Propriedades físico-químicas das nanoemulsões à base de lecitina obtidas por emulsificação espontânea ou homogeneização de alta pressão
On Dezembro 22, 2021 by adminARTIGO
Propriedades físico-químicas das nanoemulsões à base de lecitina obtidas por emulsificação espontânea ou homogeneização de alta pressão
Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil
ABSTRACT Nanoemulsões compostas por um núcleo de óleo triglicérido de cadeia média estabilizado por lecitinas de colza ou girassol foram preparadas por emulsificação espontânea e homogeneização a alta pressão. Estas nanoemulsões são comparadas com formulações estabilizadas por lecitina de ovo. As nanoemulsões obtidas por homogeneização a alta pressão apresentam gotas maiores (230 a 440 nm) em comparação com as obtidas por emulsificação espontânea (190 a 310 nm). Os potenciais de zeta das emulsões foram negativos e abaixo de -25 mV. A inversão do potencial zeta ocorreu entre pH 3,0 e 4,0. Os resultados demonstram a viabilidade da preparação de emulsões lipídicas compreendendo lecitinas de colza ou girassol por emulsificação espontânea e homogeneização a alta pressão.
Palavras-chave: nanoemulsão; lecitina; parenteral; homogeneização a alta pressão; emulsificação espontânea.
INTRODUÇÃO
Um regime de nutrição parenteral é basicamente composto por macronutrientes (aminoácidos, carboidratos e lipídios) e micronutrientes (vitaminas, eletrólitos e microelementos), sob prescrição médica, dependendo da condição, idade e peso do paciente.1 Os macronutrientes lipídicos, administrados como emulsões, são doadores de energia, fornecedores de ácidos graxos essenciais e portadores de vitaminas lipossolúveis. Os ácidos graxos contidos nessas formulações têm grande importância metabólica, já que são componentes da membrana celular e desempenham papéis específicos na sinalização e transporte hormonal. Além disso, eles são precursores de prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos e prostaciclinas, que modulam processos inflamatórios, função renal e agregação plaquetária.2 Uma deficiência de ácidos graxos essenciais em bebês prematuros durante o desenvolvimento cerebral resulta em problemas de aprendizagem e comprometimento da função visual, que podem ser irreversíveis, mesmo que uma dieta adequada contendo ácidos graxos seja fornecida mais tarde no desenvolvimento.2
As emulsões lipídicas parentéricas são sistemas heterogêneos, consistindo de uma fase oleosa homogeneamente dispersa em fase aquosa (dispersante), pela presença de um emulsificante. Uma pequena gotícula, geralmente entre 200 e 500 nm, caracteriza as formulações, devido ao risco de embolia devido ao uso de partículas maiores. As emulsões também devem apresentar um pH fisiologicamente compatível (cerca de 7), isotonicidade, baixa viscosidade e alto potencial zeta (em módulo), para evitar a ocorrência de fenômenos de instabilidade.3
Nanoemulsões lipídicas são comumente empregadas em misturas de nutrição parenteral total, conhecidas como sistemas 3 em 1, nas quais todos os macronutrientes e micronutrientes são adicionados a um saco de etilvinylacetate (EVA). Contudo, estas misturas experimentam alguma instabilidade física relacionada com a presença de electrólitos e outros componentes, que podem precipitar ou interagir com as gotículas da emulsão. A precipitação de cálcio e fosfato é amplamente relatada na literatura. Além disso, íons divalentes (como cálcio e magnésio) podem interferir com o potencial zeta da emulsão e induzir agregação/floculação de gotas lipídicas, seguidas de coalescência. Este fenômeno é muito grave, pois qualquer gota acima de 5 µm de diâmetro que entra na corrente sanguínea pode causar uma embolia gordurosa.4,5
