Calea ubiquitină-proteazom: Complexitatea și nenumăratele funcții ale morții proteinelor

Percepția noastră despre degradarea proteinelor intracelulare s-a schimbat dramatic în ultimul deceniu. Dintr-un proces de „punct final” de curățare, nereglementat și nespecific, a devenit clar că proteoliza proteinelor celulare este un proces extrem de complex, controlat temporal și strâns reglat, care joacă roluri majore într-o varietate de căi de bază în timpul vieții și morții celulare. Au fost descrise două cascade proteolitice majore. Caspazele sunt implicate în moartea celulară programată (apoptoza), în timp ce degradarea majorității proteinelor celulare de reglementare cu durată de viață scurtă este mediată de calea ubiquitin-proteazomului. Printre acestea se numără regulatorii ciclului și diviziunii celulare, cum ar fi ciclinele mitotice și G1 și inhibitorii kinazei dependente de cicline, regulatorii de creștere, cum ar fi c-Fos și c-Jun, supresorii tumorali, cum ar fi p53, receptorii de suprafață, cum ar fi receptorul hormonului de creștere, și canalele ionice, de exemplu, regulatorul conductanței transmembranare a fibrozei chistice (CFTR). Sistemul este, de asemenea, implicat în proteoliza selectivă a proteinelor anormale/mutate și în procesarea antigenelor restricționate de complexul major de histocompatibilitate (MHC) clasa I. Descoperirea faptului că sistemul este implicat în degradarea c-myc și în activarea proteolitică în două etape a NF-κB, de exemplu, a semnalat „intrarea” degradării mediate de ubiquitină în domeniul reglării transcripționale. Prin intermediul degradării proteinelor de reglementare cu durată de viață scurtă și cheie, sistemul pare să joace roluri importante într-o varietate de procese celulare de bază. Printre acestea se numără reglarea ciclului și diviziunii celulare, implicarea în răspunsul celular la stres și la modulatorii extracelulari, morfogeneza rețelelor neuronale, modularea receptorilor de la suprafața celulară, a canalelor ionice și a căii secretorii, repararea ADN-ului, biogeneza organitelor și reglarea răspunsurilor imune și inflamatorii. Dovezi recente indică faptul că acest sistem este implicat și în apoptoză. Cu o gamă atât de largă de substraturi și procese, nu este surprinzător faptul că aberațiile din acest proces au fost recent implicate în patogeneza mai multor boli, atât moștenite, cât și dobândite. Printre acestea se numără degenerarea musculară care urmează denervării sau imobilizării prelungite, anumite forme ale bolii Alzheimer, sterilitatea masculină și sindromul Angelman (pentru recenzii recente ale sistemului ubiquitin, a se vedea ref. 1-4).

