Aplicații emergente ale sporilor bacterieni în nanobiotehnologie

Învelișurile sporilor sunt alcătuite din proteine, au rețele ordonate de subunități protomerice, prezintă autoasamblare și au proprietăți de protecție. În calitate de forme de viață inactive din punct de vedere metabolic, sporii pot supraviețui la nesfârșit în stare deshidratată și, într-adevăr, a fost documentat faptul că au supraviețuit intacte timp de milioane de ani . Sporul poate rezista la temperaturi de până la 90°C, precum și la expunerea la substanțe chimice nocive . Majoritatea (dar nu toate) bacteriilor care formează spori aparțin la două genuri principale, Bacillus și Clostridium. Clostridiile care formează spori, spre deosebire de Bacillus, se diferențiază numai în condiții anaerobe, ceea ce face ca Bacillus să fie genul cel mai potrivit pentru studiu.

Speciile de Bacillus produc un singur spor sau endospor (spre deosebire de exosporii fungici), în interiorul celulei bacteriene printr-un proces de diferențiere care necesită acțiunea coordonată a sute de gene de dezvoltare . În mod obișnuit, sporii maturi au o lungime de 0,8-1,2 μm și au o formă sferică sau elipsoidală (a se vedea figura 1A). Un singur cromozom bacterian este condensat în centrul sporului, cunoscut sub numele de nucleu. Straturile de membrană lipidică și de peptidoglican modificat înconjoară nucleul sporului, dar cea mai importantă structură este învelișul sporului. Acest înveliș proteic stratificat oferă sporului rezistență la solvenți organici și la lizozim. La Bacillus subtilis sunt prezente până la 25 de proteine de înveliș diferite în două straturi de înveliș distincte (figura 1B), învelișul interior și exterior, dar la alte specii există dovezi că învelișul este mai puțin complex și, în unele cazuri, poate consta doar din câteva tipuri de proteine. Structura și asamblarea stratului de acoperire a sporilor apare în prezent ca un sistem model pentru înțelegerea proceselor complexe de asamblare morfogenetică, asemănător studiilor clasice privind asamblarea fagului T4. Stratul exterior, dens din punct de vedere electronic, al învelișului B. subtilis este alcătuit din 5 polipeptide principale, CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) și CotF (8 kDa). CotA este o oxidază multi-cupru și se poate acumula în forme multimerice (observate la microscop) în interiorul celulelor sporulante la unii mutanți cu defect de acoperire. Se presupune că oligomerizarea și autoasamblarea CotA precedă depunerea pe suprafața stratului de acoperire a sporilor. S-a demonstrat, de asemenea, că proteinele CotG și CotB interacționează în mod covalent și, în plus, CotG și CotC au secvențe de aminoacizi extrem de neobișnuite care conțin repetiții multiple (>13) de 12-13 aminoacizi bogate în lizine și tirozine. În plus, multe dintre proteinele de acoperire a sporilor au profiluri neobișnuite, adică forme multimerice și mase moleculare aberante, atunci când sunt examinate prin SDS-PAGE. Recent, s-a demonstrat că învelișul sporilor este de fapt flexibil și se poate extinde și contracta, iar această caracteristică este esențială pentru formarea sporilor atunci când sporul se deshidratează și, în mod similar, pentru germinare atunci când sporul se rehidratează. Acest aspect al unei structuri autoasamblate este deosebit de interesant și ar putea oferi o serie de aplicații viitoare în domeniul administrării de medicamente, al nanofabricării și al acoperirilor de suprafață.

Endospori bacterieni. Panoul A prezintă endospori de la B. subtilis, dintre care unul este încă reținut în interiorul „celulei mamă” în formă de tijă. La B. subtilis, sporii au o lungime de aproximativ 1,2 μm și sunt elipsoidali. Sporii elipsiți au un înveliș protector transparent, cunoscut sub numele de învelișul sporului, care este alcătuit din până la 25 de componente protomerice diferite asamblate în straturi discrete. Panoul B prezintă o fracționare tipică SDS-PAGE (12,5 %) a proteinelor solubilizate din învelișul sporului, care dezvăluie speciile predominante.

Engineering the Bacterial Spore Coat

O strategie de inginerie a sporilor de Bacillus subtilis pentru a afișa antigene heterologe pe suprafața sporului a fost raportată recent și este ilustrată în figura 2. Un sistem de afișare bazat pe spori oferă mai multe avantaje în comparație cu sistemele bazate pe utilizarea celulelor bacteriene, acestea incluzând robustețea sporului bacterian care permite stocarea în formă desicată, ușurința de producție, siguranța și o platformă tehnologică susținută de instrumente extinse de manipulare genetică.

