Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamase CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Clinical Isolates

Background

Drug resistance among some of the Gram-negative bacteria (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii, and Pseudomonas aeruginosa) has emerged and spread worldwide. Entre a família Enterobacterales, Escherichia coli e Klebsiella spp. são organismos frequentemente isolados que possuem notáveis propriedades de resistência às drogas. β-lactams são as drogas comumente prescritas contra essas cepas recalcitrantes, e constituem por si só cerca de dois terços das prescrições clínicas recentes.1 Este grupo contém quatro classes químicas principais: penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e monobactams, nas quais carbapenêmicos são usados como drogas de último recurso na terapia empírica contra cepas patogênicas de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e anaeróbias.2

Resistência a β -lactams é atribuível à produção de β-lactamases, aquelas enzimas hidrolíticas que são capazes de inativar os antibióticos antes que alcancem as proteínas de ligação à penicilina (PBPs) localizadas na membrana citoplasmática.3 As principais famílias de β-lactamase incluem as plasmido-mediadas de espectro estendido β-lactamases (ESBLs), AmpC, cefalosporinases, e carbapenemase. Todas as classes foram detectadas globalmente com poucas delas concentradas em países específicos.1

Os genes que codificam a AmpC β-lactamase espalharam-se extensivamente e são amplamente detectados em plasmídeos bacterianos. A primeira variante da AmpC codificada com plasmídeos foi identificada pela primeira vez em 1989 a partir de Klebsiella pneumoniae isolada na Coreia do Sul. Foi denominada CMY-1 devido ao seu traço fenotípico associado à cefamicinase e era notoriamente resistente à cefoxitina.4,5 Em pouco tempo muitas famílias de variantes AmpC mediadas por plasmídeos foram detectadas, predominantemente a partir dos isolados de K. pneumoniae e E. coli. Bactérias com genótipos AmpC mediados por plasmídeos foram atribuídas com base na homologia em sequência de ácidos nucléicos, formando um maior número de gêneros bacterianos que atuaram como fonte desses plasmídeos e um número de famílias de AmpC.6 Até o momento, foram relatadas globalmente as seguintes famílias de AmpC: duas famílias de CMY β-lactamases (CMY-1 e CMY-2) isoladas de Aeromonas hydrophila e Citrobacter freundii, respectivamente; enzimas do tipo FOX e MOX isoladas de Aeromonas spp.a família ACC derivada de H. alvei; a família LAT de cefalosporinases isoladas de C. freundii; as famílias MIR e ACT originadas de Enterobacter spp.; e a família DHA isolada de Morganella morganii.4,6,7 A maioria dos genes AmpC codificados com plasmídeos são encontrados em isolados de E. coli e K. pneumoniae em infecções nosocomiais, enquanto a resistência entre outras bactérias Gram-negativas como E. cloacae, C. freundii, S. marcescens e M. morganii são conferidas pelas AmpC cromossômicas β-lactamases, aumentando assim a resistência às cefalosporinas de amplo espectro.8 Os organismos que produzem ESBLs frequentemente caracterizados pela co-expressão com AmpC β-lactamases estão representando uma séria ameaça no diagnóstico e tratamento dos patógenos.

Além disso, os genes AmpC β-lactamase, especialmente MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM e ACCM são responsáveis pelo desenvolvimento da resistência de amplo espectro à maioria dos β-lactams (exceto cefepime e carbapenems). Além disso, a aquisição destes genes nas bactérias pode aumentar ainda mais a resistência porque os inibidores das enzimas classe A (incluindo ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam) e p-cloromercuribenzoato não são eficazes contra as AmpC β-lactamases, embora algumas delas possam ser inibidas pelo tazobactam ou sulbactam.6

Embora sejam feitos esforços para conter o crescimento e a propagação de patógenos resistentes a drogas, os estudos sobre AmpC β-lactamases em ambientes com recursos limitados ainda são inadequados. O passo mais importante para lidar com o aumento da resistência antimicrobiana (RAM) é a detecção precisa de cepas patogênicas (e/ou resistentes) em laboratórios de diagnóstico. No entanto, os protocolos laboratoriais para relatórios de rotina não oferecem o resultado preciso no Nepal porque as AmpC β-lactamases são difíceis de identificar apenas por testes fenotípicos e muitas vezes são falsamente detectadas como ESBLs em laboratórios clínicos. As Enterobacterales isoladas que são positivas no teste de triagem do fenótipo ESBL mas negativas no ensaio de confirmação são geralmente consideradas como potenciais produtoras de AmpC β-lactamases conferidas por depressão cromossômica ou transferência de plasmídeos.9

