Genele AmpC β-lactamază CITM și DHAM mediate de plasmidă în rândul izolatelor clinice Gram-negative

Antecedente

Rezistența la medicamente în rândul unor bacterii Gram-negative (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii și Pseudomonas aeruginosa) a apărut și s-a răspândit la nivel mondial. În cadrul familiei Enterobacterales, Escherichia coli și Klebsiella spp. sunt organisme frecvent izolate care au proprietăți notabile de rezistență la medicamente. β-lactaminele sunt medicamentele prescrise în mod obișnuit împotriva acestor tulpini recalcitrante și constituie singure aproximativ două treimi din prescripțiile clinice recente.1 Acest grup conține patru clase chimice majore: peniciline, cefalosporine, carbapenemice și monobactame, în care carbapenemicele sunt utilizate ca medicamente de ultimă instanță în terapia empirică împotriva tulpinilor patogene de bacterii Gram-pozitive, Gram-negative și anaerobe.2

Rezistența la β -lactame este atribuită producției de β-lactamaze, acele enzime hidrolitice care sunt capabile să inactiveze antibioticele înainte ca acestea să ajungă la proteinele de legare a penicilinei (PBP) situate la nivelul membranei citoplasmatice.3 Principalele familii de β-lactamaze includ β-lactamazele cu spectru extins (ESBL) mediate de plasmidă, AmpC, cefalosporinazele și carbapenemazele. Toate clasele au fost detectate la nivel global, câteva dintre ele fiind concentrate în anumite țări.1

Genele care codifică β-lactamaza AmpC s-au răspândit foarte mult și sunt detectate pe scară largă în plasmidele bacteriene. Prima variantă AmpC codificată în plasmid a fost identificată pentru prima dată în 1989 la Klebsiella pneumoniae izolată în Coreea de Sud. Aceasta a fost denumită CMY-1 din cauza trăsăturii sale fenotipice asociate cu cefamicinaza și a fost notorie pentru rezistența la cefoxitină.4,5 Într-un interval scurt de timp au fost detectate multe familii de variante AmpC mediate de plasmidă, predominant din izolate de K. pneumoniae și E. coli. Bacteriile care posedă genotipuri AmpC mediate de plasmidă au fost atribuite pe baza omologiei în secvența de acizi nucleici, formând un număr mai mare de genuri bacteriene care au acționat ca sursă a acestor plasmide și un număr de familii AmpC.6 Până în prezent, următoarele familii AmpC au fost raportate la nivel global: două familii de β-lactamaze CMY (CMY-1 și CMY-2) izolate din Aeromonas hydrophila și, respectiv, Citrobacter freundii; enzime de tip FOX și de tip MOX izolate din Aeromonas spp.; familia ACC derivată din H. alvei; familia LAT de cefalosporinaze izolate de la C. freundii; familiile MIR și ACT provenite de la Enterobacter spp. și familia DHA izolată de la Morganella morganii.4,6,7 Majoritatea genelor AmpC codificate în plasmidă se găsesc în izolatele de E. coli și K. pneumoniae în infecțiile nosocomiale, în timp ce rezistența în rândul altor bacterii Gram-negative, cum ar fi E. cloacae, C. freundii, S. marcescens și M. morganii, este conferită de β-lactamazele AmpC mediate de cromozomi, sporind astfel rezistența la cefalosporinele cu spectru larg.8 Organismele producătoare de ESBL, adesea caracterizate prin coexpresia cu β-lactamaze AmpC, reprezintă o amenințare serioasă în diagnosticarea și tratamentul agenților patogeni.