As características físicas e conseqüente estabilidade das emulsões lipídicas estão fortemente relacionadas ao seu método de produção e composição.3,6 Os métodos de produção são diversos e podem requerer mais de uma etapa para produzir uma emulsão com tamanho de gota reduzido. Um homogeneizador de alta velocidade (Ultraturrax®) pode primeiro criar uma emulsão grosseira, por exemplo. A redução do tamanho das gotas pode então ser obtida por homogeneização de alta pressão, microfluidização ou ultra-som.7-9 Entre os métodos que não requerem pré-tratamento está a emulsificação espontânea, utilizada principalmente em estudos de formulação e facilmente realizada em escala laboratorial, pois não é necessário o uso de equipamentos sofisticados.10
Tabela 1 mostra a composição das típicas emulsões lipídicas intravenosas disponíveis comercialmente. Além dos componentes descritos, as formulações devem atender aos requisitos para produtos injetáveis.11
A fase oleosa das emulsões parenterais é composta por triglicerídeos de cadeia longa (TCE), que podem ser combinados com triglicerídeos de cadeia média (TMC), como mostra a Tabela 1. Os LCT compreendem uma grande variedade de óleos, tais como girassol, mamona, azeitona, ou, mais comumente, óleo de soja. Todos estes óleos contêm cadeias de ácidos gordos com mais de 12 carbonos. Os MCT são obtidos por esterificação dos ácidos graxos do óleo de coco. Os emulsionantes de escolha para a estabilização da emulsão injetável são as lecitinas, pois são biocompatíveis e biodegradáveis. As lecitinas são misturas naturais de fosfolipídeos polares e neutros, obtidos de fontes animais ou vegetais.12 A composição fosfolipídica das lecitinas de fontes vegetais pode ser variável devido à extração, ao cultivo e a outras condições de processamento.13 Elas contêm principalmente fosfolipídeos anfotéricos, como a fosfatidilcolina e a fosfatidilanolamina, mas também podem estar presentes fosfolipídeos negativos.
As emulsões lipídicas disponíveis comercialmente para nutrição parenteral são mais freqüentemente compostas de lecitina de ovo-yolk ou, raramente, lecitina de soja (Solipid® E&S). Apesar dos inúmeros benefícios da suplementação de gordura, há relatos de efeitos clínicos adversos relacionados à suplementação a longo prazo, devido a limitações metabólicas e reações imunológicas em pacientes críticos.14,15 Reações adversas às emulsões lipídicas parenterais são relatadas como relacionadas à presença de lecitinas de soja e gema de ovo.16-18 As interações medicamentosa-alergia alimentar podem levar a uma gama de respostas adversas, desde a perturbação gastrointestinal à anafilaxia.19
Neste contexto, a busca de matérias-primas alternativas para encontrar substitutos hipoalergênicos que sejam mais seguros para a administração parenteral em pacientes. Este trabalho prioriza a busca de diferentes lecitinas com o objetivo de encontrar novas alternativas para as emulsões lipídicas destinadas à nutrição parenteral, ou mesmo como portadoras de drogas, para oferecer as opções mais seguras aos pacientes (especialmente bebês prematuros) com hipersensibilidade aos emulsificantes à base de ovos ou soja. Procuramos desenvolver nanoemulsões lipídicas parentéricas estabilizadas por lecitinas de colza ou girassol, e comparamos estas com as nanoemulsões de ovo contendo lecitina. Além disso, a preparação por emulsificação espontânea é comparada com a homogeneização de alta pressão, comumente usada para a produção industrial de emulsões lipídicas parentéricas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Químicos e reagentes
MCT, óleo de soja, e gema de ovo (Lipoid E80®), colza (Lipoid R100®) e girassol (Lipoid H100®) foram obtidas de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha), que gentilmente doou as lecitinas de colza e girassol. Glicerol e etanol foram obtidos da Merck (Brasil) e Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), respectivamente. A água ultra pura foi obtida de um aparelho Milli-Q® (Millipore, Billerica, EUA).
