Regulação da Síntese do Colesterol

00:00:08.12 Meu nome é Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03 e sou do Departamento de Genética Molecular
00:00:12.01No Centro Médico da Universidade do Texas Southwestern em Dallas, Texas.
00:00:15.17 Nesta apresentação,
00:00:17.19 Estarei falando sobre o regulamento de feedback do HMG CoA reductase,
00:00:20.27 que é a enzima limitadora de taxa na síntese do colesterol,
00:00:25.06 Então, este slide mostra a estrutura do colesterol
00:00:27.06 e algumas das características desta importante molécula.
00:00:31.01Colesterol é um esterol,
00:00:33.10 que se distingue por esta estrutura de quatro anéis,
00:00:36.00 Esta estrutura de quatro anéis confere rigidez a esta molécula,
00:00:39.02 que a torna um componente ideal das membranas celulares.
00:00:43.18Agora, porque o colesterol tem um grande número
00:00:46.07 de ligações carbono-carbono e carbono-hidrogênio,
00:00:49.Esta molécula é virtualmente insolúvel na água,
00:00:52.07 Por este motivo,
00:00:54.13 as células devem ser capazes de manter o colesterol numa faixa estreita,
00:00:58.03such que colesterol suficiente é produzido para as necessidades celulares da molécula,
00:01:02.13mas evita a superacumulação tóxica do colesterol,
00:01:06.16A superacumulação do colesterol pode ser tóxica a nível celular.
00:01:12.11Agora, este slide mostra algumas das funções essenciais do colesterol.
00:01:15.10O colesterol é absolutamente necessário para a vida.
00:01:17.26Como mencionei anteriormente,
00:01:19.27 um dos papéis mais reconhecidos para o colesterol
00:01:22.26 é seu papel nas membranas celulares,
00:01:25.08 onde mantém a fluidez ótima da membrana.
00:01:29.00Agora, o colesterol acaba sendo um importante precursor
00:01:32.01 para moléculas muito importantes como os hormônios esteróides,
00:01:34.25 que ajudam a distinguir entre meninas e meninos;
00:01:38.19 ácidos mordidos, que ajudam na digestão e nutrição, solubilizando gorduras dietéticas e vitaminas lipossolúveis;
00:01:47.10 e finalmente, o colesterol é abundante no cérebro,
00:01:50.18onde é encontrado em bainhas de mielina que envolvem axônios
00:01:53.17 e ajuda na sinapse… transmissões sinápticas.
00:01:58.18Agora, células em nossos corpos — células de mamíferos —
00:02:02.01 adquirem colesterol através de duas fontes.
00:02:04.21Uma das fontes é ilustrada neste slide,
00:02:07.06 e é através da síntese do colesterol
00:02:09.19do precursor acetil CoA.
00:02:13.00Agora, a conversão de acetil CoA para colesterol
00:02:15.21ocorre através da ação de mais de 20 enzimas.
00:02:20.22Agora, como você pode imaginar,
00:02:22.21a síntese do colesterol envolve a produção de vários intermediários,
00:02:26.16 e estes intermediários propriamente ditos,
00:02:29.14 também podem ser convertidos em produtos finais muito importantes,
00:02:33.11 Por exemplo, este composto, farnesil pirofosfato,
00:02:36.29 é um precursor para um composto importante chamado dolichol,
00:02:40.25 que está envolvido na glicosilação ligada ao N.
00:02:43.26 É também um precursor para heme e ubiquinonas,
00:02:46.10 que estão envolvidos na respiração celular;
00:02:49.26vitamina K, que está envolvida na coagulação do sangue;
00:02:53.12 e finalmente, este farnesil pirofosfato e geranil pirofosfato
00:02:58.06 que estão ligados a muitas proteínas de sinalização,
00:03:01.16 pequenas proteínas GTP,
00:03:03.22 direcionando-as para membranas,
00:03:06.12 e esta modificação é absolutamente necessária para a função celular normal,
00:03:13.04Agora, esta lâmina mostra que a síntese do colesterol
00:03:16.02 ocorre em vários tecidos em diferentes taxas.
00:03:19.29Agora, o fígado e as glândulas supra-renais
00:03:23.14sintetizam o maior colesterol do nosso corpo.
