de secvența sondei utilizate, precum și de tipul de celulă sau țesut. Această temperatură trebuie optimizată pentru fiecare tip de țesut analizat.

Temperatura optimă de hibridizare pentru sonde depinde de procentul de baze prezente în secvența țintă. Concentrația de citozină și guanină din secvență sunt factori importanți.

10) Spălări de rigoare

Parametrii soluției, cum ar fi temperatura, concentrația de sare și detergent, pot fi manipulați pentru a elimina interacțiunile nespecifice.

Pentru a pregăti 1 L de citrat de sodiu salin 20x (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g citrat de sodiu

800 ml dH2O steril

• Ajustați pH-ul la 5 folosind acid citric, umpleți până la 1 L și autoclavați

Spălați 1

• 50% formamidă în 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Spălați excesul de sondă și tamponul de hibridizare cu temperaturi mai ridicate (până la 65°C) pentru perioade scurte de timp. Dacă se lasă prea mult timp, aceasta poate spăla prea mult din ARN/ADN-ul sondei hibridizate.

Spălare 2

• 0,1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Acest pas elimină hibridizarea nespecifică și/sau repetitivă a ADN/ARN.

Să urmați aceste indicații pentru a optimiza temperatura și concentrația de sare pentru spălările de stringență:

• Pentru sondele ADN/ARN foarte scurte (0.5-3 kb) sau sonde foarte complexe, temperatura de spălare ar trebui să fie mai scăzută (până la 45°C) și stringența mai mică (1-2x SSC).
• Pentru sonde cu un singur locus sau sonde mari, temperatura ar trebui să fie în jur de 65°C și stringența ridicată (sub 0.5x SSC).
• Temperatura și stringența trebuie să fie cele mai ridicate pentru sondele repetitive (cum ar fi repetările alfa-sateliților).

11) Spălați de două ori în MABT (tampon de acid maleic conținând Tween 20) timp de 30 min la temperatura camerei. MABT este mai blând decât PBS și este mai potrivit pentru detectarea acizilor nucleici.

Pentru a pregăti un stoc 5x de MABT

• 58 g de acid maleic
• 43,5 g de NaCl
• 55 g de Tween-20
• 900 ml de apă

Aducem pH-ul la 7,5 prin adăugarea de bază Tris. Vor fi necesare aproximativ 100 g. Aduceți volumul final la 1 L.

12) Uscați lamelele.
13) Transferați într-o cameră umidificată și adăugați 200 µL de tampon de blocare la fiecare secțiune (MABT + 2% BSA, lapte sau ser). Se blochează timp de 1-2 h la temperatura camerei.
14) Scurgeți tamponul de blocare. Adăugați anticorpul anti-etichetă la diluția necesară în tamponul de blocaj. Verificați fișa tehnică a anticorpului pentru o concentrație/diluție recomandată. Incubați timp de 1-2 h la temperatura camerei.
15) Spălați lamelele de 5×10 min cu MABT la temperatura camerei.
16) Spălați lamelele de 2×10 min fiecare la temperatura camerei cu tampon de precolorare (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Pentru detectarea fluorescenței, treceți la etapa 18. Pentru alte forme de detecție, readuceți lamelele în camera umidificată și urmați instrucțiunile producătorului pentru dezvoltarea culorii.

18) Clătiți lamelele în apă distilată.
19) Uscați lamelele la aer timp de 30 min. Spălați-le în etanol 100% și uscați-le bine la aer.
20) Montați-le folosind soluția de montare DePeX.

.