Even os microbiologistas clínicos especialistas falham na identificação da AmpC β-lactamase mediada por plasmídeos, sugerindo assim a necessidade de um método mais preciso e específico para a detecção imediata. No entanto, alguns destes procedimentos são de recursos intensivos, necessitando frequentemente de reagentes que não estão facilmente disponíveis.10 Por estas razões, as AmpC β-lactamases não são detectadas em amostras clínicas. Assim, um protocolo laboratorial mais confiável e válido que consiste na reação em cadeia da polimerase múltipla (PCR) foi concebido para facilitar o diagnóstico de genes AmpC codificados com plasmídeos, responsáveis pela expressão da AmpC β-lactamase em várias infecções clínicas.11

A maioria dos estudos está focada na prevalência de enzimas ESBL em isolados clínicos Gram-negativos no Nepal.12-16 Há um número limitado de estudos sobre enzimas AmpC β-lactamases em bactérias Gram-negativas no Nepal. Um estudo realizado no vale de Kathmandu relatou 27,8% de isolados de Enterobacterales como produtores de AmpC β-lactamases usando o método fenotípico.17 Ao nosso conhecimento, há estudos limitados relacionados à detecção e caracterização de AmpC β-lactamases em bactérias Gram-negativas usando métodos fenotípicos e genotípicos no Nepal. É essencial estabelecer métodos fenotípicos e genotípicos padrão sobre testes de susceptibilidade a antibióticos para rastrear os patógenos resistentes a drogas nos hospitais. Este estudo foi realizado para isolar e identificar os genes AmpC β-lactamases (blaCITM e blaDHAM) em isolados bacterianos Gram-negativos usando tanto o rastreio fenotípico como métodos de confirmação.

Métodos

Desenho do estudo

Este é um estudo de corte transversal com base hospitalar realizado de Junho 2017 a Janeiro 2018 no Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Um total de 1151 amostras clínicas não duplicadas foram coletadas e processadas durante o período do estudo. As amostras incluíram urina (n=412), sangue (n=206), ponta do cateter (n=163), pus (n=132), fezes (n=89), LCR (n=53), esfregaço de ferida (n=58) e esfregaço vaginal (n=38). Os espécimes foram obtidos num recipiente esterilizado, bem marcado e à prova de fugas; e processados o mais rapidamente possível.18 Todos os pacientes visitantes suspeitos de terem infecções bacterianas que deram o seu consentimento para serem envolvidos foram incluídos no estudo. Os participantes do estudo com informação demográfica inadequada foram excluídos.

Cultura de Espécimes e Identificação dos Isolados

Amostras foram coletadas de acordo com diretrizes microbiológicas padrão para a coleta de urina, fezes, pus, sangue, LCR e ponta de cateter. As amostras elegíveis foram ainda inoculadas em ágar sangue (BA) Ágar Chocolate (CA) e ágar MacConkey (MA). Além disso, as amostras de urina foram inoculadas em ágar Cromogénico UTI. Os isolados foram identificados usando parâmetros microbiológicos padrão, como aparência morfológica das colônias, reações de coloração e propriedades bioquímicas.19,20

Teste de Susceptibilidade Antibiótica

Todos os isolados Gram-negativos identificados foram ainda submetidos a teste de susceptibilidade antimicrobiana in-vitro usando o método de difusão do disco de Kirby-Bauer modificado.21 Primeiramente, os inóculos foram feitos transferindo colônias bacterianas do ágar nutriente para a solução salina normal estéril. A turbidez dos inóculos foi estabelecida em equivalência ao padrão 0,5 McFarland, conforme delineado pelas diretrizes do CLSI. A cultura em carpete dos inóculos de teste também foi preparada em ágar de Muller-Hinton (MHA). Antibiotic disks (HiMedia Índia Pvt. Ltd, Bengaluru, Índia) foram utilizados nas seguintes proporções: amoxicilina (10 μg), azitromicina (10 μg), amikacina (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitina (30 μg), ceftazidima (30 μg), ciprofloxacina (5 μg), imipenem (10 μg), piperacillin/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazole (25 μg), e cefepime (30 μg). A placa inoculada foi incubada aerobicamente a 37°C até 18 horas. Após incubação suficiente, as zonas de inibição (ZOI) ao redor dos discos foram medidas e o resultado foi classificado como sensível, intermediário ou resistente.21 Os isolados que apresentavam resistência a três ou mais antibióticos de diferentes classes foram interpretados como multirresistentes.22