În plus, genele β-lactamazei AmpC, în special MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM și ACCM sunt responsabile pentru dezvoltarea rezistenței cu spectru larg la majoritatea β-lactaminelor (altele decât cefepima și carbapenemele). În plus, dobândirea acestor gene în bacterii poate spori și mai mult rezistența, deoarece inhibitorii enzimelor din clasa A (inclusiv acidul clavulanic, sulbactamul și tazobactamul) și p-cloromercuribenzoatul nu sunt eficienți împotriva β-lactamazelor AmpC, deși unele dintre ele pot fi inhibate de tazobactam sau sulbactam.6

Deși se fac eforturi pentru a reduce creșterea și răspândirea agenților patogeni rezistenți la medicamente, studiile privind β-lactamazele AmpC în mediile cu resurse limitate sunt încă inadecvate. Cel mai important pas pentru a face față creșterii rezistenței antimicrobiene (AMR) este detectarea precisă a tulpinilor patogene (și/sau rezistente) în laboratoarele de diagnosticare. Cu toate acestea, protocoalele de laborator pentru raportarea de rutină nu reușesc să ofere un rezultat precis în Nepal, deoarece β-lactamazele AmpC sunt dificil de identificat doar prin teste fenotipice și sunt adesea detectate în mod eronat ca ESBL în laboratoarele clinice. Izolatele de Enterobacterales care sunt pozitive la testul de depistare a fenotipului ESBL, dar negative la testul de confirmare, sunt considerate, de obicei, ca potențiali producători de β-lactamaze AmpC, fie prin depresie cromozomială, fie prin transfer de plasmidă.9

Chiar și microbiologii clinicieni experți nu reușesc să identifice β-lactamazele AmpC mediate de plasmidă, sugerând astfel necesitatea unei metode mai precise și mai specifice pentru o detectare rapidă. Cu toate acestea, unele dintre aceste proceduri consumă multe resurse, necesitând adesea reactivi care nu sunt ușor de obținut.10 Din aceste motive, β-lactamazele AmpC rămân nedetectate în probele clinice. Astfel, a fost conceput un protocol de laborator mai fiabil și mai valid, care constă în reacția în lanț a polimerazei multiplex (PCR), pentru a facilita diagnosticarea genelor AmpC codificate în plasmidă, care sunt responsabile de expresia β-lactamazei AmpC în diferite infecții clinice.11

Majoritatea studiilor se concentrează pe prevalența enzimelor ESBL în izolatele clinice Gram-negative din Nepal.12-16 Există un număr limitat de studii privind enzimele β-lactamazei AmpC în bacteriile Gram-negative din Nepal. Un studiu efectuat în valea Kathmandu a raportat că 27,8% dintre izolatele de Enterobacterales sunt producătoare de β-lactamaze AmpC folosind metoda fenotipică.17 Din câte știm noi, există un număr limitat de studii legate de detectarea și caracterizarea enzimelor β-lactamaze AmpC în bacteriile Gram-negative folosind atât metode fenotipice, cât și genotipice în Nepal. Este esențial să se stabilească metode standard fenotipice și genotipice privind testul de sensibilitate la antibiotice pentru a depista agenții patogeni rezistenți la medicamente în spitale. Acest studiu a fost întreprins pentru a izola și a identifica genele β-lactamazelor AmpC (blaCITM și blaDHAM) în izolatele de bacterii Gram-negative folosind atât metode de screening fenotipice, cât și metode de confirmare.

Metode

Studiu de design

Este un studiu transversal bazat pe spital, realizat în perioada iunie 2017 – ianuarie 2018 la Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Un total de 1151 de probe clinice non-duplicate au fost colectate și au fost procesate în timpul perioadei de studiu. Probele au inclus urină (n=412), sânge (n=206), vârful cateterului (n=163), puroi (n=132), scaun (n=89), LCR (n=53), tampon de rană (n=58) și tampon vaginal (n=38). Probele au fost obținute într-un recipient steril, bine etichetat și rezistent la scurgeri; și au fost procesate cât mai curând posibil.18 Toți pacienții vizitatori suspectați de infecții bacteriene care și-au dat consimțământul pentru a fi implicați au fost incluși în studiu. Participanții la studiu cu informații demografice inadecvate au fost excluși.

