Ingineria ribozomilor relevă importanța autonomiei ARNr 5S pentru asamblarea ribozomilor

Construcția plasmidelor

Toate plasmidele au fost construite prin asamblare Gibson50, cu coloanele vertebrale plasmidice pregătite prin PCR inversă sau digestie cu nucleaze de restricție, iar inserțiile au fost generate prin PCR sau sintetizate chimic de Integrated DNA Technologies. Plasmidele care codifică ARNr au fost inițial electroporate în celule E. coli POP2136 (genotipurile tuturor tulpinilor utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul suplimentar 1), iar transformanții au fost recuperați pe plăci LB suplimentate cu antibioticele corespunzătoare; plăcile au fost incubate la 30 °C pentru a preveni exprimarea genelor ARNr controlate de promotorul lambda PL31. Toate celelalte plasmide au fost transformate și propagate în tulpina E. coli JM109 și cultivate la 37 °C în mediu LB suplimentat, la nevoie, cu 100 μg/ml de ampicilină (Amp), 50 μg/ml de kanamicină (Kan) sau 50 μg/ml de spectinomicină (Spc).

Construcția plasmidului ptRNA100

Suportul plasmidic, inclusiv originea de replicare pA15 și gena de rezistență Spc, a fost amplificat prin PCR din plasmidul ptRNA6751 cu ajutorul amorselor NA1 și NA2 (toate amorsele sunt enumerate în tabelul suplimentar 4). Grupul de gene tRNA (care codifică tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp și tRNAAsp), sub controlul promotorului Ptac și al terminatorului T1, a fost sintetizat sub formă de gBlock (Integrated DNA Technology). Plasmidul pTRNA100 a fost generat prin asamblare Gibson. Structura plasmidului a fost verificată prin digestie de restricție, iar prezența clusterului tRNA născut în plasmidă a fost confirmată prin amplificare PCR cu ajutorul primerilor NA3 și NA4 și prin secvențiere.

Construcția plasmidelor pDH42, pDH39 și pCH84

Construcțiile care poartă gena ARNr 23S-cp5S hibrid au fost generate pe baza plasmidului pAM55229, care găzduiește operonul ARNr rrnB al E. coli. Gena ARNr 5S a fost ștearsă prin PCR inversă folosind primerii NA17 ș i NA18, care adăpostesc situsul de restricție Xho1, digestia produsului PCR de către Xho1 ș i ligatura ADN. Mutația de rezistență la Ery A2058G a fost apoi introdusă în gena 23S ARNr prin mutageneză dirijată pe site cu ajutorul kitului de mutageneză dirijată pe site QuikChange Lightning Multi (Agilent Technologies) cu primerul NA7. Plasmidul rezultat, pAM552Δ5S, a fost utilizat pentru a introduce genele ARNr cp5S cu linkeri în trei locații diferite din gena ARNr 23S.

Prepararea secvenței ADNr cp5S pentru integrarea în ADNr 23S a fost efectuată într-o singură reacție PCR în care au fost utilizate perechile de amorsă NA8/NA9 (pentru construcțiile DH39 și DH42) sau NA26 și NA27 (pentru construcția CH84) (100 nM fiecare) care au găzduit inserția ADNr cp5S, au fost combinate cu perechi de amorsă (250 nM fiecare) care introduc legături de secvență aleatoare, cu dimensiuni cuprinse între 0 și 3 nt, la joncțiunile „stânga” și „dreapta” 23S-cp5S, după cum urmează: NA10-NA13 și NA14-NA17 pentru DH39; NA18-NA21 și NA22-NA25 pentru DH42; NA28-NA31 și NA32-NA35 pentru CH84.

Pentru generarea bibliotecilor de plasmidă DH39, DH42 și CH84, plasmidul pAM552Δ5S a fost deschis prin PCR inversată folosind perechile de primer NA36/NA37, NA38/NA39 și, respectiv, NA40/NA41. Inserțiile de ADNr cp5S au fost introduse în bazele plasmidice rezultate, amplificate prin PCR, prin reacții de asamblare Gibson. Produsele de reacție au fost transformate în celule E. coli POP2136 prin electroporare, iar transformanții au fost recuperați pe plăci de agar LB/Amp cultivate la 30 °C (condiții care împiedică exprimarea ARNr plasmidic). Fiecare bibliotecă a avut cel puțin de 3 ori mai multe clone decât diversitatea teoretică estimată de 7225 de variante. Coloniile au fost spălate de pe plăcile LB, bibliotecile de plasmide au fost extrase și depozitate.