Tela para AmpC β-Lactamases

Os isolados foram primeiramente triados para possível produção de AmpC β-lactamases de acordo com as diretrizes do CLSI, 2019.23 Para triagem, ceftazidima ou cefotaxima ou cefoxitina ou ceftriaxona, cada um de 30 µg foi submetido a testes de AST e organismos resistentes a esses antibióticos (mostrando zona de inibição de diâmetro ≤ 18mm) foram triados como potenciais produtores de AmpC e submetidos a outros testes confirmatórios.

Confirmação para AmpC β-Lactamases

Produtores de AmpC β-lactamases positivos foram confirmados pelo teste de disco AmpC e teste de confirmação baseado em inibidores (teste de ácido borônico).

No teste de ácido borônico, a cultura de carpete do organismo teste foi feita em placa de MHA tomando 0,5 soluções de McFarland. Dois discos de cefoxitina (30µg), um dos quais foi adicionado com ácido fenil bórico (400 µg) foram colocados em cultura de carpete em placa de MHA e incubados e os resultados foram interpretados. Se houve um aumento da zona de inibição em ≥5 mm quando o disco antibiótico desejado (ceftazidima ou cefotaxima) foi avaliado em combinação com ácido fenilborónico do que durante o ensaio sem a combinação (apenas disco antibiótico), o isolado foi marcado como tendo teste confirmatório positivo.

No teste de aproximação do disco, os discos foram colocados sobre a cultura de carpete de E. coli ATCC 25922. 30μg o disco de ceftazidima foi colocado no centro da placa seguido por 10μg imipenem, 30μg cefoxitina, e 20/10μg amoxicilina/discos de amoxicilina/clavulanato que foram colocados a uma distância de 20mm do disco de ceftazidima. As colónias do organismo de teste foram adicionadas a um disco e depois a placa foi invertida e incubada durante 24 horas a 37°C aerobiamente. Qualquer indentação ou achatamento do ZOI indicou a produção de AmpC β-lactamase por isolados.20,24

Preservação de AmpC β-Lactamase Positiva Isolados

O método de preparação de caldo de glicerol foi usado para preservação. Os organismos foram preservados em caldo de soja Tryptic Soy Broth (TSB) contendo 40% de glicerol e armazenados a -20ºC.25

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Extratoração de DNA Plasmídeo de Crude

Uma colônia isolada do organismo teste foi inoculada em caldo de Luria Bertani (LB). O inóculo foi incubado aerobicamente usando um agitador de banho-maria a 37°C durante 18-24 horas. Assim, a cultura pura obtida foi submetida ao método da alcalinização para extrair o DNA plasmídeo. O ADN plasmídico extraído foi então suspenso em tampão TE e armazenado a -20ºC até investigação posterior.26

Amplificação dos genes AmpC β-Lactamase (blaCITM e blaDHAM) por PCR

Os genes AmpC β-lactamases (blaCITM e blaDHAM) foram amplificados por PCR usando a preparação do ADN plasmídico como modelo. Os primers utilizados para o gene blaCITM foram CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) e CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) como primer forward e reverse, respectivamente, enquanto que os primers para o gene blaDHAM foi a sequência forward DHAM for (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGGG -3ʹ) e sequência reversa DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 O volume de reacção foi definido como 25µL adicionando 12,5µL de 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), 0,5µL cada um dos primers para a frente e para trás e 4µL de modelo de ADN e ddH2O 7,5µL. A amplificação PCR optimizada de ambos os genes foi de 94ºC durante 3 min para desnaturação inicial; 35 ciclos de desnaturação a 94ºC durante 30 segundos; 25 ciclos de recozimento a 62ºC durante 30 segundos; 35 ciclos de extensão a 72º durante 1 min; e extensão final a 72ºC durante 7 min.11,27

Purificação do ADN

O ADN lasmídeo foi purificado pelo método de precipitação de etanol. Neste método, o pellet de DNA foi lavado com etanol 70% gelado e deixado secar por 10 minutos, o que facilita a evaporação do álcool. O granulado de ADN foi suspenso numa solução tampão contendo Tris, EDTA e RNases para remover as impurezas restantes.