00:03:25.10E devo salientar que isto foi realmente feito em ratos,
00:03:28.06mas efeitos semelhantes são vistos em humanos
00:03:31.07 e outros primatas.
00:03:33.19O fígado… o fígado sintetiza grandes quantidades de colesterol
00:03:36.24 para produção principalmente de lipoproteínas
00:03:39.14 e também para síntese de ácido biliar.
00:03:42.10As glândulas supra-renais produzem colesterol
00:03:45.28primarily for steroid hormone synthesis,
00:03:48.13whereas the gut synthesizes cholesterol to…
00:03:51.27for cell division.
00:03:54.12A large number of cells in the gut are sloughed off every day
00:03:57.12 e deve ser substituído por novas células,
00:03:59.27 o que requer uma quantidade marcada de síntese de colesterol.
00:04:03.28I deve também apontar que o intestino é também uma fonte de produção de lipoproteínas.
00:04:09.21 Então, agora a segunda fonte de colesterol
00:04:12.12 é de fato das lipoproteínas
00:04:15.16 que são produzidas pelo fígado e pelo intestino.
00:04:18.06 Então, mostrado aqui é um modelo da lipoproteína de baixa densidade.
00:04:23.02 Este é o maior portador de colesterol no plasma humano.
00:04:28.02 Então, a lipoproteína de baixa densidade, ou LDL,
00:04:31.14consiste em um núcleo composto de colesterol livre.
00:04:36.19 Assim, o colesterol hidrofóbico forma o núcleo da partícula LDL.
00:04:41.19Agora, esse colesterol hidrofóbico
00:04:44.01 está rodeado por uma casca composta de um fosfolípido
00:04:47.02 com várias quantidades de colesterol esterificado
00:04:51.13– este é o colesterol ao qual um ácido gordo foi anexado —
00:04:55.14 que está intercalado na casca do fosfolípido.
00:04:59.03 Agora, toda esta partícula LDL
00:05:02.18 está rodeada por uma proteína chamada apolipoproteína B.
00:05:08.02 Então, esta lâmina realmente retrata
00:05:10.17como as células adquirem colesterol destas duas fontes:
00:05:13.13 Síntese endógena e do LDL.
00:05:18.19 Então, os receptores LDL
00:05:21.09– eles estão na superfície das células —
00:05:23.20bind para LDL interagindo com esta partícula apolipoproteína B
00:05:29.12 que envolve a casca da lipoproteína.
00:05:32.25Após a partícula LDL liga-se ao receptor LDL,
00:05:35.35.27 todo o complexo é internalizado em pits revestidos,
00:05:40.06 E estes pits revestidos são então direcionados para lisossomos,
00:05:43.07 onde a partícula LDL é degradada e o colesterol
00:05:47.15– colesterol livre —
00:05:49.25 é agora liberado e fornecido à célula para vários usos.
00:05:54.18 Então, novamente, estas duas fontes de colesterol celular
00:05:58.03– seja do receptor… Endocitose mediada pelo receptor LDL,
00:06:03.07 ou através da síntese endógena —
00:06:06.02 podem ser usadas intercambiavelmente.
00:06:09.01 Assim, por exemplo, se o LDL se torna limitador,
00:06:12.00 a célula muda para a síntese endógena para suas fontes de colesterol.
00:06:18.02 E se a síntese endógena for bloqueada,
00:06:20.05 então as células podem agora usar LDL exógeno
00:06:23.01 para sua fonte de colesterol,
00:06:27.00 Então, nós falamos sobre a função essencial do colesterol.
00:06:30.10 É importante nas membranas celulares.
00:06:32.11 É um precursor importante dos hormônios esteróides
00:06:34.28 e dos ácidos biliares.
00:06:36.16 No entanto, há um lado mau do colesterol,
00:06:38.13 e isso está ilustrado neste slide.
00:06:41.00Durante alguns anos, níveis elevados de colesterol LDL no sangue
00:06:46.14 estão associados a um risco de doença coronária
00:06:49.19 e ataques cardíacos.
00:06:51.16 Assim, mostrado aqui você pode ver que
00:06:54.27 o nível de colesterol no sangue
00:06:57.26literalmente correlaciona com o risco de doença coronária.
00:07:01.09 E isto porque o colesterol elevado
00:07:04.21 pode realmente se depositar nas artérias que levam à… ao coração.