Înlocuirea ptARN67 cu ptARN100

S-a obținut E. tulpina SQ171 de Coli care este lipsită de alele cromozomiale de ARNr și care poartă plasmidul pCSacB ca sursă a genelor de ARNr și plasmidul ptRNA67 ca sursă a genelor de ARNt cromozomiale lipsă32,52, a fost utilizată ca tulpină gazdă inițială. Pentru a înlocui plasmidul ptRNA67 cu ptRNA100, celulele SQ171 au fost mai întâi transformate cu ptRNA-Amp (furnizat de Michael O’Connor, University of Missouri, Kansas City), care seamănă cu ptRNA67, dar conferă rezistență la Amp și conține originea de replicare pBR322. Transformanții au fost apoi vindecați de plasmidul ptRNA67 prin trecerea în mediu LB suplimentat cu Amp și Kan pentru ~100 de generații. Pierderea plasmidului ptRNA67 a fost verificată prin sensibilitatea clonelor la Spc în urma replicării. Tulpina rezultată a fost apoi transformată cu ptRNA100 și plasată pe mediu LB agar suplimentat cu Spc și Kan. Transformanții au fost trecuți timp de ~100 de generații în mediu LB suplimentat cu Spc și Kan. Pierderea plasmidei ptRNA-Amp a fost verificată prin sensibilitatea clonelor individuale la Amp, așa cum a fost evidențiată prin replicarea pe placă. Prezența ptRNA100 și lipsa ptRNA67 au fost verificate suplimentar prin PCR și digestia de restricție a plasmidelor totale preparate din clona rezultată.

Inactivarea genei recA în celulele SQ171/ptRNA100

Gena recA din tulpina SQ171/ptRNA100 a fost inactivată prin transducția cu fagul P1. Tulpina donatoare BW25113 recA::cat a fost mai întâi preparată prin procedura convențională de recombinare52 folosind caseta de rezistență la cloramfenicol (Chl) din plasmidă pKD352. Caseta a fost amplificată prin PCR cu ajutorul amorselor NA42 și NA43. Fragmentul PCR a fost transformat în tulpina BW25113 purtătoare a plasmidului pDK46 care exprimă recombinaza roșie. După ce s-a verificat integrarea casetei cat ș i după ce pKD46 a fost vindecat, celulele BW25113 recA::cat au fost folosite ca donatori pentru transducția fagică. Transducția fagilor P1 a fost efectuată în conformitate cu protocolul standard53 , cu excepția faptului că incubarea de recuperare a fost prelungită de la 1 la 3 ore înainte de a pune transductorii pe plăci LB/agar suplimentate cu Kan, Spc și 15 μg/ml Chl. Pentru excizia casetei cat, tulpina rezultată a fost transformată cu plasmidul pZFLP-TetR care codifică enzima flipază, iar transformanții au fost plastificați pe placa LB/agar suplimentată cu Kan, Spc și 2,5 μg/ml de tetraciclină (Tet). Eliminarea genei cat a fost confirmată prin PCR și prin sensibilitatea la Chl a clonelor. Apoi, plasmidul pZFLP-TetR a fost eliminat prin trecerea celulelor timp de ~100 de generații în mediu LB suplimentat cu Kan, Spc, iar clonele rezultate au fost testate pentru sensibilitatea la Tet. Tulpina rezultată a fost denumită SQA18 (tabelul suplimentar 1).

Introducerea bibliotecilor 23S-cp5S în celulele SQA18

Bibliotecile de plasmide extrase din celulele POP2136 au fost transformate în celulele SQA18 prin electroporare. După 2 h de recuperare la 37 °C, transformanții au fost plasați pe plăci de agar LB/Amp, care au fost apoi incubate peste noapte la 37 °C. Coloniile au fost spălate de pe plăcile de agar și 0,01 A600 (~106 celule) au fost plasate într-un volum de 2 ml de mediu LB suplimentat cu 150 μg/mL Ery și 0,25 % sucroză. După o creștere de 16 ore, celulele au fost plasate pe plăci de agar conținând Amp, 1 mg/ml Ery și 5% zaharoză. Plăcile au fost incubate timp de 48 de ore la 37 °C. Au apărut colonii viabile cu bibliotecile DH42 și CH84, dar nu și cu biblioteca DH39. Câteva dintre coloniile care au apărut pe plăci au fost testate prin PCR de colonii pentru prezența ADNr 23S-cp5S, utilizând perechile de amorsă NA44/NA45 pentru construcția DH42 și amorsă NA46/NA47 pentru construcția CH84. Absența genei wt 5S ARNr 5S a fost verificată prin PCR în colonii cu ajutorul primerilor NA48 ș i NA49.