Detecção de Produtos PCR por Electroforese em Gel

Os produtos amplificados foram visualizados usando gel-electroforese em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio 0,1µL. Após a preparação do gel, foi adicionado 2 µL de 100bp de DNA ladder ao primeiro poço como marcador, 2 µL de controlo negativo foi adicionado a outro poço, 2 µL de controlo positivo foi adicionado a outro poço e 2 µL de produtos PCR foram adicionados aos restantes poços. Finalmente, o gel foi visualizado sob trans-iluminador UV.28

Controle de Qualidade

Um procedimento asséptico padrão foi adotado para os procedimentos neste estudo. Todos os lotes dos meios de cultura e reagentes químicos foram processados com técnicas assépticas seguindo as diretrizes do CLSI. Na AST, o controle de qualidade foi mantido utilizando as cepas de controle de E. coli ATCC 25922. Durante a PCR, o controlo de qualidade foi assegurado pelo uso de isolados de Klebsiella contendo ambos os genes em questão, enquanto os controlos em branco ou negativos foram preparados sem a aplicação de ácidos nucleicos. Todos esses controles foram utilizados em cada lote do ensaio PCR.

Análise Estatística

Dados foram inseridos e analisados usando o software SPSS versão 24.0. As associações foram exploradas utilizando testes Qui-quadrado com intervalo de confiança (IC) de 95% entre variáveis demográficas como sexo e idade dos sujeitos.

Resultados

Carácter Demográfico e Clínico dos Pacientes Inscritos

Among 1151 pacientes inscritos, 54,2% (624/1151) eram do sexo masculino e 45,8% (527/1151) do sexo feminino. De 253 crescimento bacteriano, 47,8% (121/253) eram do sexo masculino e 52,2% (132/253) do sexo feminino. Do total (253) de crescimento bacteriano, 26,1% (66/253) eram de amostras de urina, seguidas de pontas de cateter (17,4%;44/253), sangue (16,2%; 41/253), pus (11,9%; 30/253) e esfregaços de feridas (10,7%; 27/253). Na distribuição etária dos pacientes, o maior crescimento de patógenos bacterianos foi encontrado no grupo etário 16-45 anos (39,5%; 100/253) seguido por 46-60 anos (30,1%; 76/253), >60 anos (24,1%; 61/253), e 0-15 anos (6,3%; 16/253), respectivamente (Tabela 1).

Distribuição de Isolados Bacterianos em Espécimes Clínicos

Dentre um total de 1151 amostras clínicas, 22% (253/1151) mostraram crescimento nos meios de cultura. Dos 253 isolados bacterianos, a maioria (89,3%; 226/253) eram bactérias Gram-negativas. Entre o crescimento bacteriano, E. coli (28,5%; 72/253) foi o organismo predominante seguido por Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), bactérias Gram-positivas (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253) e Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figura 1)

Figure 1 Distribuição de gêneros bacterianos em espécimes clínicos positivos em cultura (n=253).

Padrão de Susceptibilidade Antibiótica de Bactérias Gram-Negativas Isoladas

Saída de 226 Gram-negativos isolados bacterianos, 66.8% (151/226) foram encontrados resistentes à cefoxitina, seguidos pela ceftazidima (58,4%; 132/226), ciprofloxacina (53,5%; 121/226), e cefepima (51.8%; 117/226) enquanto os isolados foram mais susceptíveis ao meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%;155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacin (61,1%;138/226), piperacilina/tazobactam (56,6%;128/226) e azitromicina (53.1%; 120/226) (Tabela 2).

Tabela 2 Padrão de Susceptibilidade Antibiótica de Isolados Bacterianos Gram-Negativos (n=226)

Padrão de Resistência a Múltiplos Fármacos (MDR) nos Isolados

De 226 isolados, 46.9% (106/226) dos isolados foram MDR. O maior percentual de MDR foi encontrado entre E. coli (31,1%; 33/106) seguido de P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) e K. oxytoca (4,7%; 5/106) respectivamente (Figura 2). Em espécies individuais, a maior percentagem de resistência multi-droga foi encontrada entre C. freundii (100%; 8/8) seguido de P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) e E. coli (45,8% 33/72), respectivamente (Figura 2).

> Figure 2 Distribuição das bactérias MDR e MDR geral % e MDR dentro de cada espécie.