00:07:08.12E com o tempo, este depósito
00:07:11.15resulta numa doença chamada aterosclerose,
00:07:13.09Na qual este depósito de colesterol
00:07:15.04 pode levar à produção de placas
00:07:17.12 que, em última análise, pode bloquear o fluxo de sangue para o coração,
00:07:19.18 criando um ataque cardíaco.
00:07:23.06 Agora, um dos medicamentos mais prescritos
00:07:28.16 para baixar o colesterol LDL
00:07:31.11 é um grupo de medicamentos chamado estatinas.
00:07:33.03Mostrada aqui é a típica estrutura central das estatinas
00:07:37.26 e algumas das várias formas de estatinas
00:07:41.29 que têm sido utilizadas na clínica.
00:07:44.22 Ao longo dos anos, as estatinas
00:07:47.12 têm se tornado uma das mais… os medicamentos mais vendidos…
00:07:49.10 medicamentos nos Estados Unidos
00:07:51.20 devido à sua capacidade de baixar o colesterol LDL sanguíneo.
00:07:57.19 Então, mostrado nesta experiência é um resumo de pelo menos quatro estudos
00:08:02.23 que revelam que as estatinas realmente reduzem o colesterol LDL
00:08:06.06 e que a redução leva a uma incidência reduzida
00:08:10.04 de doença coronária.
00:08:12.11 Assim, mostrados aqui nos círculos fechados são os ensaios clínicos
00:08:15.11Em que pacientes foram tratados com estatina, mostrados nos… mostrados nos círculos fechados,
00:08:20.22 ou um placebo.
00:08:22.11 E em cada um desses estudos, o tratamento com estatina levou a
00:08:25.17a queda nos níveis de colesterol LDL,
00:08:28.06 e essa queda nos níveis de colesterol LDL
00:08:31.19 levou a uma redução nos eventos coronários, ou seja, ataques cardíacos.
00:08:35.13 Então, a questão se torna, você sabe, como funcionam as estatinas?
00:08:38.21 E o que fazem as estatinas?
00:08:40.28 Então, primeiro respondemos, o que fazem as estatinas?
00:08:43.16 Assim, as estatinas inibem a enzima HMG CoA reductase.
00:08:47.05HMG CoA reductase catalisa
00:08:50.20 o passo limitador de taxa na síntese do colesterol.
00:08:53.28 É na verdade a quarta etapa na síntese do colesterol.
00:08:58.06 Assim, as estatinas inibem competitivamente a HMG CoA redutase
00:09:01.20 ao imitar o produto da reação redutase,
00:09:05.13mevalonate.
00:09:07.20Então, esta inibição competitiva da redutase
00:09:10.19 subentende a capacidade das estatinas de diminuir a regulação
00:09:14.18LDL do colesterol no sangue,
00:09:18.07Então, como funcionam as estatinas,
00:09:20.17Então, novamente, pela inibição competitiva da HMG CoA redutase,
00:09:24.01Isso leva a uma queda nas quantidades de mevalonate
00:09:27.09 e, claro, uma queda no colesterol.
00:09:30.18 Essa diminuição do colesterol leva a um aumento
00:09:33.12 na transcrição do gene
00:09:36.06 codificando o receptor LDL.
00:09:37.25 E como resultado, o número de receptores LDL na superfície…
00:09:41.14especialmente das células hepáticas,
00:09:43.15e este aumento nos receptores LDL leva
00:09:48.01 a um aumento ou aumento da captação de sangue LDL.
00:09:52.25 E essa redução no LDL sanguíneo
00:09:55.26 é responsável pela diminuição da doença coronária
00:09:58.20 em pacientes tratados com estatina.
00:10:02.12 No entanto, os efeitos clínicos das estatinas
00:10:05.26 são na verdade embotados por
00:10:09.06 o aumento compensatório em HMG CoA reductase
00:10:11.10at acompanha a terapia com estatinas.
00:10:13.19 E isso é ilustrado neste slide.
00:10:15.13 Este é um immunoblot da proteína HMG CoA reductase
00:10:19.03 nos fígados de ratos que foram alimentados com estatina,
00:10:22.17 ou mesmo em células cultivadas
00:10:25.00 que foram tratados com estatinas in vitro.
00:10:26.24 E como você pode ver,
00:10:28.20 o tratamento com estatina causa um acúmulo marcado
00:10:31.09de HMG CoA reductase.