Cultura probelor și identificarea izolatelor

Eșantioanele au fost colectate în conformitate cu ghidurile microbiologice standard pentru colectarea de urină, scaun, puroi, sânge, LCR și vârful cateterului. Probele eligibile au fost inoculate ulterior pe agar sânge (BA) Chocolate agar (CA) și MacConkey agar (MA). În plus, probele de urină au fost inoculate în agar cromogenic UTI. Izolații au fost identificați cu ajutorul parametrilor microbiologici standard, cum ar fi aspectul morfologic al coloniilor, reacțiile de colorare și proprietățile biochimice.19,20

Testarea sensibilității la antibiotice

Toate izolatele Gram-negative identificate au fost supuse în continuare unui test de sensibilitate antimicrobiană in vitro folosind metoda de difuzie a discului Kirby-Bauer modificată.21 În primul rând, s-au realizat inoculii prin transferarea coloniilor bacteriene din agar nutritiv în soluție salină normală sterilă. Turbiditatea inoculumurilor a fost stabilită în echivalență cu standardul 0,5 McFarland, conform orientărilor CLSI. Cultura în covor a inoculilor de testare a fost, de asemenea, preparată pe agar Muller-Hinton (MHA). Discurile antibiotice (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India) au fost utilizate în următoarele proporții: amoxicilină (10 μg), azitromicină (10 μg), amikacină (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitină (30 μg), ceftazidimă (30 μg), ciprofloxacină (5 μg), imipenem (10 μg), piperacilină/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazol (25 μg) și cefepime (30 μg). Placa inoculată a fost incubată aerob la 37°C până la 18 ore. După o incubare suficientă, s-au măsurat zonele de inhibiție (ZOI) din jurul discurilor, iar rezultatul a fost clasificat ca fiind sensibil, intermediar sau rezistent.21 Izolații care prezintă rezistență la trei sau mai multe antibiotice din clase diferite au fost interpretați ca fiind multidrogrezistenți.22

Screening pentru β-lactamaze AmpC

Soldații au fost supuși mai întâi unui screening pentru o posibilă producție de β-lactamaze AmpC în conformitate cu liniile directoare CLSI, 2019.23 Pentru depistare, ceftazidime sau cefotaxime sau cefoxitină sau ceftriaxonă, fiecare de 30 µg au fost supuse în testul AST, iar organismele rezistente la aceste antibiotice (care prezintă o zonă de inhibiție cu diametrul ≤ 18 mm) au fost depistate ca potențiali producători de AmpC și au fost supuse unor teste de confirmare suplimentare.

Confirmarea pentru β-lactamaze AmpC

Producătorii de β-lactamaze AmpC depistați pozitiv au fost confirmați prin testul pe disc AmpC și testul de confirmare bazat pe inhibitori (testul cu acid boronic).

În testul cu acid boronic, cultura în covor a organismului de testat a fost realizată pe placă MHA luând soluții de 0,5 McFarland. Două discuri de cefoxitină (30µg), dintre care unul a fost adăugat cu acid fenil boric (400 µg), au fost plasate pe cultura de covor de pe placa MHA și incubate, iar rezultatele au fost interpretate. Dacă a existat o creștere a zonei de inhibiție cu ≥5 mm atunci când discul de antibiotic dorit (ceftazidimă sau cefotaximă) a fost evaluat în combinație cu acid fenilboronic decât în timpul testului fără combinație (discul de antibiotic singur), izolatul a fost marcat ca având testul de confirmare pozitiv.

În testul de apropiere a discurilor, discurile au fost puse peste cultura de covor de E. coli ATCC 25922. Discul de 30μg ceftazidimă a fost plasat în centrul plăcii, urmat de discurile de 10μg imipenem, 30μg cefoxitină și 20/10μg amoxicilină/clavulanat care au fost puse la o distanță de 20 mm de discul de ceftazidimă. Coloniile organismului testat au fost adăugate pe un disc, apoi placa a fost inversată și incubată timp de 24 de ore la 37°C în mediu aerob. Orice indentare sau aplatizare a ZOI a indicat producerea de β-lactamază AmpC de către izolate.20,24

Prezervarea izolatelor AmpC β-lactamază pozitive

Pentru conservare s-a folosit metoda de preparare a stocului de glicerol. Organismele au fost conservate în bulion Tryptic Soy Broth (TSB) conținând 40% glicerol și depozitate la -20ºC.25

