Apoenzima

5.11.3 Rolul proteinei-Interacțiunile dintre enzimă, coenzimă și substrat

În toate cazurile, coenzima este legată de apoenzimă fără o modificare profundă a spectrului de absorbție. Această observație sugerează că enzima nu denaturează inelul de corină de la conformația sa de soluție în stare fundamentală. Cu toate acestea, din spectrul de absorbție UV-vizibil al complexului coenzimă-proteină nu sunt disponibile informații privind identitatea ligandului α-axial. Studiile au arătat că ligandul α-axial 5,6-dimetilbenzimidazol este înlocuit cu o catenă laterală de histidină din proteina respectivă în cel puțin trei enzime dependente de cobalamină: metionină-sintetaza,4,7 metilmalonil-CoA-mutaza,8,45,46 și glutamat-mutaza.47 În schimb, ligandul 5,6-benzimidazol din cobalamină ocupă încă poziția de ligand α-axial în AdoCbl legat de diol dehidrază48 și de ribonucleotidă reductază (a se vedea capitolul 5.08).

Pentru a acomoda coordonarea de către lanțul lateral de histidină, „bucla nucleotidă” a bazei 5,6-dimetilbenzimidazol, a ribofuranosilfosfodiesterului și a lanțului lateral de propionamidă trebuie să oscileze departe de inelul de corrin și să se insereze într-un buzunar de legare în interiorul proteinei. Secvența consensuală DxHxxG a fost identificată în enzimele dependente de cobalamină care înlocuiesc ligandul α-axial cu un lanț lateral de histidină.7,49,50 Histidina care se coordonează cu atomul de cobalt interacționează cel mai probabil cu reziduul de aspartat printr-o legătură de hidrogen. Dincolo de rolul de ligand coordonator, funcția exactă a diadei His/Asp ca modulator al activității enzimatice nu este încă clară.49 Alte reziduuri din situsul activ pot participa, de asemenea, la o rețea extinsă de legături de hidrogen pentru a controla reactivitatea la nivelul centrului metalic.7

Enzimele dependente de adenozilcobalamină trebuie să crească rata de homoliză a legăturii CoC cu cel puțin un factor de 1012 pentru a atinge rata de cataliză observată.14 Labilizarea adenozilcobalaminei cere slăbirea legăturii CoC pentru a permite fisiunea homolitică. Deși nu este un concept dovedit în enzimele dependente de cobalamină, energia suficientă pentru a distorsiona (slăbi) legătura CoC ar putea proveni cu ușurință din utilizarea excesului de energie de legare care provine din interacțiunile multiple de legătură de hidrogen cu cofactorul cobalamină, inclusiv lanțurile laterale amidice care decorează inelul de corrină.51 Lanțurile laterale amidice sunt, de asemenea, elemente importante de recunoaștere pentru legarea la proteinele de transport neenzimatic al cobalaminei transcobalamina, haptocorrina și factorul intrinsec.52 Îndepărtarea sau derivarea chimică a lanțurilor laterale amidice specifice modifică legătura cu transcobalamina de 3-40 de ori52 , iar îndepărtarea completă a lanțului lateral c-amidic permite introducerea unei duble legături suplimentare în scheletul macrociclic, aplatizând astfel inelul corrin cu o deplasare spre roșu a maximului de absorbție53 .

În plus față de promovarea reacției dorite, enzimele dependente de adenozilcobalamină îndeplinesc o a doua funcție importantă prin prevenirea reacțiilor secundare nedorite care însoțesc adesea reacțiile radicale.54 Această funcție de cataliză negativă54 necesită o suprafață de energie liberă foarte constrânsă, care ar putea fi imaginată ca un canion adânc prin care reacția progresează de-a lungul suprafeței de energie liberă. Acest canion trebuie să aibă pereți abrupți pentru a preveni reacțiile secundare și a constrânge intermediarul radicalic foarte reactiv. La sfârșitul secvenței de reacție, radicalul intermediar este stins prin recombinare a radicalului 5′-deoxiadenozil și a cob(II)alaminei, regenerând astfel starea de bază (starea de repaus) a cofactorului adenozilcob(III)alamină. Dacă enzima investește 25 kcal mol-1 pentru a promova omoliza legăturii C-Co pentru a începe ciclul catalitic, această energie trebuie să fie recuperată la sfârșitul secvenței de reacție. Recuperarea energiei nu ar fi posibilă dacă ar avea loc o secvență nedorită de rearanjări pentru a produce un radical care este termodinamic mai stabil decât radicalul 5′-deoxiadenozil. Prin urmare, enzima trebuie să împiedice ca radicalul alchil să se rearanjeze într-un intermediar cu energie scăzută sau să migreze prin scheletul proteic pentru a forma un radical stabil care nu poate participa la cataliză.55