Degradarea unei proteine prin intermediul căii ubiquitinei se desfășoară în două etape discrete și succesive: (i) atașarea covalentă a mai multor molecule de ubiquitină la substratul proteic și (ii) degradarea proteinei vizate de către complexul proteazom 26S cu eliberarea ubiquitinei libere și reutilizabile. Pentru a asigura eliminarea eficientă și specifică a unei anumite proteine la un anumit moment, atât conjugarea ubiquitinei, cât și degradarea substraturilor marcate trebuie să fie strict reglementate. Într-un studiu publicat în acest număr al Proceedings (5), Zhang și colegii săi raportează identificarea unei regiuni de activare în subunitatea α a activatorului proteazomului PA28 (REG). Pentru a încorpora această descoperire în contextul biochimic și fiziologic adecvat, vom trece pe scurt în revistă înțelegerea noastră actuală a căii proteolitice a ubiquitinei. Sistemul (ilustrat în Fig. 1) este format din mai multe componente care acționează în mod concertat. Una dintre acestea, ubiquitina, o proteină conservată din punct de vedere evolutiv de 76 de reziduuri, este activată în partea sa C-terminală Gly la un intermediar tiol ester de înaltă energie, o reacție catalizată de enzima de activare a ubiquitinei, E1. După activare, una dintre cele câteva enzime E2 (proteine purtătoare de ubiquitină sau enzime de conjugare a ubiquitinei, UBC) transferă fracțiunea de ubiquitină activată de la E1 la un membru al familiei de ubiquitin-proteine ligaze, E3, la care este legată în mod specific proteina substrat. E3 catalizează ultima etapă a procesului de conjugare, atașarea covalentă a ubiquitinei la substrat. Prima fracțiune de ubiquitină este transferată la gruparea ɛ-NH2 a unui reziduu Lys din substratul proteic pentru a genera o legătură izopeptidică. În reacții succesive, se sintetizează un lanț de poliubiquitină prin transferul procesiv de fracțiuni activate suplimentare la Lys48 din molecula de ubiquitină conjugată anterior. Lanțul servește, cel mai probabil, ca marker de recunoaștere pentru proteazom (a se vedea mai jos). Ubiquitina K48R sau ubiquitina metilată (în care toate grupările amino libere au fost modificate chimic) nu pot genera lanțuri de poliubiquitină și servesc drept terminatori de lanț. În consecință, atunci când sunt supraexprimate în celule sau introduse în sisteme fără celule, acestea inhibă proteoliza. Legarea substratului de E3 este specifică și implică faptul că E3-urile joacă un rol major în recunoașterea și selectarea proteinelor pentru conjugare și degradare ulterioară. Structura sistemului pare să fie ierarhică: un singur E1 pare să efectueze activarea ubiquitinei necesară pentru toate modificările. Mai multe specii majore de enzime E2 au fost caracterizate în celulele mamiferelor. Se pare că fiecare E2 poate acționa cu una sau mai multe enzime E3. Deși până în prezent au fost descrise doar un număr relativ mic de enzime E3, se pare că ligazele de ubiquitină aparțin unei familii mari de enzime, încă în creștere. În ceea ce privește modul de recunoaștere al ligazelor, cu excepția câtorva cazuri, este puțin probabil ca fiecare E3 să vizeze un singur substrat. Mai degrabă, este imaginabil ca mai multe proteine celulare diferite să fie recunoscute de o singură ligază prin intermediul unui motiv structural similar, dar în mod clar nu identic. Câteva proteine pot fi recunoscute prin intermediul reziduului lor N-terminal liber și „destabilizator” („regula capătului N”; ref. 6). Cu toate acestea, marea majoritate a proteinelor celulare sunt acetilate la terminațiile lor N sau au terminații amino „stabilizatoare” și sunt vizate prin semnale diferite. Unele sunt recunoscute prin intermediul unor secvențe primare care se află în aval de reziduul N-terminal. Altele sunt vizate prin intermediul unor modificări secundare, posttranslaționale, cum ar fi fosforilarea, sau după asocierea cu proteine auxiliare, cum ar fi oncoproteinele sau chaperonii moleculari.

După conjugare, fracțiunea proteică a aductului este degradată de complexul proteazom, iar ubiquitina liberă și reutilizabilă este eliberată (pentru recenzii recente privind proteazomii, a se vedea ref. 7-10). Deși consensul actual este că proteazomul 26S servește ca principal braț proteolitic al sistemului de ubiquitină, spectrul de substraturi al enzimei poate fi mai larg și poate include, de asemenea, proteine neubiquitinilate. Un caz bine studiat este cel al ornitin decarboxilazei (ODC). ODC este degradată după o asociere necovalentă cu o antizimă care poate funcționa în procesul de recunoaștere ca o chaperonă de tip ubiquitină specifică substratului. Alte substraturi, în principal proteine din reticulul endoplasmatic (ER), pot fi, de asemenea, degradate de proteazom fără ubiquitinilare prealabilă, deși acest lucru nu a fost stabilit cu fermitate. Printre acestea se pot număra, de exemplu, moleculele de lanț greu MHC (HC) prost pliate, 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA (HMG-R) de mamifere și varianta Z a α-1-antitripsinei (α1-ATZ) (analizată în ref. 11). De asemenea, este clar acum că nu toate proteinele ubiquitinilate sunt țintite pentru degradare de către proteazom. Acest lucru este valabil mai ales pentru proteinele membranare mature de la suprafața celulară, cum ar fi receptorul hormonului de creștere. Pentru aceste proteine, modificarea ubiquitinei are loc după legarea ligandului și este necesară pentru endocitoza și direcționarea lor către lizozom (revizuit în ref. 12). Degradarea proteinelor ancorate în membrană prin sistemul de ubiquitină ridică probleme mecaniciste importante, încă nerezolvate, care sunt legate, în principal, de modul în care două evenimente topologic distincte, cum ar fi plierea eronată în ER și degradarea în citosol, sau legarea ligandului în domeniul extracelular și ubiquitinilarea pe o coadă citosolică a unui receptor, vin împreună. Pentru proteinele membranare de la suprafața celulară, o problemă evidentă se referă la rolul modificării ubiquitinei: este aceasta necesară pentru endocitoza proteinei marcate sau, într-o etapă ulterioară, pentru direcționarea și absorbția specifică a acesteia de către lizozom. Pentru proteinele ER degradate de proteazomul citosolic, întrebările importante implică mecanismele care stau la baza recuperării acestor proteine prin membrană înapoi în citosol. Domeniul transmembranar al proteinelor ancorate în membrană este hidrofob și îndepărtarea sa din membrană implică, probabil, un transport specializat, dependent de energie, bazat pe canale. Pentru proteinele ER lumenale, întrebarea se centrează pe modul în care acestea sunt transportate înapoi în citosol.

