Właściwości fizykochemiczne nanoemulsji na bazie lecytyny otrzymanych w wyniku spontanicznej emulgacji lub wysokociśnieniowej homogenizacji

ARTIGO

Właściwości fizykochemiczne nanoemulsji na bazie lecytyny otrzymanych w wyniku spontanicznej emulgacji lub wysokociśnieniowej homogenizacji

Roselena S. Schuh#; Fernanda Bruxel#; Helder F. Teixeira*,#

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 90610-000 Porto Alegre – RS, Brasil

ABSTRACT

Nanoemulsje składające się z średniołańcuchowego trójglicerydowego rdzenia olejowego stabilizowanego lecytyną rzepakową lub słonecznikową przygotowano metodą spontanicznej emulgacji i homogenizacji pod wysokim ciśnieniem. Nanoemulsje te porównano z preparatami stabilizowanymi lecytyną jajeczną. Nanoemulsje otrzymane metodą homogenizacji wysokociśnieniowej charakteryzują się większymi rozmiarami kropel (230 do 440 nm) w porównaniu z tymi otrzymanymi metodą emulgacji spontanicznej (190 do 310 nm). Potencjały zeta emulsji były ujemne i wynosiły poniżej -25 mV. Inwersja potencjałów zeta zachodziła pomiędzy pH 3,0 a 4,0. Uzyskane wyniki wskazują na możliwość przygotowania emulsji lipidowych zawierających lecytyny rzepakowe lub słonecznikowe metodą emulgacji spontanicznej i homogenizacji wysokociśnieniowej.

Słowa kluczowe: nanoemulsja; lecytyna; parenteralna; homogenizacja wysokociśnieniowa; emulgacja spontaniczna.

WPROWADZENIE

Sposób żywienia pozajelitowego składa się zasadniczo z makroskładników odżywczych (aminokwasów, węglowodanów i lipidów) oraz mikroskładników odżywczych (witamin, elektrolitów i mikroelementów), zgodnie z zaleceniami lekarza, w zależności od stanu, wieku i masy ciała pacjenta.1 Makroskładniki lipidowe, podawane w postaci emulsji, są dawcami energii, dostarczycielami niezbędnych kwasów tłuszczowych i nośnikami witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Kwasy tłuszczowe zawarte w tych preparatach mają duże znaczenie metaboliczne, ponieważ są składnikami błon komórkowych i odgrywają specyficzne role w sygnalizacji i transporcie hormonalnym. Ponadto, są prekursorami prostaglandyn, leukotrienów, tromboksanów i prostacyklin, które modulują procesy zapalne, funkcję nerek i agregację płytek krwi.2 Niedobór niezbędnych kwasów tłuszczowych u wcześniaków podczas rozwoju mózgu powoduje problemy w nauce i upośledzenie funkcji wzrokowych, które mogą być nieodwracalne, nawet jeśli odpowiednia dieta zawierająca kwasy tłuszczowe jest dostarczana w późniejszym okresie rozwoju.2

Nanoemulsje lipidowe są powszechnie stosowane w domieszkach do całkowitego żywienia pozajelitowego, znanych jako systemy 3 w 1, w których wszystkie makro- i mikroelementy są dodawane do worka z octanem etylowinylu (EVA). Mieszanki te wykazują jednak pewną niestabilność fizyczną związaną z obecnością elektrolitów i innych składników, które mogą się wytrącać lub wchodzić w interakcje z kroplami emulsji. Wytrącanie się wapnia i fosforanów jest szeroko opisywane w literaturze. Ponadto, jony dwuwartościowe (takie jak wapń i magnez) mogą zakłócać potencjał zeta emulsji i wywoływać agregację/flokulację kropel lipidowych, a następnie koalescencję. Zjawisko to jest bardzo poważne, ponieważ każda kropla o średnicy powyżej 5 µm, która dostanie się do krwiobiegu, może spowodować zator tłuszczowy.4,5