O specie paramagnetică nu se formează până când toate componentele reacției nu sunt prezente în complexul enzimă-substrat, deoarece formarea unui radical derivat din coenzime în absența substratului ar putea duce la reacții secundare nedorite. Experimentele EPR cu metilmalonil-CoA-mutaza46,55 confirmă faptul că homoliza legăturii CoC are loc numai după adăugarea substratului, după cum indică apariția unui semnal EPR asemănător produsului.46 În mod similar, experimentele spectrofotometrice cu flux oprit cu etanolamină amoniac liază arată că semnătura cob(II)alaminei apare în spectrul vizibil numai după ce enzima și coenzima sunt combinate cu niveluri saturate de substrat.56-59

Fotoliza, termoliza și omoliza promovată de enzimă a legăturii CoC a adeno- silcobalaminei are ca rezultat perechea de radicali singulet formată din cob(II)alamin și radicalul 5′-deoxiadenozil.60,61 Deoarece toate aceste procese conduc la formarea aceleiași perechi de radicali, informațiile din dinamica reacției studiilor de fotoliză pot fi legate de mecanismele de reacție enzimatică propuse. Fotohomoliza adenozilcobalaminei începe cu o promovare electronică π → π* în inelul corinic și trebuie să implice o stare intermediară de transfer de sarcină pe drumul spre omoliza legăturii CoC.60,61 Studiile de fotoliză în picosecunde ale adenozilcobalaminei relevă rate de recombinare a perechilor de radicali geminați de 109 s-1, cu randamente fracționare de recombinare în cușcă, Fc, de aproximativ 94%.42,62-64 Studiile de fotoliză în nanosecunde și în undă continuă ale cobalaminelor confirmă o recombinare eficientă a perechilor de radicali în cușca geminată, cu un randament cuantic fotochimic global de aproximativ 20% pentru adenozilcobalamină și 35% pentru metilcobalamină.65,66 În absența enzimei, o fracțiune mare din perechile de radicali geminați se recombină înainte de a se produce o separare difuzională semnificativă. Pentru a stabiliza radicalul 5′-deoxiadenozil și pentru a promova cataliza, enzima trebuie să mărească distanța de separare a perechilor de radicali, probabil printr-o modificare conformațională. Oricare ar fi mecanismul, rata ridicată de recombinare geminată în perechea de radicali impune ca una dintre funcțiile enzimei să fie aceea de a separa radicalii sau de a capta temporar unul dintre radicali pentru a preveni recombinarea prematură.

Deși perechile de radicali singlet {5′-deoxiadenozil radical:cob(II)alamin} rezultate au stări electronice identice,59-61,67 homoliza enzimatică a legăturii CoC nu poate accesa o stare electronică excitată și trebuie să înceapă cu un alt proces pentru a slăbi legătura CoC și a deplasa echilibrul spre disociere (vezi secțiunea 5.11.2). Clivajul indus de deformare nu numai că va duce la omoliza legăturii CoC, dar acest proces va crește, de asemenea, distanța de separare a perechilor radicale dacă o componentă a deformării are loc de-a lungul axei apicale a cobaltului. Această abordare de forță brută de întindere a legăturii CoC poate fi metoda cea mai eficientă pentru a obține atât omoliza cât și o scădere netă a ratei de recombinare a perechilor radicale.

Este de asemenea posibil ca enzima să întărească legătura CoC și să defavorizeze omoliza prin comprimarea interacțiunii apicale Co-α-N. Au fost studiate proprietățile termodinamice ale analogilor de adenoilcobinamidă + și +. 68 O legătură CoC mai puternică a fost observată în + cu o distanță mai mică a legăturii CoN în comparație cu piridina ca bază α-axială. Legătura CoC mai puternică conduce la o schimbare semnificativă spre heteroliză ca cale preferată. În acest sistem model, enzima studiată, metilmalonil-CoA-mutaza, trebuie fie să prevină heteroliza CoC, fie să urmeze o cale heterolitică.68

În metionină-sintetază, porțiunea de corină a cobalaminei este intercalată între două domenii ale unui fragment de 27 kDa, coada nucleotidei pătrunzând într-un buzunar adânc format de reziduuri ale domeniului C-terminal.7,69,70 Această secvență conține o regiune de hidrofobicitate moderată care este flancată de segmente hidrofile extinse.71 Se așteaptă similitudini structurale între domeniile care fac interfață cu inelul corrin. Domeniul α/β care se leagă de jumătatea inferioară a inelului de corrină și găzduiește coada nucleotidă extinsă (fracțiunea fosfodiester și grupul 5,6-dimetilbenzimidazol) în metionină-sintetază și metilmalonil-CoA-mutază este, de asemenea, de așteptat în glutamatul-mutază (vide infra).

.