Dovedele recente sugerează că principiul modificării ubiquitinei nu se limitează la direcționarea proteinelor pentru degradare. Se pare că ubiquitina este membră a unei familii mai mari și au fost descrise, de asemenea, mai multe proteine asemănătoare ubiquitinei. Un caz interesant implică direcționarea în structuri complexe. S-a constatat că localizarea RanGAP1, o proteină de activare a Ran GTPazei Ran, la proteina complexului de pori nucleari RanBP2, depinde de o modificare covalentă unică și stabilă de către o proteină asemănătoare ubiquitinei de 11,5 kDa și 101 reziduuri, SUMO-1 (13). Reacția de activare este similară cu cea a ubiquitinei și implică E1 și un E2 specific, UBC9. Astfel, modificarea covalentă posttranslațională de către ubiquitină și moleculele asemănătoare ubiquitinei servește unui spectru larg de funcții. Ea este implicată în direcționarea proteinelor pentru degradarea de către proteazom și lizozom, dar îndeplinește și funcții neproteolitice.

Cel mai bine studiat complex proteazom implicat în degradarea proteinelor marcate cu ubiquitină este complexul proteazom 26S. Acesta este o structură simetrică „în formă de coajă de cupă” compusă dintr-o unitate catalitică centrală, un complex proteazom 20S în formă de butoi, care este flancat de ambele părți de complexe proteazomice 19S de reglementare (19S-20S-19S). Structura cristalină a proteazomului 20S eucariot (drojdie) a fost rezolvată la 2,4 Å (14). Studiul a coroborat predicțiile anterioare privind structura complexului, dar a dezvăluit și unele caracteristici neașteptate. Complexul din drojdie este dispus ca un teanc de patru inele, fiecare conținând șapte subunități distincte, α1-7β1-7-7β1-7α1-7. Diferitele subunități α și β au mase moleculare în intervalul 25-30 kDa. Locurile active se află în trei subunități β, β1, β2 și β5, dar nu și în subunitățile α. Analiza topologică a localizării diferitelor subunități a arătat că pentru cele trei activități proteolitice distincte, activitățile hidrolitice de tip tripsină, chimotripsină și postglutamil peptidil, situsurile active sunt generate de perechi adiacente de subunități de tip β identice care rezidă în inele β diferite. Analiza reziduurilor din situsul activ relevă un nou tip de mecanism proteolitic. Cele trei subunități β suferă autocataliză între ultimul reziduu Gly al pro-peptidei și Thr1 al subunității mature, care participă la procesul autocatalitic și devine o parte esențială a situsului catalitic. Rezoluția structurii cristaline a permis, de asemenea, o mai bună înțelegere a modului de acțiune al diferiților inhibitori ai proteazomului. Thr1 în β1, β2 și β5 se leagă de inhibitorul mai puțin specific al calpainei I, acetil-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). Lactacystin, un inhibitor mai specific, poate fi legat covalent de β5, unde poate genera, în plus, o serie de legături de hidrogen cu alte lanțuri laterale din jur. Analiza mutațională a arătat că celelalte subunități β, în special β4 și β7, care se află învecinate cu β5 și β1, afectează activitatea acestor subunități. β6 și β7 sunt, de asemenea, generate din proproteine prin procesare specifică. β3 și β4 nu sunt prelucrate. Datorită rolului lor posibil în stabilirea contactelor intersubunitare și în stabilizarea structurii complexe, se pare că propeptidele sunt esențiale pentru biogeneza și stabilizarea structurii proteazomale, iar procesarea are loc numai după asamblare. Structura cristalină a arătat, de asemenea, că lanțurile α, deși inactive din punct de vedere catalitic, joacă un rol esențial în stabilizarea structurii cu două inele a lanțurilor β. De asemenea, ei trebuie să joace un rol în legarea complexelor 19S cap, dar structura contactelor și mecanismele de legare vor fi elucidate numai atunci când va fi rezolvată structura cristalină a complexului 26S. Structura cristalină a evidențiat, de asemenea, o distanță de 28 Å între reziduurile Thr1 ale subunităților β active adiacente. Această distanță determină probabil lungimea peptidelor generate în timpul procesului proteolitic (reziduuri ≈8-aa) și explică rolul proteazomului în generarea peptidelor antigenice prezentate pe moleculele MHC de clasă I. Cu toate acestea, existența unor produse intermediare de lungime variabilă sugerează existența unui al doilea situs hidrolitic în aval de Thr1 (vezi mai jos).