Selectarea linkerilor preferați pentru ARNr 23S-cp5S

Librăria totală de plasmide DH42 izolată din celulele POP2136 a fost transformată în celule SQA18 ș i plasmată pe plăci LB/Amp, după cum s-a descris mai sus. Coloniile (~50.000) au fost spălate de pe placă și plasmidul total a fost extras din ~109 celule și utilizat ca bibliotecă de preselecție.

Aproximativ 109 celule au fost apoi supuse procedurii de schimb de plasmidă. Mai exact, acestea au fost plasate într-un volum de 20 ml de mediu LB suplimentat cu 150 μg/mL Ery și 0,25% zaharoză. După o creștere de 4 ore, celulele au fost plasate pe plăci de agar care conțineau Amp, 1 mg/ml Ery și 5% zaharoză. Plăcile au fost incubate timp de 48 de ore la 37 °C. Coloniile (~50.000) au fost spălate de pe placă. Plasmidul total extras din aceste celule a reprezentat biblioteca de post-selecție.

ADNr cp5S flancat de secvențe de ADNr 23S și de linkeri a fost amplificat prin PCR din preparatele de plasmidă din bibliotecile de preselecție și de post-selecție folosind primerii NA50 și NA51. Bibliotecile PCR au fost supuse secvențierii de generație următoare.

Factorul de îmbogățire fold pentru fiecare combinație de linkeri a fost calculat folosind următoarea procedură. După tăierea adaptorului, întreaga secvență de ARNr cp5S, cu excepția celor 4 nucleotide terminale de la fiecare capăt, a fost eliminată pentru a reduce numărul de variante de secvențe false care au apărut din cauza erorilor de secvențiere în cadrul secvenței de codificare 5S. Motivele de secvență rezultate au fost numărate în bibliotecile de pre-selecție și post-selecție și s-a calculat frecvența fracțiunii fiecărei variante de linker.

Prepararea ARN celular total

Culturi nocturne ale tulpinilor E. coli POP2136 sau SQA18 au fost cultivate la 30 °C, respectiv 37 °C, în mediu LB/Amp. Culturile au fost diluate 1:100 în 2 ml de mediu proaspăt și cultivate la 37 °C până la A600 ~ 0,5. Celulele au fost recoltate prin centrifugare (5000 × g, 1 minut) și resuspendate în 100 μl de tampon de liză. După adăugarea ulterioară a 400 μl de tampon de extracție (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) și incubarea timp de 5 minute la temperatura camerei, ARN-ul total a fost extras prin extracție cu fenol/cloroformă. ARN-ul a fost precipitat în etanol, peletul de ARN a fost spălat cu 1 ml de etanol 70%, dizolvat în apă fără RNază, congelat instantaneu și depozitat la -80 °C.

Analiză în gradient de zaharoză a ribozomilor și polisomilor

Culturile de E. coli de peste noapte au fost diluate în 50 ml de mediu LB/Amp și crescute până la A600 ~ 0,5. Chl a fost adăugat la o concentrație finală de 125 μg/ml și, după 5 min de incubare, celulele au fost recoltate prin centrifugare (5000 × g, 10 min, 4 °C). Peletele de celule au fost resuspendate în tampon de liză rece ca gheața (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml de lizozimă, 0,25 % dezoxicolat de sodiu și 2U de DNază I fără RNază RQ1). Celulele au fost lizate prin trei cicluri de congelare-dezghețare. Lizații au fost clarificați prin centrifugare (20 000 × g, 15 minute, 4 °C) și 20 unități A260 de lizat au fost încărcate pe 12 ml de gradient liniar de zaharoză 10-40% în tampon 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoetanol. Gradientele au fost centrifugate (3 h, 4 °C) la 39 000 rpm într-un rotor SW41 (Beckman). Gradientele au fost fracționate cu ajutorul unui fracționator (BioComp), înregistrându-se absorbția la 254 nm. Fracțiunile care corespund subunităților 50S, ribozomilor 70S și polisomilor au fost grupate împreună. ARN-ul a fost izolat prin extracție cu fenol/cloroformă și precipitare cu etanol.