Właściwości fizyczne i wynikająca z nich stabilność emulsji lipidowych są silnie związane z metodą ich wytwarzania i składem.3,6 Metody wytwarzania są zróżnicowane i mogą wymagać więcej niż jednego etapu w celu wytworzenia emulsji o zmniejszonej wielkości kropli. Na przykład, homogenizator o wysokiej prędkości (Ultraturrax®) może najpierw wytworzyć gruboziarnistą emulsję. Zmniejszenie wielkości kropli można następnie uzyskać przez homogenizację wysokociśnieniową, mikrofluidyzację lub ultradźwięki.7-9 Wśród metod, które nie wymagają obróbki wstępnej, jest emulgacja spontaniczna, stosowana głównie w badaniach formulacji i łatwa do przeprowadzenia w skali laboratoryjnej, ponieważ nie jest konieczne użycie skomplikowanego sprzętu.10

W tabeli 1 przedstawiono skład typowych komercyjnie dostępnych dożylnych emulsji lipidowych. Oprócz opisanych składników, preparaty muszą spełniać wymagania stawiane produktom do wstrzykiwań.11

Faza oleista emulsji do podawania pozajelitowego składa się z długołańcuchowych trójglicerydów (LCT), które mogą być połączone ze średniołańcuchowymi trójglicerydami (MCT), jak przedstawiono w tabeli 1. LCT obejmują szeroką gamę olejów, takich jak olej słonecznikowy, rycynowy, oliwkowy lub, bardziej powszechnie, sojowy. Wszystkie te oleje zawierają łańcuchy kwasów tłuszczowych o długości powyżej 12 karbonów. MCT są otrzymywane przez estryfikację kwasów tłuszczowych oleju kokosowego. Emulgatorami z wyboru do stabilizacji emulsji do wstrzykiwań są lecytyny, ponieważ są biokompatybilne i biodegradowalne. Lecytyny są naturalnymi mieszaninami polarnych i neutralnych fosfolipidów, otrzymywanych ze źródeł zwierzęcych lub roślinnych.12 Skład fosfolipidowy lecytyn ze źródeł roślinnych może być zmienny ze względu na ekstrakcję, uprawę i inne warunki przetwarzania.13 Zawierają one głównie fosfolipidy amfoteryczne, takie jak fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, ale mogą być również obecne fosfolipidy ujemne.

Dostępne komercyjnie emulsje lipidowe do żywienia pozajelitowego składają się najczęściej z lecytyny żółtka jaja lub, rzadziej, lecytyny sojowej (Solipid® E&S). Pomimo licznych korzyści płynących z suplementacji tłuszczów, istnieją doniesienia o niekorzystnych efektach klinicznych związanych z długotrwałą suplementacją, wynikających z ograniczeń metabolicznych i reakcji immunologicznych u pacjentów w stanie krytycznym.14,15 Doniesienia o niepożądanych reakcjach na pozajelitowe emulsje lipidowe są związane z obecnością lecytyny sojowej i lecytyny z żółtka jaja.16-18 Interakcje alergii lek-żywność mogą prowadzić do szeregu niepożądanych reakcji, od rozstroju żołądka i jelit do anafilaksji.19

W tym kontekście trwają poszukiwania alternatywnych surowców w celu znalezienia hipoalergicznych substytutów, które są bezpieczniejsze do podawania pozajelitowego u pacjentów. W niniejszej pracy priorytetem jest poszukiwanie różnych lecytyn w celu znalezienia nowych alternatyw dla emulsji lipidowych przeznaczonych do żywienia pozajelitowego, a nawet jako nośniki leków, aby zapewnić najbezpieczniejsze opcje dla pacjentów (zwłaszcza wcześniaków) z nadwrażliwością na emulgatory na bazie jaj lub soi. Staraliśmy się opracować nanoemulsje lipidowe do żywienia pozajelitowego stabilizowane lecytyną rzepakową lub słonecznikową i porównać je z nanoemulsjami zawierającymi lecytynę jajeczną. Ponadto, porównano przygotowanie metodą spontanicznej emulgacji z homogenizacją wysokociśnieniową, powszechnie stosowaną w przemysłowej produkcji pozajelitowych emulsji lipidowych.

MATERIAŁY I METODY

Chemikalia i odczynniki

MKT, olej sojowy i żółtko jaja kurzego (Lipoid E80®), lecytyny rzepakowe (Lipoid R100®) i słonecznikowe (Lipoid H100®) otrzymano z firmy Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Niemcy), która uprzejmie przekazała lecytyny rzepakowe i słonecznikowe. Glicerol i etanol otrzymano odpowiednio z firmy Merck (Brazylia) i Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Wodę ultraczystą uzyskano z aparatu Milli-Q® (Millipore, Billerica, USA).