O problemă importantă, încă nerezolvată, implică intrarea substraturilor proteice și ieșirea produselor proteolitice din proteazom. Proteazomul archaebacterian (Thermoplasma acidophilum) conține doi pori de intrare de ≈13 Å la cele două capete ale cilindrului înconjurat de segmente definite ale celor șapte lanțuri α. Într-un contrast izbitor și destul de surprinzător, aceste porți de intrare nu există în proteazomul 20S eucariotic, iar intrarea în camera catalitică a inelelor inter-β nu este posibilă de la capetele complexului. Domeniile N-terminale ale α1, α2, α3, α6 și α7 ies în evidență unul față de celălalt și umplu spațiul în mai multe straturi de lanțuri laterale care interacționează strâns. Astfel, intrarea de la capete va fi posibilă numai după o rearanjare substanțială care poate avea loc după asocierea cu complexul 19S. O astfel de rearanjare poate necesita, de asemenea, energie metabolică care poate fi furnizată de activitatea ATPază a mai multor subunități ale complexului 19S. Complexul de drojdie prezintă unele orificii laterale înguste, în special la interfața dintre inelele α și β. Aceste deschideri duc direct la situsurile active Thr1. Ele sunt acoperite cu reziduuri polare care se pot rearanja potențial pentru a genera deschideri de ≈10 Å prin care pot intra substraturi proteice desfășurate și extinse.