Isolarea ribozomilor 70S și a subunităților ribozomale

Pentru izolarea ribozomilor cuplului strâns54 , culturile de E. coli de peste noapte au fost diluate în 1 L de mediu LB/Amp și crescute până la A600 ~ 0,5. Celulele au fost recoltate prin centrifugare (5 000 g, 15 min, 4 °C), resuspendate în tamponul A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoetanol, 10 U/ml de RQ1 RNase-free DNase I) și lizate cu ajutorul presei franceze la 10 000 psi. Lizații au fost clarificați prin centrifugare în rotorul JA25-50 (Beckman) la 13 000 rpm timp de 30 de minute la 4 °C, iar supernatanții au fost încărcați pe 10 ml de pernă de zaharoză 1,1 M pregătită într-un tampon care conține 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 și 6 mM β-mercaptoetanol, în tuburi de centrifugare Quick-Seal de 35 ml (Beckman). Ribozomii au fost peletizați prin centrifugare timp de 16 ore la 36 000 rpm (4 °C) într-un rotor Ti70 (Beckman). Peletul de ribozomi a fost resuspendat în tamponul B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl și 6 mM β-mercaptoetanol) și 100 de unități A260 au fost încărcate pe un gradient de zaharoză 10-40% pregătit în tamponul B în tuburile unui rotor SW27 (Beckman). Gradientele au fost centrifugate timp de 21 h la 20 000 rpm (4 °C) într-un rotor SW27, fracționate cu ajutorul unui fracționator de gradient (BioComp), iar fracțiunile care conțin ribozomi 70S și subunități ribozomale 50S au fost grupate separat. Materialul a fost concentrat cu ajutorul concentratoarelor Vivaspin de 2 ml (Sartorius) cu membrană de triacetat de celuloză și a fost recuperat în tampon de stocare a ribozomilor (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol). Cantități alicotate de ribozomi și subunități ribozomale au fost congelate rapid și depozitate la -80 °C. În cazul în care a fost necesar, ARNr a fost izolat prin extracție cu fenol/cloroformă și precipitare cu etanol.

Pentru izolarea subunităților 50S din ribozomii 70S, 130 pmol de ribozomi, preparați așa cum s-a descris mai sus, dar concentrați prin peletizare și depozitați în tamponul de depozitare a ribozomilor (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoetanol) au fost diluați în tamponul D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoetanol) pentru a ajunge la o concentrație finală de 1,5 mM de MgCl2. Subunitățile ribozomale au fost separate prin centrifugare în gradienți de zaharoză 10-40% pregătiți în tamponul D care conținea 1,5 mM MgCl2. Gradientele au fost centrifugate timp de 16 ore la 27 000 rpm (4 °C) într-un rotor SW27 (Beckman), fracționate, concentrate și recuperate în tamponul de stocare a ribozomilor, așa cum s-a descris mai sus. Alianțele au fost congelate instantaneu și depozitate la -80 °C.

Analiză CLM-MS/MS a proteinelor ribozomale

Compoziția proteică a ribozomilor 70S și a subunităților ribozomale 50S din cuplul strâns wt și mutant, preparate conform descrierii de mai sus, a fost determinată prin spectrometrie de masă cantitativă55. Preparatele ribozomiale au fost amestecate într-un raport molar 1:1 cu ribozomi wt marcați SILAC care conțin arginină (Arg6: 6HN4O2 și lizină (Lys4: C6H104N2O2) marcate în masă (Silantes GmbH, Germania). Proteinele ribozomale au fost digerate cu tripsină (Sigma) sau Lys-C protează (Wako, SUA). Peptidele rezultate au fost fracționate și analizate prin LC-MS/MS cu ajutorul LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Identificarea proteinelor și analiza de cuantificare au fost efectuate utilizând Maxquant v1.5.6.056 și Perseus v1.6.2.357. Căutarea Maxquant a fost efectuată utilizând baza de date cu secvențe de proteine E. coli MG1655 din UniProtKB (24.04.2019). Abundența proteinelor a fost normalizată pentru proteinele subunităților mari și mici separat prin deplasarea raportului mediu L / M la 1.