Detecção AmpC por Diversos Testes

Sai de 226 Gram-negativos isolados, 50% (113/226) mostraram resistência contra a cefoxitina. Os isolados produtores de AmpC β-lactamase foram confirmados por dois testes confirmatórios diferentes, testes de disco e testes de ácido borônico. Dos noventa e um isolados, 91,2% (83/91) apresentaram resultado positivo em ambos os testes e 8,8% (8/91) isolados apresentaram resultado positivo apenas no teste de ácido borônico confirmado por pelo menos um teste e foram considerados como produtores de AmpC β-lactamase.

Prevalência de blaCITM e blaDHAM Genes em AmpC β-Lactamase Producing Gram-Negative Isolates

No ensaio de PCR, 90,1% (82/91) e 87,91% (80/91) dos isolados foram testados positivos para blaCITM e blaDHAM. Respectivamente, os genes amplificados blaCITM e blaDHAM com seus tamanhos amplicon 465bp e 405bp foram detectados (Figuras 3 e 4).

Figure 3 Agarose gel eletroforese (1,5%) usado para separação de produtos PCR. Pista 2, controlo positivo; Pista 3, 5, e 7 são CITM positivo; Pista 4 e 6, CITM negativo; e Pista 8. controlo negativo.

Electroforese em gel de agarose 4 (1,5%) usada para a separação de produtos PCR. Pista 2, controlo positivo; Pista 3, 4, 6 e 7 são Dham positivo; Pista 5, Dham negativo; e Pista 8, controlo negativo.

Distribuição de AmpC β-Lactamase, blaCITM e blaDHAM Genes Among Gram-Negative Isolates and Their Relation to Gender, Age, Clinical Specimens and Clinical Isolates

Out of 91 AmpC producers, 50,6% (46/91) of the isolates were from female and 49,4% (45/91) were from male patients. Da mesma forma, porcentagens iguais (50%; 41/82) dos genes blaCITM foram obtidos de espécimes de ambos os sexos enquanto 51,3% (41/80) e 48,7% (39/80) dos genes blaDHAM foram detectados nos espécimes obtidos de pacientes do sexo masculino e feminino, respectivamente. Não houve associação significativa do sexo do paciente com a produção de enzimas AmpC e genes AmpC (Tabela 3).

Table 3 Distribution of AmpC β-Lactamase, CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Bacterial Isolates and Their Relation to Gender, Age and Clinical Specimens

Highest number of AmpC β-lactamase producers (40.7%; 37/91) e prevalência de isolados produtores de blaCITM (40,2%; 33/82) e blaDHAM (41,2%; 33/80) foram obtidos da faixa etária (46-60) anos seguidos por (16-45) anos (30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) e 31,3%; 25/80) respectivamente. Houve associação significativa entre a produção da enzima AmpC β-lactamase e a faixa etária (p=0,01), enquanto outros fatores, incluindo a aquisição dos genes blaCITM e blaDHAM, não tiveram associação significativa com a idade do paciente (Tabela 3).

Algumas amostras clínicas, o maior número de AmpC β-lactamase-produzindo isolados (20,9%; 19/91) foram detectados a partir de sangue e pontas de cateter, seguidos pela urina (18,7%; 17/91), pus (13,3%; 12/91) e esfregaços de feridas (9,9%; 9/91). Da mesma forma, o maior número de blaCITM e blaDHAM produzindo isolados foi detectado a partir das pontas dos cateteres (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), seguido pelo sangue (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) urina (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) e pus (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), respectivamente. Não houve associação significativa entre amostras clínicas, produção de AmpC β-lactamase, e genes: blaCITM e blaDHAM (Tabela 3).

Distribuição de AmpC β-Lactamases e Aquisição de blaCITM e blaDHAM em várias bactérias Gram-Negativas

A maior prevalência de AmpC β-lactamase foi encontrada em E. coli (28,6%; 26/91), seguida de P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) e K. pneumoniae (10,9%; 10/91). A maior prevalência de blaCITM e blaDHAM foi detectada em E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80) seguido de P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80), A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) e K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80), respectivamente (Tabela 3).