Reglarea activității proteazomului 20S are loc la mai multe niveluri. După stimularea celulelor prezentatoare de antigen cu interferon γ, trei subunități β constitutive, 1, 2 și 5, sunt înlocuite cu subunități β noi și distincte, β1i (LMP2), β2i (MECL1) și β5i (LMP7). Noile subunități sunt relativ mai eficiente în generarea peptidelor antigenice recunoscute de moleculele MHC clasa I și de celulele T citotoxice corespunzătoare prin intermediul receptorilor celulelor T. Un alt tip de reglare implică formarea de complexe cu complexe de reglare. Proteazomul 26S este generat după asocierea, dependentă de ATP, a complexului 20S cu două complexe 19S. Complexele 19S sunt compuse din cel puțin 18 proteine distincte cu o masă moleculară cuprinsă între 25-110 kDa. Acest complex servește drept port de intrare în nucleul catalitic și asigură diferite funcții de reglare care sunt necesare pentru a asigura degradarea selectivă a substraturilor marcate cu ubiquitină. Acestea includ, de exemplu, un situs de legare pentru lanțurile de ubiquitină, activitatea de reciclare a ubiquitinei și mai multe ATPaze, precum și capacitatea de a stimula diferitele activități peptidaze ale complexului 20S. Într-adevăr, au fost identificate subunități care desfășoară astfel de activități. De un interes deosebit este subunitatea de legare a lanțului de ubiquitină care a fost descrisă atât la mamifere (S5a), cât și la plante (MBP1). Aceste subunități se leagă de monomerii de ubiquitină; cu toate acestea, lanțurile de polubiquitină, și în special cele care conțin mai mult de patru fracțiuni, se leagă cu o afinitate mai mare. Recent, a fost clonată gena de drojdie care codifică lanțul omolog, Mcb1. În mod surprinzător, mutanții de deleție Δmcb1 nu prezintă niciun defect de creștere și degradează în mod normal proteinele ubiquitinilate, cu excepția proteinei model de fuziune liniară ubiquitin-Pro-β-Gal. Aceștia prezintă, totuși, o ușoară sensibilitate la stres, cum ar fi expunerea la analogi de aminoacizi (15). O posibilă explicație pentru aceste rezultate neașteptate este aceea că proteinele ubiquitinilate sunt recunoscute de o subunitate proteazomală suplimentară, încă nedefinită. Un astfel de candidat este enzima de deubiquitinilare Doa4, care funcționează pentru a îndepărta fracțiunile de ubiquitină din substraturile proteolitice. O posibilitate îndepărtată este ca proteazomul să nu recunoască grupele de ubiquitină, ci, similar chaperonilor moleculari, să se asocieze cu motive deformate rău definite din substratul proteic. Aceste motive sunt generate după „denaturarea” proteinei prin marcarea cu ubiquitină. Identificarea specificității de recunoaștere a proteazomului și a rolului pe care îl joacă ubiquitina în acest proces sunt esențiale pentru înțelegerea mecanismelor de acțiune ale proteazei, în special, și ale sistemului ubiquitinei, în general. O altă funcție de reglementare a proteazomului 19S implică editarea lanțului de poliubiquitină. Complexul conține o izopeptidază de 37 kDa care îndepărtează fracțiunile de ubiquitină unice de la capătul distal al lanțurilor scurte de poli-ubiquitină (16). Se presupune că această izopeptidază este implicată în editarea și salvarea de la degradare a proteinelor slab ubiquitinilate sau lent degradate. Din acest punct de vedere, este diferită de Doa4 și de o izopeptidază dependentă de ATP care este asociată cu proteazomul. Cele două enzime sunt implicate în reciclarea ubiquitinei și în menținerea nivelului de ubiquitină liberă în celulă.

Un alt complex care se asociază cu proteazomul 20S și îi sporește dramatic activitatea este PA28 (REG sau regulatorul 11S; ref. 17 și 18). Spre deosebire de asocierea cu 19S, formarea complexului cu PA28 este independentă de ATP. După asociere, PA28 crește Vmax și scade Km al complexului 20S față de o serie întreagă de peptide diferite. Cu toate acestea, complexul PA28-20S-PA28 este inactiv față de proteinele native intacte sau conjugate cu ubiquitină. Activatorul pur este un complex format din două subunități de ≈28-kDa, PA28α și PA28β, care sunt identice în proporție de ≈50%. Imunoprecipitarea cu anticorpi specifici pentru subunități și experimentele de reticulare chimică au arătat că PA28 este un hexameră în formă de inel care este compus din subunități α și β alternante cu o stoichiometrie de (αβ)3 (19). În mod interesant, aceste subunități sunt, de asemenea, identice în proporție de 30-40 % cu o proteină nucleară cu funcție necunoscută până în prezent, antigenul Ki, care reacționează cu serurile pacienților cu boala autoimună lupus eritematos sistemic. Complexul hexamic are o structură în formă de inel (Fig. 1) și acoperă complexul proteazomului 20S pe una sau pe ambele plăci terminale. Structura capacului este traversată de un canal central cu o deschidere de 20 Å la capătul extrem și o deschidere de 30 Å la suprafața de legare a proteazomului (20, 21). Deschiderile și canalul servesc, cel mai probabil, ca parte a mecanismului de translocare a substraturilor peptidice în drumul spre camera catalitică a complexului 20S. PA28α poate genera hexa- sau hepta-homultimeri care se asociază cu complexul 20S și îl activează, deși, mai puțin eficient decât heteromultimerul (αβ)3. În schimb, PA28β nu se asociază cu complexul 20S și nu are nicio activitate de stimulare. Rolul subunităților β este probabil acela de a modula activitatea PA28 prin influențarea indirectă a activității subunităților α sau prin modificarea afinității particulei PA28 față de proteazomul 20S.