Afișarea pe suprafața sporului utilizând proteine din învelișul sporului. Sporul de B. subtilis este compus dintr-un miez intern (galben) înconjurat de un cortex asemănător peptidoglicanului (în roșu) și un înveliș proteic subîmpărțit într-o parte internă (gree) și una externă (neagră). Proteina de fuziune, compusă dintr-o parte purtătoare (albastru) și o parte pasageră (violet) este expusă pe suprafața sporului.

În contrast cu multitudinea de informații disponibile despre modul în care expresia genică controlează diferențierea unei celule în creștere într-un spor latent, se cunosc puține informații despre mecanismele de încorporare a proteinelor în înveliș, natura componentelor structurale care formează partea cea mai externă a învelișului și dacă există motive de ancorare. Încercările inițiale de a expune proteine heterologe pe suprafața sporului s-au concentrat asupra a două componente ale învelișului, CotB și CotC. În cazul CotB, se știe că această proteină a învelișului sporului este localizată la suprafață, în timp ce pentru CotC, în raport cu alte proteine ale învelișului, această specie are o abundență relativă ridicată . Observarea faptului că aceste două componente ale învelișului sunt dispensabile pentru formarea unui spor aparent normal, precum și pentru germinarea acestuia, a fost o caracteristică pozitivă suplimentară în alegerea CotB și CotC ca potențiale proteine purtătoare.

Două antigene au fost inițial selectate ca proteine model pentru a fi afișate pe suprafața sporului: i) fragmentul C-terminal non-toxic de 459 de aminoacizi al toxinei tetanice (TTFC), un 51 bine caracterizat și foarte imunogen.8 kDa , codificată de gena tetC a Clostridium tetani; și ii) subunitatea B de 103 aminoacizi a toxinei termolabile a tulpinilor enterotoxigene de Escherichia coli (LTB), o peptidă de 12 kDa, codificată de gena eltB .

CotB ca proteină purtătoare

Ca și alte componente ale învelișului, CotB a fost asociată la stratul exterior al învelișului pe baza dovezilor genetice și doar recent o analiză imunocitofluorimetrică efectuată pe spori intacți a arătat că CotB este accesibilă anticorpilor specifici CotB și, prin urmare, că este cel mai probabil expusă pe suprafața sporului .

Gena structurală CotB, cotB, se află sub controlul transcripțional dual al σK și al proteinei GerE de legare a ADN-ului. În consecință, cotB este transcrisă numai în compartimentul celulei mamă a celulei sporulante . Odată sintetizată în citoplasma celulei mamă, CotB este asamblată în jurul sporului în formare într-un mod oarecum dependent de CotE, CotG și CotH. Prin urmare, CotB și proteina heterologă fuzionată în cele din urmă cu aceasta, nu suferă o etapă de translocare a peretelui celular, tipică sistemelor de afișare din alte bacterii.

CotB are o jumătate C-terminală puternic hidrofilă formată din trei repetări de 27 de aminoacizi bogate în reziduuri de serină, lizină și glutamină. Reziduurile de serină reprezintă peste 50% din jumătatea C-terminală a CotB. S-a sugerat că reziduurile de lizină din repetițiile CotB reprezintă situsuri de reticulare intra- sau intermoleculară, prin analogie cu proteinele din țesutul conjunctiv colagen și elastină . Proteina CotB are o masă moleculară dedusă de 46 kDa, dar migrează pe SDS-PAGE ca o polipeptidă de 59 kDa. Recent, discrepanța dintre greutatea moleculară măsurată și cea dedusă a fost explicată prin demonstrarea faptului că CotB este sintetizată inițial ca o specie de 46 kDa, și transformată într-un homodimer de 59 kDa , care păstrează atât extremitățile N- cât și C-terminale prezise din secvența nucleotidică CotB.

Strategia de obținere a recombinantului B. subtilis care exprimă CotB-TTFC sau CotB-LTB pe suprafața lor s-a bazat pe (i) utilizarea genei cotB și a promotorului acesteia pentru construcția fuziunilor translaționale și (ii) integrarea cromozomială a fuziunilor genelor cotB-tetC și cotB-eltB în secvența codificatoare a genei neesențiale amyE (Figura 3A) . Plasarea proteinelor de fuziune sub semnalele transcripționale și translaționale ale cotB a asigurat sincronizarea corectă a expresiei în timpul sporulației, în timp ce integrarea cromozomială a acesteia a garantat stabilitatea genetică a construcției. Din cauza lipsei de informații cu privire la asamblarea hainei CotB și la cerințele privind motivele de ancorare, încercările inițiale au fost efectuate prin poziționarea proteinei pasager la C-terminal, N-terminal sau în mijlocul CotB (figura 3B).