Preparação de nanoemulsões
Emulsões lipídicas foram preparadas em triplicata por dois métodos: emulsificação espontânea e homogeneização de alta pressão. As formulações obtidas por emulsificação espontânea foram preparadas de acordo com um procedimento previamente descrito.10,20 Resumidamente, o óleo de soja foi misturado com MCT, lecitina e etanol. O glicerol foi dissolvido em água, na qual a fase etanolica foi lentamente adicionada sob agitação magnética moderada durante 30 min. O solvente foi então removido por destilação sob pressão reduzida em um evaporador rotatório. As formulações obtidas por homogeneização a alta pressão foram preparadas conforme descrito anteriormente.21 Primeiramente, a lecitina foi dispersa em água contendo glicerol e misturada sob agitação magnética a 40 ºC, até a obtenção de uma fase aquosa homogênea. A fase oleosa consistiu de óleo de soja e MCT. As fases óleo e água foram misturadas sob agitação magnética (15 min, à temperatura ambiente) para se obter uma emulsão grosseira. As emulsões grosseiras foram então misturadas a 9500 rpm durante 2 min usando um misturador IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, USA) para formar pré-emulsões brutas, que foram individualmente submetidas à homogeneização de alta pressão (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Canadá) a 750 bar (10 000 psi) durante 10 ciclos para produzir a emulsão final. O valor de pH de todas as formulações foi ajustado para 8,0 com solução 0,01 mol L-1 NaOH. As emulsões foram armazenadas a 4 ºC. As formulações e seus constituintes são apresentados na Tabela 2.
Caracterização físico-química das nanoemulsões Os valores de pH das formulações foram determinados diretamente nas amostras logo após o preparo, utilizando um potenciômetro calibrado (Digimed, São Paulo, Brasil) à temperatura ambiente. O tamanho médio das gotas e o índice de polidispersidade foram medidos por espectroscopia de correlação de fótons (PCS) e o potencial zeta foi determinado por mobilidade eletroforética, usando um Nano Zetasizer Malvern ZS (Malvern Instrument, UK) a 25 ºC. Para essas medidas, as nanoemulsões foram diluídas em solução de NaCl 1 mmol L-1 na faixa de pH de 2,0 a 8,0 unidades. A viscosidade foi avaliada por viscometria capilar a 25 ºC (constante de viscosímetro, k = 0,0212), a 25 ± 0,1 ºC. O tempo foi registrado, em segundos, para que o líquido fluísse da marca superior para a marca inferior em um tubo capilar. Todas as formulações foram analisadas em triplicata.
Análise morfológica
O exame morfológico foi realizado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Uma gota da nanoemulsão foi colocada sobre uma grade de cobre revestida de carbono (200 mesh), corada negativamente com uma solução de 2,0% de acetato de uranila, e deixada secar por 24 horas antes do exame. Um instrumento JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Japão), operando a 80 kV, foi utilizado.
RESULTA E DISCUSSÃO
No presente estudo, desenvolvemos emulsões lipídicas destinadas à nutrição parenteral ou ao transporte de drogas, estabilizadas por duas lecitinas obtidas de fontes vegetais (colza (R) e girassol (S)), como alternativas à lecitina ovo-yolk (E), um estabilizador tradicional para emulsões parenterais. Para comparar as novas formulações com as tradicionais, todos os outros componentes das emulsões foram mantidos em concentrações semelhantes às dos produtos de emulsão lipídica comercial. Este trabalho também compara dois métodos diferentes de produção: emulsificação espontânea e homogeneização de alta pressão.
A composição qualitativa e quantitativa das nanoemulsões, além do tipo de emulsificante e método de emulsificação, pode influenciar diretamente o tamanho das gotas.7,23 Um segundo método foi, portanto, testado para a preparação da nanoemulsão. A homogeneização de alta pressão é comumente utilizada na indústria farmacêutica para a produção de tais formulações, embora em escala industrial. Dentre os vários métodos disponíveis para emulsificação, este método é preferido devido à sua eficiente ruptura de gotas. Este é um método de alta energia, onde a redução de tamanho é obtida forçando uma emulsão grosseira sob alta pressão através de uma válvula homogeneizadora, deformando e reduzindo assim o tamanho das gotas.26 A emulsificação espontânea é um método de baixo custo, fácil e confiável, e é normalmente utilizada em estudos experimentais em vez de um homogeneizador de alta pressão, que é muito mais complexo e caro.