Extracția ADN-ului plasmidic brut

O colonie izolată a organismului de test a fost inoculată în bulion Luria Bertani (LB). Inoculul a fost incubat aerob cu ajutorul unui agitator pe baie de apă la 37°C timp de 18-24 de ore. Cultura pură astfel obținută a fost supusă metodei de liză alcalină pentru a extrage ADN-ul plasmidic. ADN-ul plasmidic extras a fost apoi suspendat în tampon TE și depozitat la -20°C până la investigații ulterioare.26

Amplificarea genelor β-lactamazei AmpC (blaCITM și blaDHAM) prin PCR

Genele β-lactamazelor AmpC (blaCITM și blaDHAM) au fost amplificate prin PCR folosind ca șablon preparatul de ADN plasmidic. Amorsele utilizate pentru gena blaCITM au fost CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) și CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) ca primer înainte și, respectiv, invers, în timp ce primerii pentru gena blaDHAM au fost secvența înainte DHAM pentru (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) și secvența inversă DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG TGG CTT TGC -5ʹ).11 Volumul de reacție a fost stabilit ca fiind de 25 μl prin adăugarea a 12,5 μl de 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), 0,5 μl din fiecare amorsă directă și inversă și 4 μl de șablon de ADN și ddH2O 7,5 μl. Amplificarea PCR optimizată a ambelor gene a fost de 94ºC timp de 3 minute pentru denaturarea inițială; 35 de cicluri de denaturare la 94ºC timp de 30 de secunde; 25 de cicluri de aneantizare la 62ºC timp de 30 de secunde; 35 de cicluri de extensie la 72º timp de 1 minut; și extensie finală la 72ºC timp de 7 minute.11,27

Purificarea ADN-ului

ADN-ul plasmidic a fost purificat prin metoda de precipitare cu etanol. În această metodă, peleta de ADN a fost clătită cu etanol 70% rece ca gheața și lăsată la uscat timp de 10 minute, ceea ce facilitează evaporarea alcoolului. Peletul de ADN a fost suspendat într-o soluție tampon care conține Tris, EDTA și RNaze pentru a elimina impuritățile rămase.

Detecția produselor PCR prin electroforeză pe gel

Produsele amplificate au fost vizualizate prin electroforeză pe gel de agaroză de 1,5%, colorate cu 0,1µL bromură de etidiu. După prepararea gelului, 2µL de 100bp DNA ladder au fost adăugați în primul puț ca marker, 2µL de control negativ au fost adăugați în alt puț, 2µL de control pozitiv au fost adăugați în alt puț și 2µL de produse PCR au fost adăugați în puțurile rămase. În cele din urmă, gelul a fost vizualizat sub transiluminator UV.28

Control de calitate

Pentru procedurile din acest studiu s-a adoptat o procedură aseptică standard. Toate loturile de medii de cultură și de reactivi chimici au fost procesate cu tehnici aseptice în conformitate cu liniile directoare CLSI. În AST, controlul calității a fost menținut prin utilizarea tulpinilor de control de E. coli ATCC 25922. În timpul PCR, controlul calității a fost asigurat prin utilizarea izolatelor de Klebsiella purtătoare ale ambelor gene în cauză, în timp ce controalele martor sau negative au fost pregătite fără aplicarea de acizi nucleici. Toate aceste controale au fost utilizate în fiecare lot al testului PCR.

Analiză statistică

Datele au fost introduse și analizate cu ajutorul programului SPSS versiunea 24.0. Asocierile au fost explorate folosind teste Chi pătrat la un interval de încredere (IC) de 95% între variabilele demografice, cum ar fi sexul și vârsta subiecților.

Rezultate

Caracterul demografic și clinic al pacienților înrolați

Printre cei 1151 de pacienți înrolați, 54,2% (624/1151) au fost bărbați și 45,8% (527/1151) au fost femei. Din cele 253 de creșteri bacteriene, 47,8% (121/253) au fost de la bărbați și 52,2% (132/253) au fost de la femei. Din totalul (253) de creșteri bacteriene, 26,1% (66/253) proveneau din probe de urină, urmate de vârfurile de cateter (17,4%;44/253), sânge (16,2%; 41/253), puroi (11,9%; 30/253) și tampoane de plagă (10,7%; 27/253). În ceea ce privește distribuția pe vârste a pacienților, cea mai mare creștere a agenților patogeni bacterieni a fost constatată în grupa de vârstă 16-45 de ani (39,5%; 100/253), urmată de 46-60 de ani (30,1%; 76/253), >60 de ani (24,1%; 61/253) și, respectiv, 0-15 ani (6,3%; 16/253) (Tabelul 1).