Przygotowanie nanoemulsji

Emulsje lipidowe przygotowywano w trzech egzemplarzach dwiema metodami: emulgacji spontanicznej i homogenizacji wysokociśnieniowej. Preparaty otrzymane metodą emulgowania spontanicznego przygotowano zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.10,20 W skrócie, olej sojowy mieszano z MCT, lecytyną i etanolem. Glicerol rozpuszczono w wodzie, do której powoli dodawano fazę etanolową pod umiarkowanym mieszaniem magnetycznym przez 30 min. Następnie rozpuszczalnik usuwano przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce rotacyjnej. Preparaty otrzymane w wyniku homogenizacji wysokociśnieniowej przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem.21 Najpierw lecytynę zdyspergowano w wodzie zawierającej glicerol i mieszano pod mieszadłem magnetycznym w temperaturze 40°C, aż do uzyskania jednorodnej fazy wodnej. Faza olejowa składała się z oleju sojowego i MCT. Obie fazy olejową i wodną mieszano mieszadłem magnetycznym (15 min, w temperaturze pokojowej) do uzyskania gruboziarnistej emulsji. Następnie gruboziarniste emulsje mieszano przy 9500 obr/min przez 2 min za pomocą mieszadła IKA® Ultra-Turrax T8 (IKA® Works Inc., NC, USA) w celu utworzenia surowych emulsji wstępnych, które indywidualnie poddawano homogenizacji wysokociśnieniowej (EmulsiFlex-C3®, Avestin, Kanada) pod ciśnieniem 750 barów (10 000 psi) przez 10 cykli w celu wytworzenia emulsji końcowej. Wartość pH wszystkich preparatów dostosowano do 8,0 za pomocą 0,01 mol L-1 roztworu NaOH. Emulsje przechowywano w temperaturze 4 ºC. Preparaty i ich składniki podano w tabeli 2.

Charakterystyka fizykochemiczna nanoemulsji

Wartości pH preparatów oznaczano bezpośrednio w próbkach tuż po ich przygotowaniu, przy użyciu kalibrowanego potencjometru (Digimed, São Paulo, Brazylia) w temperaturze pokojowej. Średni rozmiar kropli i wskaźnik polidyspersyjności mierzono za pomocą spektroskopii korelacji fotonów (PCS), a potencjał zeta określano na podstawie ruchliwości elektroforetycznej, używając urządzenia Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument, UK) w temperaturze 25 ºC. Do tych pomiarów nanoemulsje rozcieńczano w 1 mmol L-1 roztworze NaCl w zakresie pH od 2,0 do 8,0 jednostek. Lepkość oceniano metodą wiskozymetrii kapilarnej w temperaturze 25 ºC (stała wiskozymetryczna, k = 0,0212), w temperaturze 25 ± 0,1 ºC. Rejestrowano czas, w sekundach, przepływu cieczy od górnego do dolnego znaku w rurce kapilarnej. Wszystkie preparaty analizowano w trzech egzemplarzach.

Analiza morfologiczna

Badania morfologiczne przeprowadzono metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Jedną kroplę nanoemulsji umieszczano na siatce miedzianej pokrytej węglem (200 mesh), barwiono negatyw 2,0 % roztworem octanu uranylu i pozostawiano do wyschnięcia na 24 godziny przed badaniem. Użyto instrumentu JEM-1200 EXII (JEOL, Tokio, Japonia), pracującego przy 80 kV.

WYNIKI I DYSKUSJA

W obecnym badaniu, opracowaliśmy emulsje lipidowe przeznaczone do żywienia pozajelitowego lub przenoszenia leków, stabilizowane dwiema lecytynami uzyskanymi ze źródeł roślinnych (rzepakowej (R) i słonecznikowej (S)), jako alternatywy dla lecytyny żółtka jaja (E), tradycyjnego stabilizatora emulsji pozajelitowych. W celu porównania nowych preparatów z tradycyjnymi, wszystkie pozostałe składniki emulsji utrzymywano w stężeniach podobnych do tych, jakie występują w komercyjnych emulsjach lipidowych. W pracy tej porównano również dwie różne metody produkcji: emulgowanie spontaniczne i homogenizację wysokociśnieniową.