Discussão

A crescente incidência de resistência antimicrobiana permanece como um dos principais problemas de saúde pública em países em desenvolvimento como o Nepal29 o que levou à permanência hospitalar prolongada, aumento dos custos de tratamento, restrição das opções terapêuticas e aumento da morbidade e mortalidade.29,30 A produção de β-lactamases é o principal mecanismo defensivo contra os antibióticos β-lactam. Este estudo foi realizado para explorar a presença de anfetamases (AmpC) da classe C de Amber em organismos Gram-negativos derivados de amostras clínicas obtidas na ANIAS, Kathmandu, Nepal. Este estudo avaliou ainda a prevalência de genes da AmpC β-lactamase (blaCITM e blaDHAM) através do ensaio de PCR. Encontramos alta prevalência dessas enzimas e genes, embora a prevalência de tais enzimas tenha variado de uma região geográfica para outra, dentro e entre os países.

Sair de 1151 amostras clínicas, apenas 253 (21,9%) mostraram crescimento significativo de organismos. Do total (253) de crescimento bacteriano, mais de noventa por cento eram bactérias Gram-negativas, a E. coli foi a mais predominante isolada entre elas. Nossas descobertas são consistentes com estudos anteriores relatados pelo Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 Nova Deli, Índia,36 Al-Najaf City, Iraque,37 Shashemene Referral Hospital, Etiópia,38 e Cidade do México, México.39 Uma taxa ligeiramente maior de infecções bacterianas Gram-negativas foi observada entre pacientes do sexo feminino e pode ser devida a uma maior prevalência de infecções do trato urinário entre as mulheres. Isto é consistente com estudos anteriores do Model Hospital, Kathmandu,17 e Andra-Pradesh, Índia.40 Consistente com este estudo, uma taxa mais alta de infecções por pus em casos pós-operatórios foi relatada em mulheres (63,33%) do que em homens (43,75%) de um estudo realizado no estado de Uttar Pradesh, Índia.41

Neste estudo, os isolados bacterianos Gram-negativos apresentaram maior resistência aos seguintes antibióticos: cefoxitina, ceftazidima, ciprofloxacina e cefepime, seguidos pelo cotrimoxazol, enquanto meropenem, imipenem, piperacilina-tazobactam e azitromicina foram relatados como os antibióticos mais sensíveis. Padrão comparável foi observado em alguns dos achados anteriores do Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoxitina e ceftazidima com baixas taxas de susceptibilidade são os medicamentos de primeira linha que são facilmente hidrolisados pelas enzimas bacterianas e são menos úteis no tratamento das infecções causadas por patógenos Gram-negativos. Similar ao nosso estudo, o imipenem/meropenem foi encontrado como os medicamentos mais sensíveis nos estudos anteriores do Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid Espanha,44 e Wisconsin, EUA.45

Antimicrobial Resistance (AMR) com a crescente propagação da MDR é uma preocupação global, e seus impactos são maiores entre os países de baixa e média renda onde a carga de doenças infecciosas é alta.30 O tratamento de micróbios MDR é caro e difícil e ainda é agravado pela alta prevalência de infecções nosocomiais.46 Neste estudo, quase metade dos isolados de Gram-negativos isolados (46,9%; 106/226) foram encontrados como MDR. Uma maior prevalência de bactérias MDR foi relatada em alguns outros estudos realizados em Kathmandu46-49 e outros distritos do Nepal.15,50,51 A produção de ESBL, metallo β-lactamase (MBL) ou AmpC β-lactamase pode ser a razão por trás da redução da suscetibilidade à nova geração de antibióticos.52 Além disso, a multirresistência a drogas ocorre devido à agregação e expressão de diferentes genes em plasmídeos resistentes (R) ou genes que codificam bombas de efluxo multirresistentes.53 Além disso, os genes responsáveis pela expressão das enzimas da β-lactamase estão constantemente associados aos antibióticos nãoβ-lactam como aminoglicosídeos e fluoroquinolonas.

Neste estudo, a produção de AmpC foi maior entre os pacientes do sexo masculino (41,67%) do que entre os do sexo feminino (38,98%). Os achados deste estudo são consistentes com alguns outros estudos de Kano, Noroeste da Nigéria.54 No entanto, nossos achados diferiram com estudos relatados de Benin, Nigéria.55 A maior prevalência de IU com resistência a múltiplas drogas entre as mulheres foi relatada por muitos estudos, isto pode ser devido à maior prevalência de patógenos produtores de AmpC entre as mulheres, pois elas são mais propensas a IU do que os homens.