Tabelul 1 Caracterul demografic și clinic al pacienților consultați la Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribuția izolatelor bacteriene în probele clinice

Într-un total de 1151 de probe clinice, 22% (253/1151) au prezentat creștere pe medii de cultură. Dintre cele 253 de izolate bacteriene, majoritatea (89,3%; 226/253) au fost bacterii Gram-negative. Dintre creșterile bacteriene, E. coli (28,5%; 72/253) a fost organismul predominant, urmat de Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), bacterii Gram-pozitive (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253) și Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figura 1)

Figura 1 Distribuția genurilor bacteriene în probele clinice pozitive la cultură (n=253).

Planul de sensibilitate la antibiotice al bacteriilor Gram-negative izolate

Din 226 de izolate bacteriene Gram-negative, 66.8% (151/226) s-au dovedit a fi rezistente la cefoxitină, urmate de ceftazidimă (58,4%; 132/226), ciprofloxacină (53,5%; 121/226) și cefepime (51.8%; 117/226), în timp ce izolatele au fost cele mai sensibile la meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%;155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacină (61,1%;138/226), piperacilină/tazobactamă (56,6%;128/226) și azitromicină (53.1%; 120/226) (tabelul 2).

Tabelul 2 Tabel 2 Tabloul de sensibilitate la antibiotice al izolatelor de bacterii Gram-negative (n=226)

Tabloul de rezistență multidrog (MDR) în izolate

Din 226 de izolate, 46.9% (106/226) dintre izolate au fost MDR. Cel mai mare procent de MDR a fost constatat în rândul E. coli (31,1%; 33/106), urmat de P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) și, respectiv, K. oxytoca (4,7%; 5/106) (Figura 2). În cazul speciilor individuale, cel mai mare procent de rezistență multidrog a fost constatat la C. freundii (100%; 8/8), urmată de P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) și, respectiv, E. coli (45,8% 33/72) (Figura 2).

Figura 2 Distribuția bacteriilor MDR și a procentului global de MDR și MDR în cadrul fiecărei specii.

Detecția ampC prin diverse teste

Din 226 de izolate Gram-negative, 50% (113/226) au prezentat rezistență la cefoxitină. Izolatele producătoare de β-lactamază AmpC au fost confirmate prin două teste de confirmare diferite, testele Disk și testele cu acid boronic. Din cele nouăzeci și unu de izolate, 91,2% (83/91) au prezentat rezultate pozitive la ambele teste, iar 8,8% (8/91) izolate au prezentat rezultate pozitive doar la testul cu acid boronic, confirmate de cel puțin un test și au fost considerate ca fiind producătoare de β-lactamază AmpC.

Prevalența genelor blaCITM și blaDHAM în izolatele Gram-Negative producătoare de β-lactamază AmpC

În testul PCR, 90,1% (82/91) și 87,91% (80/91) din izolate au fost testate pozitiv pentru blaCITM și blaDHAM. Respectiv, au fost detectate genele blaCITM și blaDHAM amplificate cu dimensiunea ampliconului 465bp și 405bp (figurile 3 și 4).

Figura 3 Electroforeza pe gel de agaroză (1,5%) utilizată pentru separarea produselor PCR. Lane 2, control pozitiv; Lane 3, 5 și 7 sunt CITM pozitiv; Lane 4 și 6, CITM negativ; și Lane 8. control negativ.

Figura 4 Electroforeza pe gel de agaroză (1,5%) utilizată pentru separarea produselor PCR. Lane 2, control pozitiv; Lane 3, 4, 6 și 7 sunt Dham pozitive; Lane 5, Dham negative; și Lane 8, control negativ.