Como demonstrado na Tabela 3, a homogeneização de alta pressão produziu gotas maiores em nanoemulsões compreendendo colza (296 ± 18 nm) ou lecitina de girassol (417 ± 25 nm), em comparação com o método anterior, e em relação às emulsões controle de ovo-lecitina (243 ± 12 nm). Entretanto, deve-se ressaltar que, mesmo que a homogeneização de alta pressão tenha sido menos eficiente na quebra de gotas, ela conferiu maior estabilidade às formulações. Ao contrário das emulsões obtidas por emulsificação espontânea, estas foram visualmente estáveis por pelo menos 30 dias. Estes resultados confirmam a importância do método de preparação para conferir estabilidade à emulsão.
Considerando aplicações intravenosas, a distribuição do tamanho das gotas da emulsão lipídica pode ser ainda mais importante do que o tamanho médio das gotas. Uma pequena população de gotas grandes de óleo pode ser suficiente para causar uma embolia gordurosa em pacientes.4,5 A distribuição do tamanho das gotas das formulações preparadas é apresentada na Figura 1.
Na Figura 1, duas populações são observadas em formulações compostas de lecitina de colza (obtida por emulsificação espontânea, Figura 1C) e lecitina de girassol (obtida por emulsificação espontânea ou por homogeneização de alta pressão, Figuras 1E e 1F). Como resultado, um índice de polidispersidade maior que 0,20 é obtido para estas formulações.
A estabilidade das emulsões pode estar correlacionada com a composição e propriedades de seu filme interfacial (lecitina), já que isto determina o potencial zeta das formulações e a repulsão entre gotículas, que é um dos mecanismos de estabilização da emulsão.27 A lecitina é uma mistura heterogênea de fosfolipídios; sua heterogeneidade é extremamente benéfica devido à fluidez da película interfacial, quando comparada à de um fosfolipídeo puro.28 Os principais fosfolipídeos das misturas de lecitina são a fosfatidilcolina e a fosfatidilanolamina, que são descarregadas a pH fisiológico (7,4). Pequenas quantidades de lipídios ácidos, como fosfatidilinositol, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol, também podem estar presentes. Estes lípidos são ionizados a pH 7,0 e induzem uma carga superficial negativa nas gotas de emulsão, o que contribui para a sua estabilidade. Qualquer substância adicionada que interfira com esta carga é susceptível de alterar a estabilidade do sistema.29 Mesmo que a lecitina de grau parenteral seja altamente purificada, ela ainda contém uma pequena quantidade de outros fosfolípidos, como mostrado na Tabela 4, que descreve a composição das três matérias-primas da lecitina utilizadas neste estudo.
Como demonstrado na Tabela 3, um potencial zeta menor (valor do módulo) é observado para nanoemulsões compostas por lecitina de colza ou girassol e obtidas por emulsificação espontânea. Entretanto, não são observadas diferenças nos potenciais zeta das nanoemulsões produzidas pela homogeneização de alta pressão. Estes resultados indicam que o principal fator que afeta o potencial zeta é o método de preparação. Embora nosso grupo tenha otimizado ambos os métodos, as condições experimentais geralmente devem ser ajustadas, levando em conta a composição das formulações. Parâmetros como o número de ciclos e pressão podem ser modificados para obter as propriedades físico-químicas desejadas das formulações finais.30,31
O potencial zeta das nanoemulsões também depende da ionização do emulsificante. Uma redução na carga resultante (em módulo) de 40 mV para menos de 25 mV pode aumentar as taxas de floculação e coagulação.32 O potencial zeta e o tamanho médio das gotas das nanoemulsões compostas de diferentes lecitinas e produzidas por diferentes métodos de emulsificação foram avaliados na faixa de pH de 2,0 a 8,0. Os resultados são apresentados na Figura 2.