00:10:33.10 E esta acumulação, como mencionei anteriormente,
00:10:35.24blunta os efeitos clínicos das estatinas.
00:10:38.12 Então, a nossa próxima pergunta é, porque é que as estatinas causam
00:10:41.27HMG CoA reductase a acumular-se a um nível tão elevado?
00:10:44.14 O que eu deveria apontar foi estimado em
00:10:47.02 pelo menos 200 vezes.
00:10:49.29 Então, normalmente HMG CoA reductase
00:10:51.25 está sujeito a uma enorme quantidade de regulação de feedback.
00:10:55.02 E esta regulação de feedback é mediada em parte
00:10:57.29 por esteróis.
00:11:00.02Agora, o tratamento com estatinas, como mencionei anteriormente,
00:11:02.05 bloqueia a actividade da HMG CoA redutase,
00:11:04.12 e impede a síntese destas moléculas de esterol.
00:11:07.29 E claro, que a prevenção da síntese do esterol
00:11:10.26 é responsável pela upregulação dos receptores LDL
00:11:14.17 e posterior redução do colesterol LDL.
00:11:18.09No entanto, porque as estatinas
00:11:21.03 bloqueiam a síntese de esteróis,
00:11:22.18 perturbam a regulação de feedback da redutase.
00:11:25.14E como resultado, três eventos ocorrem.
00:11:27.28Primeiro, por causa dessa redução no colesterol
00:11:31.09 e outros produtos da via sintética do colesterol,
00:11:35.08 há uma transcrição melhorada do gene da redutase,
00:11:39.07 há uma tradução melhorada
00:11:41.28 do mRNA redutase,
00:11:43.17e depois finalmente há um aumento da estabilidade
00:11:45.24 da proteína redutase.
00:11:47.13Estes três eventos são responsáveis
00:11:49.19 por aquele aumento marcado da proteína redutase
00:11:52.03I mostrou no slide anterior.
00:11:55.18 Assim, ao longo dos anos,
00:11:57.06 o meu laboratório tem estado interessado em tentar compreender
00:11:59.27 os mecanismos moleculares que estão na base
00:12:02.22 este aumento da estabilidade da proteína,
00:12:04.09 e que será o assunto do restante desta apresentação,
00:12:09.16 Assim, este slide ilustra que os esteróis
00:12:13.08 na realidade aceleram a degradação
00:12:15.26 da HMG CoA reductase,
00:12:17.14 Assim, nesta experiência,
00:12:19.11 utilizamos a análise clássica pulse-chase
00:12:20.29 para monitorar a estabilidade da redutase nas células
00:12:23.16 que foram tratadas na ausência ou presença de esteróis,
00:12:26.00 Então, o que fazemos aqui é tipicamente rotular as células com radioatividade,
00:12:29.27 um pequeno subconjunto de moléculas de HMG CoA redutase.
00:12:33.25 Depois tiramos essa radioatividade,
00:12:35.25 e depois seguimos o pres…
00:12:37.25 a estabilidade da proteína redutase
00:12:39.26 na ausência ou presença de esteróis.
00:12:44.10 E como você pode ver aqui,
00:12:46.08 quando as células são perseguidas em mídia
00:12:49.07 que não contém radioatividade,
00:12:51.01 na ausência de esteróis
00:12:52.28 a redutase é razoavelmente estável com o tempo.
00:12:55.16 No entanto, como você pode ver,
00:12:57.21 a adição de esteróis no meio de perseguição
00:12:59.26causa os níveis de redutase para diminuir acentuadamente.
00:13:02.20Again, isto é indicativo da degradação acelerada por esterol
00:13:06.04 do HMG CoA redutase.
00:13:09.16Agora, para compreender os mecanismos moleculares
00:13:11.22Para esta degradação induzida pelo esterol da redutase,
00:13:14.15 temos que entender a estrutura da proteína CoA redutase do HMG.
00:13:18.05E a estrutura de domínio da redutase
00:13:20.14 está realmente ilustrado neste slide.
00:13:22.18 Então, HMG CoA reductase
00:13:24.16 consiste em dois domínios distintos.
00:13:26.28 Tem um domínio N-terminal
00:13:29.06 que ancora a proteína nas membranas do retículo endoplasmático,
00:13:32.14 ou o ER.