Distribuția genelor AmpC β-Lactamază, blaCITM și blaDHAM în rândul izolatelor Gram-Negative și relația lor cu sexul, vârsta, probele clinice și izolatele clinice

Dintre cei 91 de producători de AmpC, 50,6% (46/91) dintre izolate au provenit de la femei și 49,4% (45/91) de la pacienți de sex masculin. În mod similar, procente egale (50%; 41/82) de gene blaCITM au fost obținute din specimene de ambele sexe, în timp ce 51,3% (41/80) și 48,7% (39/80) de gene blaDHAM au fost detectate în specimenele obținute de la pacienți de sex masculin și, respectiv, feminin. Nu a existat nicio asociere semnificativă a sexului pacientului cu producția de enzime AmpC și de gene AmpC (tabelul 3).

Tabel 3 Distribuția genelor AmpC β-lactamază, CITM și DHAM în rândul izolatelor de bacterii Gram-negative și relația acestora cu sexul, vârsta și probele clinice

Cel mai mare număr de producători de AmpC β-lactamază (40.7%; 37/91) și prevalența izolatelor producătoare de blaCITM (40,2%; 33/82) și blaDHAM (41,2%; 33/80) au fost obținute din grupa de vârstă (46-60) ani, urmată de (16-45) ani (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) și, respectiv, 31,3%; 25/80). A existat o asociere semnificativă între producția de enzime β-lactamază AmpC și grupa de vârstă (p = 0,01), în timp ce alți factori, inclusiv dobândirea genelor blaCITM și blaDHAM, nu au avut o asociere semnificativă cu vârsta pacientului (tabelul 3).

Printre probele clinice, cel mai mare număr de izolate producătoare de β-lactamază AmpC (20,9%; 19/91) au fost detectate din sânge și vârfuri de cateter, urmate de urină (18,7%; 17/91), puroi (13,3%; 12/91) și tampoane de rană (9,9%; 9/91). În mod similar, cel mai mare număr de izolate producătoare de blaCITM și blaDHAM a fost detectat din vârfurile de cateter (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), urmate de sânge (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80), urină (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) și puroi (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), respectiv. Nu a existat nicio asociere semnificativă între probele clinice, producția de β-lactamază AmpC și genele: blaCITM și blaDHAM (tabelul 3).

Distribuția β-lactamazelor AmpC și achiziția genelor blaCITM și blaDHAM la diferite bacterii Gram-negative

Cea mai mare prevalență a enzimelor β-lactamaze AmpC a fost găsită la E. coli (28,6%; 26/91), urmată de P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) și K. pneumoniae (10,9%; 10/91). Cea mai mare prevalență a genelor blaCITM și blaDHAM a fost detectată la E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80), urmată de P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80) A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) și K. pneumoniae (10,9%; 9/82), respectiv (12,4%; 10/80) (tabelul 3).

Discuție

Incidența crescândă a rezistenței antimicrobiene rămâne ca una dintre problemele majore de sănătate publică în țările în curs de dezvoltare, cum ar fi Nepal29 , care a dus la prelungirea șederii în spital, creșterea costurilor de tratament, limitarea opțiunilor terapeutice și creșterea morbidității și mortalității29,30 . Producerea de β-lactamaze este principalul mecanism de apărare împotriva antibioticelor β-lactamatice. Acest studiu a fost realizat pentru a explora prezența β-lactamazelor din clasa C Amber (AmpC) în organismele Gram-negative provenite din probe clinice obținute la ANIAS, Kathmandu, Nepal. Acest studiu a evaluat, de asemenea, prevalența genelor β-lactamazei AmpC (blaCITM și blaDHAM) prin testul PCR. Am constatat o prevalență ridicată a acestor enzime și gene, deși prevalența acestor enzime a variat de la o regiune geografică la alta, în interiorul și între țări.