PA28α conține în partea sa centrală o secvență unică, motivul KEKE care este un domeniu hidrofil compus din reziduuri Lys încărcate pozitiv și reziduuri Glu încărcate negativ care alternează. S-a postulat că acest motiv, care nu există în PA28β, promovează interacțiunea proteină-proteină între subunitățile α ale particulei PA28 și subunitățile α ale proteazomului 20S (22). Cu toate acestea, analiza mutațională a arătat că ΔKEKEKE PA28α își păstrează activitatea stimulatoare (23). Cu toate acestea, legarea la proteazomul 20S necesită o terminație C intactă a PA28α și poate implica subunitatea C2 α a proteazomului 20S (8). S-a sugerat că fosforilarea activează activitatea stimulatoare a PA28α, totuși, acest mod de reglare nu a fost stabilit cu fermitate.

Analiza mutațională a PA28α de către Zhang și colegii săi (5) a dezvăluit mai multe mutații inactivante într-o buclă definită la baza moleculei. Unele dintre proteinele mutante se leagă strâns de complexul 20S, dar nu îl pot activa (5). Astfel, legarea la proteazom poate fi clar separată de activitatea stimulativă a PA28. Este interesant faptul că există un decalaj mare în distribuția mutațiilor de inactivare care cuprind reziduurile de aminoacizi 51-122. Această zonă fără mutații reprezintă o regiune care este unică pentru fiecare subunitate din complexul PA28. Probabil că nu este implicată în interacțiunea lui PA28 cu complexul 20S sau în stimularea activității proteolitice a acestuia. Mai degrabă poate juca un rol în funcția particulei în celula intactă, cum ar fi în localizarea sa intracelulară sau asocierea cu alte componente care determină activitatea și interacțiunile sale specifice.

O problemă importantă implică rolurile fiziologice ale PA28. Ambele subunități sunt puternic induse de interferon γ, sugerând un rol al particulei în funcția de procesare a antigenului de către proteazom. Supraexprimarea PA28α într-o linie de fibroblaste de șoarece care exprimă proteina pp89 a citomegalovirusului are ca rezultat o intensificare marcată a recunoașterii de către celulele T citotoxice specifice pp89. În mod similar, prezentarea unei nucleoproteine gripale a fost, de asemenea, îmbunătățită (24). Studiile efectuate într-un sistem fără celule au arătat că, prin utilizarea unui mecanism coordonat de dublă clivare, complexul PA28-20S-PA28 poate tăia eficient peptidele mari (care au secvențe flancate atât la extremitatea N, cât și la extremitatea C) la epitopi antigenici exacți recunoscuți de complexul MHC și de celula T citotoxică corespunzătoare (25). Astfel, se pare că PA28 joacă un rol important în procesarea antigenelor pentru prezentarea pe moleculele MHC de clasă I. Deoarece proteazomul PA28-20S-PA28 nu poate digera proteinele native intacte sau ubiquitinilate, acesta trebuie să acționeze în aval față de proteazomul 19S-20S-19S care degradează proteinele marcate cu ubiquitină sau peptidele mari. De asemenea, este posibil, deși nu a fost demonstrat, să existe un singur proteazom 19S-20S-PA28 asimetric care poate efectua acest proces proteolitic în două etape, proteoliza inițială până la peptide mari și tăierea finală. Proteazomii simetrici sau putativ asimetrici care conțin PA28 pot fi, de asemenea, implicați în degradarea terminală a peptidelor în aminoacizi liberi, o activitate care nu poate fi catalizată de proteazomul 19S-20S-19S (Fig. 1). Astfel, se pare că elucidarea rolurilor celulare ale complexului PA28 va trebui să aștepte experimente suplimentare.

.