Sondaj chimic al structurii ARNr

Structura ARNr a fost sondată în ribozomii 70S izolați din celule wt sau mutante. Ribozomii (10 pmol) au fost plasați în 50 μl de tampon de modificare și au fost activați prin incubare timp de 5 min la 42 °C. Reacția de modificare a fost inițiată prin adăugarea a 2 μl de sulfat de dimetil (Sigma) diluat 1:10 în etanol. Probele au fost incubate timp de 10 minute la 37 °C. Reacțiile de modificare au fost oprite prin adăugarea a 50 μl de soluție de oprire proaspăt preparată (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoetanol) și 300 μl de etanol. Probele au fost precipitate, resuspendate în tampon (300 mM acetat de sodiu, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5% SDS) și ARN a fost izolat prin extracție cu fenol/cloroformă și precipitare cu etanol. Extinderile de primeri au fost efectuate folosind primeri NA56-NA57.

Analiza conținutului de ARNr mutant

Pentru analiza prezenței ARNr 23S-cp5S modificat, ARN total a fost izolat din fracțiile de gradient de zaharoză așa cum se descrie mai sus. Conținutul de ARNr 23S-cp5S mutant a fost evaluat prin extensie de amorsă folosind fie primerul NA58, fie primerul NA59. Mai exact, amorsa marcată cu 5′ (0,5 pmol) a fost aneantizată la 1 μg de ARN total în tamponul de hibridizare (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) prin incubare la 90 °C timp de 1 min și apoi răcire timp de 15 min până la 42 °C, și prelungită cu 2 U de transcriptază inversă AMV (Roche) timp de 20 min la 42 °C într-un volum final de reacție de 8 µl. Pentru amorsa NA58, reacția a conținut 0,25 mM de ddATP și 0,2 mM de dCTP, dGTP, dTTP. Pentru amorsă NA59, reacția a conținut 0,25 mM de ddCTP și 0,2 mM de dATP, dGTP, dTTP. Reacțiile au fost terminate prin adăugarea a 120 μl de tampon de oprire (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70% EtOH), răcire la -80 °C timp de 15 minute și peletizare a acizilor nucleici prin centrifugare la 15 000 × g timp de 1 oră la 4 °C. Supernatanții au fost îndepărtați, peleții au fost uscați și dizolvați în formamidă colorant de încărcare. Produsele ADNc au fost dizolvate într-un gel de poliacrilamidă denaturant de 12% și vizualizate prin fosforimagistică.

Traducerea in vitro

Reacțiile de traducere in vitro au fost efectuate în sistemul de traducere fără celule Δribosome PURExpress (New England Biolabs). Șabloanele de ADN care conțin promotorul ARN polimerazei T7, situsul de legare a ribozomului și secvența de codificare a proteinei au fost preparate prin PCR. Șablonul ermBL a fost preparat cu ajutorul primerilor NA52-NA55. Șablonul GFP a fost generat din gena sf-gfpp din plasmidul pY71-sfGFP58 folosind primerii NA31 și NA32. Dihidrofolat reductaza (DHFR) a fost exprimată din șablonul plasmidic furnizat împreună cu kitul PURExpress.

Reacția de traducere pentru exprimarea GFP a fost asamblată într-un volum total de 10 μl și a conținut 2 μl din soluția A a kitului PURExpress, 1 μl din soluția A a kitului PURExpress.2 μl de amestec de factori, 1 μl de amestec de aminoacizi (3 mM fiecare), 1 μl de ARNt (20 μg/ml), 16 U de inhibitor de RNază RiboLock (ThermoFisher), 10 ng de șablon GFP și 12 pmol de ribozomi wt sau mutanți. Eșantioanele au fost plasate în godeurile unei plăci de cultură tisulară de 384 de godeuri cu perete negru/fond plat transparent (BD Biosciences) și acoperite cu capacul. Reacțiile au fost incubate la 37 °C într-un cititor de microplăci (Tecan), înregistrându-se fluorescența GFP la fiecare 10 minute la λexc = 488 nm și λem = 520 nm pe o perioadă de 4 ore.