Dintre cele 1151 de probe clinice, doar 253 (21,9%) au prezentat o creștere semnificativă a organismelor. Din totalul (253) de creșteri bacteriene, mai mult de nouăzeci la sută au fost bacterii Gram-negative, E. coli a fost cel mai predominant izolat dintre ele. Constatările noastre sunt în concordanță cu studiile anterioare raportate de la Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, India,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Etiopia,38 și Mexico City, Mexic.39 O rată ușor mai mare de infecții cu bacterii Gram-negative a fost observată în rândul pacienților de sex feminin și ar putea fi cauzată de prevalența mai mare a infecțiilor tractului urinar în rândul femeilor. Acest lucru este în concordanță cu studiile anterioare de la Spitalul Model, Kathmandu,17 și Andra-Pradesh, India.40 În concordanță cu acest studiu, o rată mai mare de infecții cu puroi la cazurile postoperatorii a fost raportată la femei (63,33%) decât la bărbați (43,75%) dintr-un studiu efectuat în statul Uttar Pradesh din India.41

În acest studiu, izolatele bacteriene Gram-negative au prezentat o rezistență mai mare la următoarele antibiotice: cefoxitină, ceftazidimă, ciprofloxacină și cefepime, urmate de cotrimoxazol, în timp ce meropenem, imipenem, piperacilină-tazobactam și azitromicină au fost raportate ca fiind cele mai sensibile antibiotice. Un model comparabil a fost observat în unele dintre constatările anterioare de la Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoxitina și ceftazidima, cu rate scăzute de sensibilitate, sunt medicamente de primă linie care sunt ușor de hidrolizat de către enzimele bacteriene și sunt mai puțin utile în tratarea infecțiilor cauzate de agenți patogeni Gram-negativi. Similar studiului nostru, imipenemul/meropenemul a fost găsit ca fiind cele mai sensibile medicamente în studiile anterioare de la Spitalul Model, Kathmandu,17 Madrid, Spania,44 și Wisconsin, SUA.45

Rezistența antimicrobiană (AMR) cu răspândirea tot mai mare a MDR este o preocupare globală, iar impactul său este mai mare în rândul țărilor cu venituri mici și medii, unde povara bolilor infecțioase este ridicată.30 Tratamentul microbilor MDR este costisitor și dificil și este agravat și mai mult de prevalența ridicată a infecțiilor nosocomiale.46 În acest studiu, aproape jumătate dintre izolatele Gram-negative izolate (46,9%; 106/226) s-au dovedit a fi MDR. Prevalența mai mare a bacteriilor MDR a fost raportată în alte studii efectuate în Kathmandu46-49 și în alte districte din Nepal.15,50,51 Producția de ESBL, metalo β-lactamază (MBL) sau β-lactamază AmpC ar putea fi motivul care stă la baza susceptibilității reduse față de noua generație de antibiotice.52 Mai mult decât atât, rezistența multidrog apare din cauza agregării și exprimării diferitelor gene pe plasmide rezistente (R) sau a genelor care codifică pompe de eflux multidrog.53 În plus, genele responsabile pentru exprimarea enzimelor β-lactamaze sunt asociate în mod constant cu antibioticele non-β-lactame, cum ar fi aminoglicozidele și fluorochinolonele.

În acest studiu, producția de AmpC a fost mai mare la pacienții de sex masculin (41,67%) decât la cei de sex feminin (38,98%). Constatările acestui studiu sunt în concordanță cu alte câteva studii din Kano, nord-vestul Nigeriei.54 Cu toate acestea, constatările noastre diferă de studiile raportate din Benin, Nigeria.55 O prevalență mai mare a ITU cu rezistență multidrog în rândul femeilor a fost raportată de multe studii, acest lucru se poate datora unei prevalențe mai mari a agenților patogeni producători de AmpC în rândul femeilor, deoarece acestea sunt mai predispuse la ITU decât bărbații.

Utilizarea rezistenței la cefoxitină în laboratoarele de diagnosticare servește ca agent de screening/marker de încredere pentru a detecta producția de AmpC. În plus, acest marker oferă o bună valoare predictivă negativă.