00:13:35.00Agora, este domínio N-terminal,
00:13:36.29 ao qual nos referimos como domínio de membrana,
00:13:39.04 contém oito regiões de membranas.
00:13:42.05 E é seguido pelo segundo domínio de HMG CoA reductase,
00:13:45.07 que chamamos de domínio catalítico.
00:13:47.24 Então, o domínio catalítico se projeta no citosol das células
00:13:51.24 e contém toda a atividade enzimática do HMG CoA redutase,
00:13:56.03 Na verdade, uma versão truncada da redutase
00:13:59.29 que contém apenas o domínio catalítico
00:14:02.13 pode resgatar completamente a síntese do mevalonato
00:14:06.28 em células sem HMG CoA reductase.
00:14:10.13 Então, o domínio catalítico é necessário e suficiente
00:14:13.01 para a síntese do mevalonato.
00:14:15.29O que então levanta a questão,
00:14:17.28Por que esta membrana proteica está ligada?
00:14:19.26 E acontece que a redutase
00:14:22.02 é na verdade uma proteína ligada à membrana tão atrás quanto na levedura.
00:14:25.18 Então, a função do domínio da membrana da redutase
00:14:28.26 foi ilustrada nesta experiência inicial
00:14:31.27 que comparou a estabilidade do domínio catalítico
00:14:35.08–que, lembre-se, contém toda a atividade enzimática —
00:14:37.26 à enzima de comprimento total.
00:14:40.20 E novamente, uma análise simples de pulsação-causa
00:14:42.21 foi usada para monitorar a estabilidade dessas duas proteínas.
00:14:47.13Como você pode ver no painel à esquerda,
00:14:49.03 o domínio catalítico truncado produz
00:14:53.14a proteína muito estável que… importante,
00:14:57.08 sua degradação não é influenciada por esteróis.
00:14:59.20 Em contraste, a proteína de comprimento total — que, novamente, contém o domínio da membrana —
00:15:03.07 é menos estável, mesmo na ausência de esteróis.
00:15:06.13 E você pode ver que os esteróis aceleram acentuadamente
00:15:09.25 a degradação do HMG CoA reductase,
00:15:12.09 o que indica que o domínio da membrana…
00:15:15.15.12 a função do domínio da membrana
00:15:17.25 é para esta degradação acelerada ou induzida por esterol.
00:15:22.08 Então, o que os estudos anteriores indicaram
00:15:25.12 é que o domínio da membrana da redutase
00:15:28.03 é necessário e suficiente para a degradação acelerada por esterol,
00:15:30.25 e sugeriram que o domínio da membrana,
00:15:33.16 seja direta ou indiretamente,
00:15:35.16 pode detectar níveis intracelulares de esteróis.
00:15:38.00 E a detecção resulta em, talvez,
00:15:41.02a mudança conformacional no domínio da membrana redutase
00:15:43.29 que faz com que a proteína seja suscetível à degradação rápida.
00:15:48.14 E claro, porque as estatinas bloqueiam a síntese de colesterol,
00:15:52.01 as estatinas bloqueiam isso
00:15:54.22 o que chamamos degradação associada a ER — ou ERAD —
00:15:57.08 da HMG CoA redutase.
00:16:02.23Então, um avanço fundamental em nosso entendimento
00:16:04.23 do ERAD de HMG CoA reductase
00:16:06.15com a descoberta de um par de proteínas
00:16:08.28– Proteínas da membrana ER —
00:16:10.23called Insig-1 e Insig-2.
00:16:14.15 Estas proteínas Insig, para os propósitos desta palestra,
00:16:16.27 são muito redundantes.
00:16:18.14Eles desempenham papéis redundantes na degradação, ou ERAD,
00:16:22.06 de HMG CoA reductase.
00:16:24.00 Eles são idênticos… eles são cerca de 85% idênticos,
00:16:26.23 e são proteínas altamente hidrofóbicas.
00:16:29.24Agora, o papel dos Insigs no ERAD do HMG CoA reductase
00:16:34.28 foi ilustrado pela primeira vez nesta experiência.