Sistem de afișare pe suprafața porilor la B. subtilis . (A) Vedere schematică a integrării fuziunilor de gene pe cromozom. Barele roșii reprezintă fuziunea genică, barele gri și verzi reprezintă gena neesențială amyE din B. subtilis utilizată ca situs de integrare și, respectiv, gena cloramfenicol acetil transferază (cat) utilizată ca marker selectabil. (B) Reprezentarea schematică a proteinelor de fuziune care utilizează fie CotB de lungime completă (380 aminoacizi), fie CotBΔ105 (275 aminoacizi) sau CotC (66 aminoacizi) ca proteine purtătoare (toate în albastru). Cele trei repetări de 27 de aminoacizi din CotB complet și partea rămasă în CotBΔ105 sunt în negru. Barele mov reprezintă partea heterologă a fuziunilor (TTFC sau LTB).

Când TTFC și LTB au fost fuzionate la capătul C-terminal al CotB, proteinele chimerice nu au reușit să se asambleze corect pe suprafața sporului (Isticato și Ricca, nepublicat). Aceste eșecuri inițiale au fost atribuite unei potențiale instabilități a construcțiilor, fie la nivel de ADN (secvențe repetitive de ADN), fie la nivel de proteine. Pentru a ocoli astfel de probleme, TTFC și LTB au fost fuzionate la capătul C-terminal al unei forme de CotB eliminată din cele trei repetiții de 27 de aminoacizi, CotBΔ105-TTFC (Fig. 3A). Spre deosebire de versiunea completă, proteina chimeră CotBΔ105-TTFC a fost asamblată corect și expusă pe suprafața sporului. Un dot blot cantitativ a arătat că fiecare spor recombinant a expus o cantitate de proteină de fuziune CotBΔ105-TTFC egală cu 0,00022 pg, ceea ce permite să se concluzioneze că 1,5 × 103 molecule chimerice sunt prezente pe suprafața fiecărui spor recombinant.

Spre deosebire de CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB nu a fost asamblat corect. Tulpina care exprimă această chimeră a prezentat o eficiență redusă a sporulației și a germinației, iar sporii săi nu au fost rezistenți la lizozimă. Aceste observații, împreună cu analiza SDS-PAGE a proteinelor de înveliș eliberate, au sugerat că prezența lui CotBΔ105-LTB a modificat puternic stratul de înveliș al sporilor. O analiză in-silico a arătat o oarecare omologie între produsul chimeric (în regiunea de fuziune) și LytF, o endopeptidază asociată peretelui celular produsă de B. subtilis în timpul creșterii vegetative, ridicând astfel posibilitatea ca produsul chimeric să interfereze cu formarea corectă a stratului prin degradarea unor componente ale stratului (Mauriello și Ricca, date nesemnate).

În plus față de fuziunea de la capătul C-terminal descrisă mai sus, proteina pasager model TTFC a fost fuzionată și la N-terminal și în mijlocul CotB (Fig. 3B). În ambele cazuri s-a folosit forma CotBΔ105 a CotB pentru a evita problemele întâmpinate cu fuziunea C-terminală (a se vedea mai sus). Atât fuziunea N-terminală, cât și fuziunea sandwich au dat naștere unor produse chimerice care s-au asamblat în mod corespunzător în structura hainei atât din punct de vedere calitativ, cât și cantitativ . Cel puțin în cazul CotB, a fost apoi posibil să se concluzioneze că, în cazul în care proteina pasageră este expusă, aceasta nu afectează afișarea pe suprafața sporului.