În ciuda domeniului lor larg de aplicare, unele dintre studii au subliniat utilizarea cefoxitinei ca agent de screening slab pentru producția de AmpC. Acest lucru s-ar putea datora existenței unor mecanisme alternative, altele decât AmpC (unul dintre ele este mutația canalului porinei), care poate duce la o interpretare fals pozitivă (ca rezistență la cefoxitină).52 Studiul nostru a evidențiat că o treime din izolatele Gram-negative (>40%) au fost responsabile de producerea de AmpC. Constatările acestui studiu au contrastat cu studiul de la Spitalul Model, Kathmandu.17 Diferența se poate datora metodei de detecție fenotipică utilizată în acest studiu, care a folosit testul de rezistivitate la cefoxitină și metoda de testare pe disc AmpC folosind cefoxitină (30µg). Testul de confirmare utilizat a fost testul cu acid fenilboronic folosind cefoxitin 30µg/400µg acid fenilboronic. Derivații acidului boronic s-au dovedit a fi inhibitori reversibili ai enzimelor β-lactamazei AmpC.56

În acest studiu, producția de AmpC a fost observată la 91 (80,53%) de izolate din 113. Rata de producere a AmpC în studiul nostru este ușor mai mare decât alte studii raportate de la Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 și India.59

Pentru a compensa limitările datorate uneia dintre metode, integrarea ambelor tehnici în diagnosticul de rutină poate crește sensibilitatea și specificitatea testelor în mediile clinice.

Un total de 73 de izolate Gram-negative au arătat prezența ambelor gene blaCITM și blaDHAM. Aceste constatări sunt în concordanță cu un studiu anterior raportat din Ilam, Iran.27 În studiul de tip similar raportat din India, a arătat că genele blaCITM au fost mai răspândite în E. coli.60 În studiul nostru, prevalența genelor asociate AmpC (blaCITM și blaDHAM) a fost investigată prin metode fenotipice și genotipice. Acest studiu oferă o analiză amplă a bacteriilor Gram-negative asociate cu producția de β-lactamază AmpC și a modelelor de sensibilitate la antibiotice ale acestora în rândul izolatelor clinice. Constatările acestui studiu sunt importante în informarea modelelor de rezistență a diferitelor organisme față de cefalosporine. Supravegherea rezistenței multiple la medicamente cu β-lactamază, inclusiv producția de ESBL, MBL și AmpC, este necesară pentru o practică clinică de rutină pentru a optimiza tratamentul și pentru a preveni rezistența ulterioară la antibioticele β-lactame.13,61,62

Potriviri și limitări

Acesta este primul studiu care explorează genele β-lactamazei AmpC (blaCITM și blaDHAM) utilizând atât testul fenotipic, cât și cel molecular în rândul pacienților care frecventează un centru terțiar de îngrijire a sănătății din Nepal. Constatările acestui studiu pot informa politica antimicrobiană pentru centrele de îngrijire terțiară, inclusiv pregătirea gestionării infecțiilor spitalicești, protocolul de tratament și procedura de diagnosticare. Există câteva limitări ale acestui studiu care includ investigarea unor β-lactamaze AmpC limitate, durata scurtă a studiului și faptul că a fost efectuat într-un singur centru de îngrijire terțiară. Studiile viitoare se pot baza pe acesta pentru a efectua un studiu longitudinal la mai multe centre de îngrijire terțiară cu explorarea tuturor β-lactamazelor, cum ar fi ESBL, MBL, KPC și a principalelor gene responsabile de rezistență. Cu toate acestea, ca un prim studiu de acest tip care triangulează metodele fenotipice și moleculare, acest studiu va fi o referință valoroasă pentru studii viitoare privind β-lactamazele AmpC și prevalența genelor blaCITM și blaDHAM în alte medii/spitaluri din Nepal.

Concluzie

Constatările noastre arată că sensibilitatea redusă la cefoxitină în izolatele Gram-negative este legată de prezența genelor AmpC mediate de plasmidă. Deoarece nu există o singură metodă definitivă, se sugerează utilizarea simultană a mai multor metode de detectare fenotipică pentru detectarea precisă a bacteriilor producătoare de β-lactamază AmpC. În acest studiu, PCR a detectat aproape 90% din genele β-lactamazei AmpC (blaCITM și blaDHAM) în rândul izolatelor confirmate fenotipic. Prevalența ridicată a genelor rezistente și MDR în rândul izolatelor Gram-negative este un semn alarmant, care necesită măsuri urgente de intervenție pentru a limita creșterea și răspândirea acestor izolate.

.