Accesibilitatea și arhitectura cromatinei

Figura 3: Tehnici de conformație a cromosomului. Diferite etape ale 3C, 4C, 5C, ChIA-PET și Hi-C.

Capturarea conformației cromatinei (3C)

3C utilizează reticulare cu formaldehidă pentru a bloca structura tridimensională a cromatinei în poziție, urmată de digestia cu enzime de restricție. Fragmentele de ADN extirpate sunt apoi analizate prin qPCR și secvențiere pentru a identifica unde sunt conectate regiunile îndepărtate de ADN. Această abordare pentru analizarea structurii și interacțiunilor 3D ale cromatinei in vivo a fost dezvoltată pentru prima dată în 2002 (Dekker et al., 2002), iar de atunci a devenit fundamentul unei serii de tehnici înrudite care au fost dezvoltate pentru a obține o scară mai mare, un randament mai mare sau o mai mare specificitate.

Capturarea conformației cromozomului circularizat (4C)

4C permite identificarea unor regiuni de ADN necunoscute anterior care interacționează cu un locus de interes, ceea ce face ca 4C să fie ideală pentru descoperirea unor interacțiuni noi în cadrul unei regiuni specifice (Dekker et al., 2006).

4C sfaturi utile:

• Alegeți enzimele de restricție potrivite. Cele mai frecvente enzime de tăiere (adică situsurile de recunoaștere de patru pb) sunt mai bune pentru interacțiunile locale între regiunea de interes și secvențele apropiate de pe același cromozom (van der Werken et al., 2012).
• Optimizați reticularea. Concentrațiile mai mici de formaldehidă favorizează autolegarea nedorită a regiunii de interes, dar previn, de asemenea, „mingile de păr” de ADN care împiedică tăierea de către enzima de restricție. Concentrațiile ridicate de formaldehidă reduc evenimentele de autoligare, dar cresc „hairballs”. Trebuie aleasă o concentrație optimă de formaldehidă pentru situația experimentală specifică pentru a echilibra aceste considerente. Tratamentul cu 1% formaldehidă timp de 10 min este un bun punct de plecare pentru majoritatea experimentelor (van der Werken et al., 2012).

Capturarea conformației cromozomului în copie de carbon (5C)

5C generează o bibliotecă de orice produse de ligare din regiunile de ADN care se asociază cu loci țintă, care sunt apoi analizate prin NGS. 5C este ideală atunci când sunt necesare detalii mari despre toate interacțiunile dintr-o anumită regiune, de exemplu atunci când se face o diagramă detaliată a matricei de interacțiune a unui anumit cromozom. Cu toate acestea, 5C nu este cu adevărat la nivelul întregului genom, deoarece fiecare amorsă 5C trebuie să fie proiectată individual, astfel încât este cea mai potrivită pentru anumite regiuni (Dotsie și Dekker, 2007).

C5C sfaturi utile:

• Selectați enzima de restricție potrivită. Alegerea unei enzime care funcționează eficient în condițiile experimentale specifice este esențială. De exemplu, BamHI nu este recomandată pentru majoritatea experimentelor din cauza ineficienței în condițiile 3C (Dotsie et al., 2007).
• Optimizați designul amorselor. 5C utilizează doi amorsori: un amorsor 5C înainte, care se leagă în amonte de situsul de ligare, și un amorsor invers care se leagă imediat în aval. Lungimea amorselor trebuie ajustată astfel încât temperatura de recoacere să fie de aproximativ 65°C pentru a permite amorselor să se aneantizeze exact cu fragmentele lor de restricție. Asigurați-vă că amorsele 5C sunt sintetizate cu un fosfat la capătul 5′ pentru ligare.
• Utilizați un șablon de control. Acesta va controla diferențele de eficiență a amorselor. Se recomandă o bibliotecă de control construită din întreaga regiune genomică studiată. Dacă această bibliotecă nu este construită, atunci cercetătorii ar trebui să fie conștienți de faptul că frecvențele de interacțiune vor fi mai puțin precise.

Analiza interacțiunii cromatinei prin secvențiere cu tag-uri împerecheate (ChIA-PET)

ChIA-PET ia aspecte din ChIP și 3C pentru a analiza interacțiunea regiunilor îndepărtate de ADN prin intermediul unei anumite proteine.

ChIA-PET este cel mai bine utilizată pentru experimentele de descoperire care implică o proteină de interes și ținte necunoscute de legare la ADN. Locurile de legare a factorilor de transcripție, de exemplu, sunt cel mai bine studiate cu ChIA-PET, deoarece această tehnică necesită ca ADN-ul să fie legat de factorul de transcripție in vivo pentru ca interacțiunea să fie numită (Fullwood et al., 2009).

Chiar sfaturi utile ChIA-PET:

• Suprapuneți etichetele PET pentru a reduce fundalul. La fel ca majoritatea tehnologiilor 3C, zgomotul de fond reprezintă o provocare tehnică. În special în ChIA-PET, zgomotul poate face dificilă găsirea interacțiunilor cu rază lungă de acțiune cu locusul de interes. Un sfat util pentru a depăși acest lucru este de a cere ca etichetele PET să se suprapună la ambele capete ale regiunii pentru a fi o interacțiune de lungă distanță.

ChIP-loop

ChIP-loop este un amestec de ChIP și 3C care utilizează anticorpi direcționați către proteine suspectate că se leagă de o regiune de ADN de interes. ChIP-loop este ideal pentru a afla dacă două regiuni ADN cunoscute interacționează prin intermediul unei proteine de interes. ChIP-loop este, de asemenea, potrivit pentru confirmarea interacțiunilor suspectate, dar nu și pentru descoperirea unor interacțiuni noi (Horike et al., 2005).