00:16:37.19 Então, aqui novamente usamos a análise de pulsações
00:16:40.15 para medir a degradação acelerada por esterol
00:16:43.29 da redutase em células
00:16:47.02 que foram transfectadas com moléculas de controle,
00:16:51.06 chamadas siRNAs,
00:16:53.05 ou células que foram transfectadas com siRNAs
00:16:55.26 que levariam ao derrubamento da expressão
00:16:58.13 tanto do Insig-1 como do Insig-2.
00:17:02.07 E como você pode ver no painel à esquerda,
00:17:04.13 nas células transfectadas com o siRNAs de controle,
00:17:08.04steróis aceleram marcadamente a degradação
00:17:12.07 da HMG CoA redutase.
00:17:14.13 Então, círculos abertos são experimentos conduzidos na ausência,
00:17:17.09 e os círculos fechados são experimentos conduzidos
00:17:20.15 na presença de esteróis,
00:17:22.12 E o que você pode facilmente ver é que o derrubamento do Insig-1 e Insig-2
00:17:26.23 abole completamente a degradação acelerada pelo esterol,
00:17:30.02 indicando que estas proteínas
00:17:32.28 desempenha um papel fundamental no processo,
00:17:35.27 Então, nossa próxima pergunta é,
00:17:38.02 qual é o mecanismo
00:17:39.26 pelo qual os Insigs aceleram o ERAD do HMG CoA reductase?
00:17:47.09 Então, esta experiência…
00:17:48.21 esta lâmina mostra que os inibidores do proteasoma, o proteasoma 26S,
00:17:53.21 bloqueiam a degradação induzida pelo esterol do HMG CoA redutase.
00:17:57.15 Então, como você pode ver nesta experiência…
00:18:00.18 nas duas primeiras pistas, os esteróis causaram a degradação da redutase,
00:18:04.17 e esta degradação é completamente bloqueada
00:18:06.19 quando estas células são tratadas com o inibidor do proteasoma,
00:18:12.03 Então, com… isto permite-nos criar outro modelo
00:18:15.27no qual, novamente, o domínio da membrana da redutase
00:18:18.25- directa ou indirectamente
00:18:21.22-níveis sensoriais de esteróis intracelulares,
00:18:24.15º faz com que a redutase se ligue ao Insigs,
00:18:28.12 e que a ligação do Insig leva a reações que causam a redutase
00:18:32.06 a serem agora degradadas pelo proteasoma 26S.
00:18:37.22Agora, sabe-se que a maioria dos substratos dos proteasomas
00:18:41.00 exigem sua ubiquitinação prévia.
00:18:44.05 A ubiquitinação é um processo pelo qual
00:18:46.23 a pequena ubiquitina proteica torna-se covalentemente ligada
00:18:50.16 a moléculas de substrato.
00:18:52.08 E uma vez que uma cadeia de ubiquitinas
00:18:54.16 esteja ligada a substratos,
00:18:56.08it torna-se reconhecido pelos proteasomas para degradação,
00:19:00.25Agora, isto é chamado de polibiquitinação,
00:19:02.25 e polibiquitinação de proteínas
00:19:05.14 exige a ação de pelo menos três tipos diferentes de enzimas.
00:19:07.29Isso é ilustrado neste slide,
00:19:11.09 No primeiro passo,
00:19:13.15 aubiquitina torna-se ativada
00:19:15.20de uma forma dependente de ATP por uma enzima chamada E1,
00:19:19.11 ou proteína ativadora da ubiquitina.
00:19:22.15No próximo passo, a ubiquitina é transferida de E1 para…
00:19.27.13 para outra enzima chamada E2, ou enzima que conjuga a ubiquitina.
00:19:32.16 Na etapa final, o E2 combina com um E3,
00:19:36.24 ou ligase ubiquitina,
00:19:39.08 que por sua vez está associado ao substrato,
00:19:42.09 mostrado aqui em verde.
00:19:44.11 O que o E3 faz é facilitar a transferência da ubiquitina
00:19:47.27 da enzima de ubiquitina-conjugadora
00:19:50.00 para um resíduo de lisina na proteína do substrato,
00:19:53.08 gerando um substrato ubiquitinado.
00:19:57.28Agora, este processo ocorre muitas vezes,
00:20:00.02 até que uma cadeia ubiquitina seja construída sobre a proteína do substrato.
00:20:06.02 Que agora pode ser reconhecida pelos proteasomas para degradação.