W tabeli 3 przedstawiono właściwości fizykochemiczne powstałych nanoemulsji. Preparaty otrzymane metodą emulgowania spontanicznego charakteryzują się średnią wielkością kropli od 220 do 300 nm, określoną metodą PCS. Teoretycznie jest to zakres wysokiej stabilności emulsji.11,22,23 Wraz ze zmniejszeniem rozmiaru kropli wzrasta szybkość samodyfuzji do punktu, w którym bardzo małe krople mogą być utrzymywane przed kremowaniem poprzez mieszanie dyfuzyjne.7,23 Nanoemulsje zawierające lecytynę rzepakową lub słonecznikową wykazują mniejszy średni rozmiar kropli w porównaniu z tymi zawierającymi lecytynę z żółtka jaja. Podobne wyniki opisano dla nanoemulsji otrzymanych tą samą metodą, składających się wyłącznie z MCT, jako fazy olejowej, i stabilizowanych 2% (m/m) lecytyny jajowej.24 Na podstawie tych danych można by stwierdzić, że stężenie 1,2% byłoby wystarczające do emulgowania mieszaniny oleju sojowego, MCT i wody. Jednakże, pomimo uzyskania małych rozmiarów kropli i niskiego wskaźnika polidyspersyjności, emulsje nie zachowały stabilności fizycznej przez ponad tydzień od przygotowania, po czym można było zaobserwować wizualnie rozdzielenie faz (koalescencję). Proces koalescencji jest nieodwracalnym zjawiskiem niestabilności, ponieważ krople oleju tracą swoje granice i łączą się w większe krople.25

Skład jakościowy i ilościowy nanoemulsji, oprócz rodzaju emulgatora i metody emulgowania, może bezpośrednio wpływać na wielkość kropel.7,23 W związku z tym do przygotowania nanoemulsji przetestowano drugą metodę. Homogenizacja wysokociśnieniowa jest powszechnie stosowana w przemyśle farmaceutycznym do produkcji takich preparatów, choć na skalę przemysłową. Spośród różnych dostępnych metod emulgowania, metoda ta jest preferowana ze względu na skuteczne rozbijanie kropel. Jest to metoda wysokoenergetyczna, w której zmniejszenie wielkości kropel uzyskuje się poprzez wymuszenie pod wysokim ciśnieniem gruboziarnistej emulsji przez zawór homogenizujący, co powoduje deformację i zmniejszenie wielkości kropel.26 Spontaniczna emulgacja jest metodą tanią, łatwą i niezawodną, i jest zwykle stosowana w badaniach eksperymentalnych zamiast homogenizatora wysokociśnieniowego, który jest znacznie bardziej złożony i kosztowny.

Jak wykazano w tabeli 3, homogenizacja wysokociśnieniowa wytworzyła większe rozmiary kropel w nanoemulsjach zawierających lecytynę rzepakową (296 ± 18 nm) lub słonecznikową (417 ± 25 nm), w porównaniu z poprzednią metodą i w stosunku do kontrolnych emulsji jajowo-lecytynowych (243 ± 12 nm). Należy jednak zaznaczyć, że nawet jeśli homogenizacja wysokociśnieniowa była mniej efektywna w rozbijaniu kropel, to zapewniała większą stabilność preparatów. W przeciwieństwie do emulsji uzyskanych na drodze spontanicznej emulgacji, te były stabilne wizualnie przez co najmniej 30 dni. Wyniki te potwierdzają znaczenie metody przygotowania w nadawaniu stabilności emulsji.

Rozważając zastosowania dożylne, rozkład wielkości kropel emulsji lipidowych może być nawet ważniejszy niż średnia wielkość kropli. Mała populacja dużych kropel oleju może być wystarczająca do spowodowania zatoru tłuszczowego u pacjentów.4,5 Rozkłady wielkości kropel przygotowanych preparatów przedstawiono na rycinie 1.

Na rycinie 1 obserwuje się dwie populacje w preparatach złożonych z lecytyny rzepakowej (uzyskanej przez spontaniczną emulgację, rycina 1C) i lecytyny słonecznikowej (uzyskanej albo przez spontaniczną emulgację, albo przez homogenizację pod wysokim ciśnieniem, ryciny 1E i 1F). W rezultacie, dla tych preparatów uzyskuje się wskaźnik polidyspersyjności wyższy niż 0,20.