Exprimarea DHFR a fost urmată de încorporarea de -L-metionină în proteina de mărime completă. Traducerea a fost efectuată în reacții de 10 μl asamblate conform descrierii de mai sus, dar suplimentate cu 5 μCi -L-metionină (1175 Ci/mmol), folosind 50 ng din șablonul de ADN și 6 pmol de ribozomi wt sau mutanți. Reacțiile au fost incubate la 37 °C. La fiecare 12 minute, s-au prelevat alicote de 1 μl, s-au amestecat cu 3 μl de colorant de încărcare a gelului cu conținut de SDS și s-au păstrat la gheață până la finalizarea cursului reacției. Produsele proteice au fost analizate prin electroforeză pe gel SDS în geluri Bis-Tris de 16,5 % (Biorad) cu ajutorul tamponului de funcționare NuPAGE MES/SDS (Invitrogen). Gelurile au fost colorate, uscate și expuse la un ecran phosphorimager peste noapte. Benzile radioactive au fost vizualizate prin phosphorimaging.

Analiza crio-EM a ribozomilor 70S și a subunităților 50S

Grilele crio-EM au fost pregătite după cum urmează. Grilele de cupru de 400 M acoperite cu carbon dantelat și un strat subțire de 2 nm de carbon (Ted Pella Inc.) au fost descărcate cu incandescență cu un curent de 20 mA cu polaritate negativă timp de 60S într-o unitate de descărcare cu incandescență PELCO easiGlow. Un Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) a fost preechilibrat la 4 °C și 95% umiditate relativă. S-a decongelat o parte alicotă de ribozomi congelați anterior și, atunci când s-a observat opalescența, soluția a fost curățată într-o microcentrifugă (10 minute la 16 000 × g la 4 °C). Concentrația supernatantului curățat a fost derivată din A260 măsurată cu ajutorul unui Nanodrop (ThermoFisher), iar ribozomii au fost diluați la 200 nM în LPP Buffer . Trei µl de soluție de ribozomi de 200 nM au fost aplicate pe grilă; după o întârziere de 10S, grila a fost tamponată timp de 4S și apoi a fost scufundată în etan lichid răcit cu azot lichid.

Datele au fost colectate la un microscop electronic Talos (ThermoFisher) care funcționează la 200 KV și este echipat cu un detector de electroni direcți K3 (Gatan Inc.) care vizează 0,5-1,8 μm subfocus. Colectarea datelor a fost automatizată cu SerialEM59 folosind înclinarea fasciculului pentru a colecta mai multe filme (de exemplu, o fotografie în centru, 6 cu deplasare) la fiecare poziție a treptei60. Filmele de super-rezoluție au avut un total de 19 cadre cu 1,5 e-/Å2 pe cadru pentru o doză totală de 30 e-/Å2 pe eșantion. În total, au fost colectate 5222 de filme pe parcursul a 22 h. Filmele au fost aliniate din mers în timpul colectării datelor cu ajutorul IMOD61 pentru a decomprima cadrele, a aplica referința de câștig, a grupa datele de super-rezoluție la un pixel fizic de 0,87 Å pe eșantion și a corecta deriva imaginii.

Etapele timpurii ale generării hărții 3D din determinarea CTF, selectarea particulelor fără referință (489 732 de particule) și crearea stivei au fost efectuate în cisTEM. Alinierea și rafinarea particulelor au fost efectuate în Frealign 9.11 și cisTEM62,63. Pentru a accelera procesarea, s-au pregătit stive de imagini 2×-, 4×- și 8×-binned folosind resample.exe, care face parte din distribuția FREALIGN64. Modelul inițial pentru alinierea particulelor din hărțile 70S a fost EMD-100365, care a fost micșorat pentru a corespunde stivei de imagini cu binner de 8× folosind EMAN266. S-au efectuat două runde de căutare în modul 3 cu o tăiere de înaltă rezoluție de 30 Å, apoi de 20 Å, utilizând stiva de 8× binned. În continuare, s-au efectuat 7 runde de rafinare în modul 1 cu stiva de 4×, în cele din urmă necuprinse, pe măsură ce s-au adăugat treptat cochilii de rezoluție (limită de 5 Å) și rezoluția a ajuns la 2,94 Å. S-a folosit rafinarea prin deplasarea fasciculului pentru a îmbunătăți rezoluția generală la 2,87 Å.