00:20:10.18 Então, considerando que estas proteínas Insig
00:20:12.26 são necessárias para a degradação da redutase,
00:20:15.08 e que a redutase é realmente degradada pelos proteasomas,
00:20:19.02 A próxima pergunta é, a redutase é ubiquitinada?
00:20:23.20 Essa pergunta foi respondida neste experimento
00:20:26.11 mostrado neste slide,
00:20:28.21 Então, o que fizemos neste experimento foi tratar células
00:20.31.15 na ausência e presença de esteróis
00:20:33.20 e o inibidor do proteasoma
00:20:37.05 Após estes tratamentos,
00:20:39.11 nós imunoprecipitamos a reductase
00:20:41.21 e depois sondar esses imunoprecipitados para qualquer uma das redutases totais,
00:20:43.20 mostrado no painel inferior,
00:20:45.18 ou redutase ubíqua,
00:20:49.49.07 Então, como você pode ver na primeira pista,
00:20:51.01 mesmo que a redutase seja puxada para baixo nestas experiências,
00:20:55.11 não vemos nenhuma reatividade com ubiquitinação.
00:20:58.14 Contudo, os esteróis fazem com que a redutase se torne ubiquitinada.
00:21:03.09 E esta ubiquitinação é acentuadamente aumentada
00:21:07.22 se incluirmos também os inibidores do proteasoma.
00:21:09.27 Então, o que isto nos indica é que os esteróis
00:21:12.16indeed fazem com que a redutase se torne ubíqua,
00:21:14.20e esta proteína ubíqua é agora degradada por proteasomas,
00:21:17.18 como indicado pela estabilidade da redutase ubiquitinated
00:21:21.21 por estes inibidores de proteasoma,
00:21:24.27 Nossa próxima pergunta é,
00:21:27.07 são necessários insigs para esta ubiquitinação induzida por esterol da redutase?
00:21:32.16 E novamente, voltamos a siRNAs.
00:21:35.08As células foram transfectadas ou com o siRNA de controle
00:21:38.18ou siRNAs contra Insig-1 e -2.
00:21:41.03 Tratamos então estas células na ausência ou presença de esteróis,
00:21:43.20 e depois sondamos para redutase ubiquitada.
00:21:47.16 E como você pode ver nas duas primeiras pistas,
00:21:49.10 a redutase é bem ubíqua na presença de esteróis,
00:21:52.08 e a derrubada de Insig-1 e Insig-2
00:21:56.02-suprime completamente esta ubiquitinação.
00:22:01.01 Então, isso agora nos permite preencher mais lacunas em nosso modelo
00:22:04.07 para o ERAD mediado por Insig de HMG CoA reductase.
00:22:09.14Acontece que um subconjunto de moléculas de Insig
00:22:12.00 associa-se com um complexo de E3/E2 ubiquitina ligase.
00:22:16.27Aganha, na presença de esteróis,
00:22:20.15o domínio de membrana da redutase,
00:22:23.03sente o esterol,
00:22:24.25e esta detecção faz com que a redutase se ligue ao Insigs,
00:22:27.28e, claro, estes Insigs
00:22:31.13then bridge the reductase to the E3/E2 ubiquitin ligase complex.
00:22:36.26This bridging then result in the ubiquitination of reductase
00:22:40.00at two lysine residues in the membrane domain.
00:22:43.17 E esta ubiquitinação então faz com que a redutase
00:22:46.17 seja removida da membrana ER
00:22:50.09 e subsequentemente degradada por proteasomas,
00:22:52.22 através de um processo que não estamos completamente…
00:22:55.07 através de um processo que não está completamente compreendido.
00:23:00.20 Então, em resumo, eu vos disse hoje
00:23:03.16 que HMG CoA reductase é a enzima limitadora da taxa
00:23:06.07 no caminho sintético do colesterol,
00:23:08.01 e é um alvo destes medicamentos que reduzem o colesterol.
00:23:11.26 A reductase é controlada através de um sistema regulador muito complexo
00:23:15.16feedback
00:23:18.01 que é mediado pelo colesterol e outros tipos de esteróis.
00:23:20.18 E que as estatinas perturbam este sistema regulador de feedback,
00:23:24.03 em parte bloqueando esta ubiquitinação mediada por insigestão
00:23:27.10 e ERAD de HMG CoA reductase.