CotC ca proteină purtătoare

CotC este o componentă de 12 kDa, solubilă în baze alcaline, a învelișului sporilor de B. subtilis, identificată anterior prin genetică inversă și apoi asociată la stratul exterior al învelișului pe baza dovezilor genetice . CotC a fost considerat inițial drept un candidat purtător datorită abundenței sale relative în strat (figura 1B). Împreună cu CotG și CotD, CotC reprezintă aproximativ 50 % din totalul proteinelor de înveliș solubilizate. Aceste cantități relativ mari ar putea permite asamblarea pe strat a unui număr semnificativ de chimere bazate pe CotC, asigurând astfel o prezentare heterologă eficientă. Expresia genei CotC este controlată de factorul σ specific celulei mamă σK și de regulatorii transcripționali GerE și SpoIIID. Ca și în cazul CotB, CotC este de asemenea transcrisă în celula mamă, iar asamblarea sa pe manta nu necesită translocare de membrană. Produsul primar al genei CotC este o polipeptidă de 66 de aminoacizi extrem de bogată în reziduuri de tirozină (30,3%) și lizină (28,8%) . Cu toate acestea, s-a demonstrat recent că CotC este asamblat în cel puțin patru forme proteice distincte, cu dimensiuni cuprinse între 12 și 30 kDa . Două dintre acestea, având mase moleculare de 12 și 21 kDa și corespunzând cel mai probabil unei forme monomerice și, respectiv, homodimerice de CotC, sunt asamblate pe sporul în formare imediat după sinteza lor, la opt ore de la debutul sporulației. Celelalte două forme, 12,5 și 30 kDa, sunt probabil produsele unor modificări posttranslaționale ale celorlalte două forme, care au loc direct pe suprafața învelișului în timpul maturării sporului.

În cazul CotC, până în prezent au fost construite numai fuziuni C-terminale (figura 3B). Atât fuziunile genelor CotC-TTFC, cât și CotC-LTB au fost obținute prin clonarea tetC sau eltB în cadrul cu ultimul codon CotC sub controlul transcripțional și translațional al regiunii promotoare CotC. Fuziunea genică a fost apoi integrată în cromozomul B. subtilis la nivelul locusului amyE prin recombinare dublă încrucișată (figura 3A). Ambele proteine chimerice au fost asamblate pe învelișul sporilor recombinanți fără un efect major asupra structurii și/sau funcției sporului, deoarece au apărut identice cu sporii de tip sălbatic în ceea ce privește eficiența sporulației și germinației și proprietățile de rezistență. Analiza Western blot, analiza citofluorimetrică și, pentru CotC-TTFC, microscopia de imunofluorescență (figura 4) au arătat că ambele chimeri pe bază de CotC au fost afișate pe suprafața sporilor recombinanți. O determinare cantitativă a proteinelor recombinante expuse pe sporii de B. subtilis a arătat că cca. 9,7 × 102 și 2,7 × 103 molecule de CotC-TTFC și, respectiv, CotC-LTB, au fost extrase din fiecare spor.

Detectarea prezenței CotC-LTB și CotC-TTFC prin microscopie de imunofluorescență. Sporularea tulpinilor de B. subtilis a fost indusă prin metoda resuspensiei, iar probele au fost prelevate la 6 h de la debutul sporulării și analizate prin microscopie de imunofluorescență, așa cum s-a descris anterior . Probele au fost marcate cu un anticorp anti-LTB de șoarece urmat de un conjugat IgG-TRITC anti-șoarece (fluoresceină roșie, panourile A & B) sau cu un anticorp anti-TTFC de iepure urmat de un conjugat IgG-FITC anti-rabbit (fluoresceină verde, panourile C & D). Panourile A & C, sporii de tip sălbatic; panoul B, sporii izogeni care exprimă CotC-LTB); panoul D, sporii izogeni care exprimă CotC-TTFC.

Deși CotC pare mai abundent decât CotB în interiorul învelișului, cantități comparabile de proteine heterologe sunt expuse de sistemele bazate pe CotC și CotBΔ105. Acest rezultat a fost oarecum neașteptat, deoarece CotC pare a fi mult mai abundent decât CotB în strat. O posibilă explicație provine din descoperirea recentă că extremitatea C-terminală a CotC nu este esențială doar pentru interacțiunea cu alte molecule CotC, ci și cu alte componente ale mantiei (Isticato și Ricca, manuscris în pregătire) și, prin urmare, arată că utilizarea CotC ca purtător trebuie încă optimizată.

Stabilitatea proteinelor expuse în spori

Unul dintre principalele motive pentru a propune utilizarea sporului bacterian ca sistem de expunere favorabil este stabilitatea sa bine documentată. Sporii pot fi pur și simplu depozitați la temperatura camerei pentru o perioadă lungă de timp, fără reducerea proprietăților lor de rezistență și stabilitate. Aceasta ar fi o proprietate extrem de utilă pentru o varietate de aplicații biotehnologice. De exemplu, în cazul în care proteina pasageră este un antigen, sporul recombinant ar putea deveni un vaccin oral ideal, stabil la căldură, pentru utilizare în țările în curs de dezvoltare, unde stabilitatea la căldură este cea mai îngrijorătoare din cauza distribuției și depozitării deficitare.