A carga superficial de todas as formulações diminui para zero entre pH 3,0 e 4,0, como observado anteriormente para Intralipid®, uma emulsão de triglicérides estabilizada por lecitina de ovo.25 O potencial Zeta depende do pH, já que H+ é um íon potencial determinante nas superfícies fosfolípidas, com um pH isoelétrico de 3,1,33 Uma redução no pH resulta em um potencial zeta reduzido (menos negativo) e uma taxa mais rápida de floculação.34 O tamanho médio das gotas mostra um pequeno aumento no pH da inversão do potencial zeta. A partir da Figura 3, pode-se concluir que o pH das nanoemulsões deve ser preferencialmente maior que 7,0, uma vez que um platô é atingido nesse valor de pH, onde se observa a repulsão máxima entre as gotas de óleo.
Finalmente, a morfologia das gotas de óleo das nanoemulsões preparadas por homogeneização de alta pressão foi examinada pelo TEM. A figura 3 revela partículas homogêneas e esféricas, mostrando que as gotículas de emulsão têm um tamanho médio de gota na faixa nanométrica. Estes resultados corroboram a análise anterior do tamanho das gotas.
Nanoemulsões são sistemas de baixa viscosidade com comportamento Newtoniano. A avaliação da viscosidade da emulsão é crucial, pois a administração intravenosa de emulsões de alta viscosidade pode ser muito dolorosa para o paciente.23,32 As nanoemulsões compostas de diferentes lecitinas apresentam viscosidades semelhantes. Como esperado, não se observa relação entre o tamanho médio das gotas e a viscosidade das nanoemulsões, já que todas as formulações continham apenas 10% de núcleo de óleo.35 Em contrapartida, algumas diferenças de viscosidade são observadas para formulações obtidas pelos diferentes métodos de preparação: a emulsificação espontânea produziu emulsões ligeiramente mais viscosas.
Vale ressaltar que as composições das nanoemulsões estudadas neste trabalho são baseadas naquelas das nanoemulsões comerciais que utilizam a lecitina de ovo como emulsificante. O uso de um emulsificante diferente pode exigir a otimização de sua concentração e/ou condições de emulsificação. As nanoemulsões comerciais injetáveis compostas de lecitina de soja (Solipid®) requerem 1,5% de concentração do emulsificante, por exemplo. Co-emulsificantes adicionais são às vezes utilizados para estabilizar as emulsões e promover menos polidispersidade e gotas menores. Entretanto, sua aplicação é restrita às emulsões lipídicas como portadoras de drogas, pois pequenas quantidades das formulações são administradas para esse fim: os co-emulsificantes não são freqüentemente utilizados em emulsões para nutrição parenteral, devido aos altos volumes dessas formulações administradas e problemas de segurança, especialmente no caso de bebês prematuros. O oleato de sódio é comumente utilizado em formulações estabilizadoras de emulsões lipídicas injetáveis,36 atuando como surfactante aniônico e agente solubilizante.27
CONCLUSÕES
>767676>Os resultados demonstram a viabilidade do preparo de emulsões lipídicas injetáveis compostas por lecitinas de colza ou girassol por meio de emulsificação espontânea e homogeneização de alta pressão, como alternativas às tradicionais nanoemulsões de ovo-lecitina para pacientes sensíveis a derivados de ovos. Outros estudos devem ser realizados para otimizar as condições de emulsificação para melhorar a estabilidade a longo prazo das formulações.
ACONHECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e à Lipoid GmbH pelos materiais fornecidos.
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Recebido em 03/02/2014; aceito em 17/04/2014; publicado na web em 15/07/2014
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