Au fost utilizate douăzeci de runde de clasificare 3D cu probabilitate maximă fără mascare și la o rezoluție de 14 Å pentru a separa rapid particulele cu 8x binned în 12 clase de compoziții diferite care dezvăluie subunități 50S, ribozomi 70S fără ARNt sau ribozomi 70S cu ARNt și 30S fie într-o conformație rotită, fie ne-rotită (Fig. suplimentară 3a). Au fost create substații de particule 50S (133.490), particule 70S goale (120.428) sau particule 70S legate de ARNt, în stare neînvârtită (55.677) cu ajutorul stivei de 1 x binned cu ajutorul programului merge_classes.exe, parte a pachetului Frealign, care necesită scoruri de particule de 0 și un minim de 50% de ocupare. Substack-urile au fost apoi din nou binned la 4x folosind resample.exe pentru a accelera etapele ulterioare de clasificare.

Substack-ul de particule 50S a fost separat în 6 clase cu o mască de focalizare cu o rază de 55Å în jurul porțiunii de ARNr 5S din ARNr hibrid 23S-cp5S. Clasele cu uL16 și/sau bL33 slabe sau absente și clasele care diferă în ceea ce privește poziția ARNr 5S au fost separate. Clasele au fost reconstruite cu parametrii originali de aliniere și de înclinare a fasciculului la un binning de 1x și una dintre aceste clase a fost utilizată pentru modelarea structurală, așa cum este detaliat în secțiunea următoare.

Au fost investigate și particulele 70S. Substacul de particule 70S goale (fără ARNt) a fost separat în 12 clase folosind aceeași mască de focalizare de 55-Å. Clasele au prezentat diferențe în ceea ce privește ocuparea uL16 și/sau bL33 și poziția ARNr 5S, similar cu clasele 50S descrise mai sus. Cu toate acestea, spre deosebire de particulele 50S, 3 din cele 12 clase 70S goale au dezvăluit un PTC normal pliat.

Clasificarea substackului de particule 70S legate de ARNt în stare clasică în 12 clase cu aceeași mască a dezvăluit o ocupare aproape stoichiometrică de 16 uL, iar toate particulele aveau un PTC normal pliat și o densitate puternică de ARNt P. În schimb, ocuparea ARNt a situsului A a fost slabă în unele clase cu o densitate L33 mai slabă. Clasificarea particulelor 70S cu un 30S rotit și un ARNt P/E în stare hibridă în 12 clase a evidențiat, de asemenea, o ocupare variabilă a uL16 și bL33, iar șapte clase prezentau un PTC aberant.

Structura crio-EM de 3,2Å a ribozomului 70S legat cu ARNt A și P67 a fost utilizată ca model de plecare pentru rafinarea structurii. Componentele/domeniile ribozomului au fost ajustate în hărți cu ajutorul Chimera68. Aici, 50S, tulpina L1, tulpina L11, corpul și capul 30S și ARNt au fost adaptate independent. Modelarea ARNr 5S și ajustările la PTC și la centrul de decodificare au fost realizate cu ajutorul PyMOL69. Modelele structurale au fost rafinate cu ajutorul rafinării în spațiu real prin metoda simulated-annealing folosind RS Ref 70,71 față de hărțile corespunzătoare. Parametrii de rafinare, cum ar fi ponderea relativă a restricțiilor stereochimice și termenul de energie experimentală, au fost optimizați pentru a produce stereochimia optimă a structurii, coeficientul de corelație în spațiu real și factorul R, care raportează ajustarea modelului la hartă72. Restricțiile de structură secundară, care cuprind restricții de legături de hidrogen pentru proteinele ribozomiale și restricții de împerechere a bazelor pentru moleculele de ARN, au fost utilizate conform descrierii73. Structurile au fost apoi rafinate folosind phenix.real_space_refine74 , urmate de o rundă de rafinare în RSRef, aplicând restricții armonice pentru a păstra geometria proteinelor70,71. Phenix a fost utilizat pentru a rafina factorii B ai modelelor față de hărțile lor respective fără filtrarea factorilor B74. Modelele structurale rezultate au parametri stereochimici buni, caracterizați prin abateri scăzute de la lungimile și unghiurile ideale ale legăturilor și sunt în strânsă concordanță cu hărțile corespunzătoare, după cum indică coeficienții de corelație ridicați și factorii R în spațiu real scăzuți (tabelul suplimentar 2). Figurile au fost pregătite în PyMOL69.

Rezumat de raportare

Informații suplimentare privind designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research legat de acest articol.

.