Cu toate acestea, în timp ce stabilitatea sporului este bine documentată , stabilitatea proteinelor heterologe expuse pe suprafața sporului a fost investigată doar recent. Sporii care exprimă CotBΔ105-TTFC (a se vedea mai sus) și sporii parentali au fost depozitați la -80°C, -20°C, +4°C și la temperatura camerei și au fost testați la diferite perioade de depozitare până la 12 săptămâni. În toate cazurile, cantitatea de proteină heterologă prezentă pe suprafața sporilor recombinanți a părut identică între sporii proaspăt preparați și cei depozitați timp de până la 12 săptămâni (Fig. 5). Aceste rezultate, care indică faptul că proteinele heterologe pot fi expuse în mod stabil pe suprafața sporilor recombinanți, confirmă sistemul bazat pe spori ca fiind o abordare de afișare foarte promițătoare, care ar putea depăși unele dezavantaje ale altor sisteme și care ar putea găsi aplicații într-o serie de domenii biotehnologice diverse.

Analiză prin tehnica dot blot a proteinelor extrase din sporii de tip sălbatic și din sporii care expun chimera CotBΔ 105 -TTFC. Sporii proaspăt purificați care exprimă chimera CotBΔ105-TTFC (t0) sau după 4, 8 sau 12 săptămâni (t4, t8 și t12) de depozitare la temperatura camerei au fost examinați prin dot blotting al proteinelor extrase din învelișul sporilor. Sunt indicate concentrațiile de TTFC purificat (în nanograme) și de proteine de înveliș (în micrograme). Proteinele au fost încărcate și reacționate cu anticorpi monoclonali anti-TTFC (Boeringher), apoi cu anticorpi secundari conjugați cu fosfatază. Semnale de intensitate similară au fost obținute cu spori proaspăt purificați și cu spori păstrați la temperatura camerei timp de până la 12 săptămâni.

Probă de principiu pentru vaccinarea orală folosind tetanosul ca boală model

Sporii care exprimă CotBΔ105-TTFC au fost utilizați pentru imunizarea șoarecilor pe cale orală . IgG serice și sIgA fecale au arătat o seroconversie clară la TTFC. Schema de dozare a utilizat trei seturi de trei doze (1,67 × 1010) pe parcursul a 5 săptămâni și s-a bazat pe regimuri optimizate pentru imunizările orale . Titlurile de IgG specifice TTFC după 33 de zile (>103) au sugerat că acestea erau la niveluri de protecție, iar șoarecii provocați cu toxina tetanică corespunzătoare la 10 LD50 au fost complet protejați. Din opt șoareci provocați cu o doză de 20 LD50, șapte au supraviețuit, ceea ce sugerează că acesta a fost pragul de protecție. Un studiu similar a fost realizat folosind imunizarea nazală cu spori de CotB-TTFC, dar cu o doză mai mică și trei imunizări. În acest caz, răspunsurile IgG specifice TTFC au fost mai scăzute, dar au arătat totuși seroconversie. Aceste studii arată că sporii modificați care exprimă un antigen heterolog pot fi utilizați pentru imunizarea protectoare. În plus, deși răspunsurile la nivelul mucoaselor nu sunt importante pentru protecția împotriva Clostridium tetani (un agent patogen sistemic), acestea sunt în mod evident importante pentru agenții patogeni din mucoase. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a optimiza regimurile de dozare (mai puține doze și mai puțini spori), dar aceste studii seminale au deschis calea pentru dezvoltarea împotriva agenților patogeni specifici pentru mucoase. Deși aceste studii sunt încurajatoare și demonstrează răspunsuri umorale, nu există încă dovezi clare care să indice răspunsuri celulare. Cu toate acestea, s-a demonstrat că sporii se diseminează în GALT și se găsesc în plăcile Peyer (PP) și în ganglionii limfatici mezenterici . Dimensiunea mică a sporului (1 μm) ar permite ca acesta să fie preluat de celulele M și transportat în PP, unde ar putea interacționa cu celulele prezentatoare de antigen. Studiile inițiale au arătat că sporii pot germina și persista pentru o perioadă scurtă de timp în macrofagele intestinale, precum și că pot declanșa citokine Th 1 in vivo, cum ar fi IFN-γ .

.