O uso de resistência à cefoxitina em laboratórios de diagnóstico serve como um agente/marcador de triagem confiável para detectar a produção de AmpC. Além disso, esse marcador fornece um bom valor preditivo negativo.

Apesar de seu amplo escopo, alguns estudos têm enfatizado o uso da cefoxitina como um mau agente de triagem para a produção de AmpC. Isso pode ser devido à existência de outros mecanismos alternativos além da AmpC (um deles é a mutação do canal de poros) que pode levar a uma interpretação falsa positiva (como a resistência à cefoxitina).52 Nosso estudo revelou que um terço dos isolados de Gram-negativos (>40%) foram responsáveis pela produção de AmpC. Os resultados deste estudo contrastaram com o estudo do Model Hospital, Kathmandu.17 A diferença pode ser devida ao método de detecção fenotípica utilizado neste estudo que utilizou o teste de resistividade da cefoxitina e o método de teste do disco AmpC utilizando cefoxitina (30µg). O teste de confirmação utilizado foi o teste do ácido fenilborónico utilizando cefoxitina 30µg/400g de ácido fenilborónico. Os derivados do ácido borônico foram provados como inibidores reversíveis das enzimas AmpC β-lactamase.56

Neste estudo, a produção de AmpC foi observada em 91 (80,53%) isolados de 113. A taxa de produção de AmpC em nosso estudo é ligeiramente superior a outros estudos relatados do Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 e Índia.59

A fim de compensar as limitações devidas a um dos métodos, a integração de ambas as técnicas no diagnóstico de rotina pode aumentar a sensibilidade e a especificidade dos testes nos cenários clínicos.

Um total de 73 isolados de Gram-negativos mostrou a presença dos genes blaCITM e blaDHAM. Esses achados são consistentes com um estudo anterior relatado por Ilam, Irã.27 No tipo similar de estudo relatado da Índia, mostrou que os genes blaCITM eram mais prevalentes em E. coli.60 Em nosso estudo, a prevalência de genes associados a AmpC (blaCITM e blaDHAM) foi investigada por métodos fenotípicos e genotípicos. Este estudo fornece uma ampla análise das bactérias Gram-negativas associadas à AmpC β- produção de lactamase e seus padrões de suscetibilidade a antibióticos entre os isolados clínicos. Os resultados deste estudo são importantes para informar os padrões de resistência de vários organismos às cefalosporinas. A vigilância da resistência multidroga com β-lactamase incluindo a produção de ESBL, MBL e AmpC é necessária para uma prática clínica de rotina para otimizar o tratamento e prevenir maior resistência entre os antibióticos β-lactamase.13,61,62

Forças e Limitações

Este é o primeiro estudo explorando genes AmpC β-lactamase (blaCITM e blaDHAM) usando testes fenotípicos e moleculares entre pacientes atendidos em um centro de saúde terciário do Nepal. Os resultados deste estudo podem informar a política antimicrobiana para centros de cuidados terciários, incluindo a preparação do tratamento de infecções hospitalares, protocolo de tratamento e procedimento diagnóstico. Há algumas limitações deste estudo que incluem a investigação de AmpC β-lactamases limitadas, curta duração do estudo e ser conduzido em um único centro de cuidados terciários. Futuros estudos podem basear-se nele para conduzir um estudo longitudinal em múltiplos centros de cuidados terciários com exploração de todos os β-lactamases como ESBL, MBL, KPC e os principais genes responsáveis pela resistência. Entretanto, como primeiro estudo de seus tipos triangulando os métodos fenotípicos e moleculares, este estudo será uma referência valiosa para futuros estudos sobre AmpC β-lactamases e prevalência de genes blaCITM e blaDHAM em outros ambientes/hospitais do Nepal.

Conclusão

Nossos achados mostram que a redução da susceptibilidade à cefoxitina em isolados de Gram-negativos está ligada à presença de genes AmpC mediados por plasmídeos. Como não existe um único método definitivo, sugere-se a utilização simultânea de vários métodos de detecção fenotípica para a detecção precisa de bactérias produtoras de AmpC β-lactamase. Neste estudo, a PCR detectou quase 90% dos genes da AmpC β-lactamase (blaCITM e blaDHAM) entre os isolados fenotípicos confirmados. A alta prevalência de genes resistentes e MDR entre os isolados Gram-negativos é um sinal alarmante, exigindo medidas urgentes de intervenção para conter o crescimento e a propagação destes isolados.