Consiliere utile ChIP-loop:

• Evitați buclele non-native. Cea mai mare problemă întâlnită cu ChIP-loop este formarea de bucle non-native care se formează în timpul concentrării ADN-ului înainte de a avea loc ligarea. O modalitate simplă de a evita acest lucru este de a alege un protocol care realizează precipitarea după etapa de ligare (Simons et al., 2007).
• Validate ChIP-loop interactions. O altă provocare în ChIP-loop poate fi cuantificarea precisă a produselor de ligare. Tehnologiile 3C, în special ChIP-loop, captează adesea interacțiuni aleatorii. Pentru a combate acest lucru, luați în considerare efectuarea unui experiment ChIP în paralel și utilizarea acestuia pentru a valida interacțiunile ChIP-loop. Dacă o interacțiune ADN-proteină-ADN identificată prin ChIP-loop este într-adevăr reală, atunci ambele interacțiuni ADN-proteină ar trebui să apară, de asemenea, în datele ChIP (Simons et al., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifică produsele de ligaturare din întregul genom și evaluează frecvențele acestora prin secvențiere de mare capacitate. Hi-C este o alegere excelentă atunci când este necesară o acoperire largă a întregului genom, iar rezoluția nu reprezintă o mare preocupare, cartografiind, de exemplu, modificările structurii cromozomiale la nivelul întregului genom în celulele tumorale (Lieberman-Aiden et al., 2009).

Hi-C sfaturi utile:

• Optimizați amplificarea bibliotecii. Amplificarea bibliotecii Hi-C trebuie să genereze suficient produs pentru analiză, evitând în același timp artefactele PCR. Pentru a face acest lucru, numărul de cicluri PCR trebuie optimizat (în intervalul de 9-15 cicluri). Dacă nu se poate obține suficient produs (50 ng de ADN), ar trebui să se grupeze mai multe reacții PCR în loc să se mărească numărul de cicluri, cinci reacții sunt de obicei suficiente (Belton et al., 2012).
• Echilibrați lungimile de citire. Ca în cazul oricărui experiment de secvențiere, citirile de înaltă calitate sunt primordiale. Lungimea de citire trebuie să fie optimă pentru a echilibra nevoia de citiri lungi pentru a cartografia interacțiunile, dar nu prea lungi pentru a trece prin joncțiunea de ligare în fragmentul partener. Prin urmare, citirile de 50 bp sunt optime în majoritatea cazurilor (Belton et al., 2012).
• Alegeți o dimensiune adecvată a bin-ului. Acest lucru este esențial pentru analiza datelor. Dimensiunea bin ar trebui să fie invers proporțională cu numărul de interacțiuni preconizate într-o regiune. Folosiți bins mai mici pentru interacțiunile intra-cromosomale mai frecvente și bins mai mari pentru interacțiunile inter-cromosomale mai puțin frecvente (Belton et al., 2012).

Capture-C

Capture-C utilizează o combinație de 3C și tehnologia de captare a oligonucleotidelor (OCT), împreună cu secvențierea de mare capacitate pentru a studia sute de loci deodată. Capture-C este ideal atunci când sunt necesare atât rezoluția înaltă, cât și scara genomică. De exemplu, analizarea efectului funcțional al fiecărui SNP asociat bolii din genom asupra structurii locale a cromatinei (Hughes et al., 2014).

Capture-C sfaturi utile:

• Alegeți cu atenție pozițiile sondei. Cel mai bine este să poziționați sondele în apropierea situsurilor enzimelor de restricție, chiar suprapunându-le atunci când este posibil (Hughes et al., 2014).
• Păstrați bibliotecile complexe. Menținerea complexității bibliotecilor este prioritatea principală. O bibliotecă complexă înseamnă mai multe interacțiuni de înaltă calitate în rezultat. Din acest motiv, trebuie evitat orice lucru care ar putea reduce complexitatea bibliotecii, cum ar fi o captură de biotină Hi-C (Hughes et al., 2014).
• Fiți atenți la interacțiunile false în regiunile duplicate. Procesul de cartografiere poate stimula interacțiuni puternice între aceste regiuni (cum ar fi pseudogene) care sunt de fapt artefacte (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y și Dekker J (2012). Hi-C: o tehnică cuprinzătoare pentru a capta conformația genomurilor. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M și Kleckner N (2002). Captarea conformației cromozomilor. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). The three ‘C’ s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J și Dekker J (2007). Cartografierea rețelelor de interacțiuni fizice între elementele genomice utilizând tehnologia 5C. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y și Dekker J (2007). Tehnologia de capturare a conformației cromozomului prin copiere de carbon. Curr Protoc Mol Biol, Capitolul 21, Unitatea 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF și Kohwi-Shigematsu T (2005). Pierderea buclelor de cromatină silențioasă și afectarea amprentării DLX5 în sindromul Rett. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). Un interacționom de cromatină umană legată de receptorul de estrogen-alfa. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Cartografierea cuprinzătoare a interacțiunilor cu rază lungă de acțiune dezvăluie principiile de pliere a genomului uman. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (august 2014). Interviu prin e-mail.

Hughes JR, et al. (2014). Analiza a sute de peisaje cis-regulatoare la rezoluție înaltă într-un singur experiment de mare randament. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J și de Laat W (2007). O evaluare a metodelor bazate pe 3C pentru a capta interacțiunile ADN. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E și de Laat W (2012). Tehnologia 4C: protocoale și analiza datelor. Methods Enzymol, 513, 89-112

.