Stabilność emulsji może być skorelowana ze składem i właściwościami ich warstwy międzyfazowej (lecytyny), ponieważ decyduje ona o potencjale zeta preparatów i odpychaniu między kroplami, co jest jednym z mechanizmów stabilizacji emulsji.27 Lecytyna jest heterogeniczną mieszaniną fosfolipidów; Jej heterogeniczność jest niezwykle korzystna ze względu na płynność warstwy międzyfazowej w porównaniu z czystym fosfolipidem.28 Głównymi fosfolipidami mieszanin lecytynowych są fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, które w fizjologicznym pH (7,4) nie posiadają ładunku. Mniejsze ilości kwaśnych lipidów, takich jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna i fosfatydyloglicerol, mogą być również obecne. Lipidy te są zjonizowane przy pH 7,0 i wytwarzają ujemny ładunek powierzchniowy na kroplach emulsji, co przyczynia się do ich stabilności. Każda dodana substancja, która zakłóca ten ładunek, prawdopodobnie zmieni stabilność systemu.29 Nawet jeśli lecytyna klasy parenteralnej jest wysoce oczyszczona, nadal zawiera niewielką ilość innych fosfolipidów, jak pokazano w Tabeli 4, która opisuje skład trzech surowców lecytynowych użytych w tym badaniu.

Jak wykazano w Tabeli 3, mniejszy potencjał zeta (wartość modułu) obserwuje się dla nanoemulsji złożonych z lecytyny rzepakowej lub słonecznikowej i otrzymanych przez spontaniczną emulgację. Nie obserwuje się natomiast różnic w potencjałach zeta nanoemulsji wytworzonych na drodze homogenizacji wysokociśnieniowej. Wyniki te wskazują, że głównym czynnikiem wpływającym na potencjał zeta jest metoda przygotowania. Pomimo, że nasza grupa zoptymalizowała obie metody, warunki doświadczalne muszą być zazwyczaj dostosowywane, biorąc pod uwagę skład preparatów. Parametry takie jak liczba cykli i ciśnienie mogą być modyfikowane w celu uzyskania pożądanych właściwości fizykochemicznych końcowych formulacji.30,31

Potencjał zeta nanoemulsji zależy również od jonizacji emulgatora. Zmniejszenie wypadkowego ładunku (w module) z 40 mV do mniej niż 25 mV może zwiększyć szybkość flokulacji i koagulacji.32 Potencjał zeta i średnią wielkość kropli nanoemulsji złożonych z różnych lecytyn i wytworzonych różnymi metodami emulgacji oceniano w zakresie pH od 2,0 do 8,0. Wyniki przedstawiono na rysunku 2.

Ładunek powierzchniowy wszystkich preparatów maleje do zera pomiędzy pH 3,0 i 4,0, co wcześniej zaobserwowano dla Intralipidu®, emulsji triglicerydowej stabilizowanej lecytyną jajeczną.25 Potencjał zeta zależy od pH, ponieważ H+ jest jonem determinującym potencjał na powierzchniach fosfolipidów, a jego izoelektryczne pH wynosi 3,1.33 Obniżenie pH powoduje zmniejszenie (mniej ujemnego) potencjału zeta i szybsze tempo flokulacji.34 Średnia wielkość kropli wykazuje niewielki wzrost przy pH odwrócenia potencjału zeta. Z rysunku 3 można wywnioskować, że pH nanoemulsji powinno być raczej wyższe niż 7,0, ponieważ przy tej wartości pH osiąga się plateau, gdzie obserwuje się maksymalne odpychanie między kroplami oleju.

Wreszcie, morfologia kropel oleju w nanoemulsjach przygotowanych metodą homogenizacji wysokociśnieniowej została zbadana za pomocą TEM. Rysunek 3 przedstawia jednorodne i sferyczne cząstki, pokazując, że kropelki emulsji mają średni rozmiar w zakresie nanometrów. Wyniki te potwierdzają wcześniejszą analizę wielkości kropel.

Nanoemulsje są układami o niskiej lepkości i zachowaniu newtonowskim. Ocena lepkości emulsji jest kluczowa, ponieważ dożylne podawanie emulsji o dużej lepkości może być bardzo bolesne dla pacjenta.23,32 Nanoemulsje złożone z różnych lecytyn wykazują podobne lepkości. Zgodnie z oczekiwaniami nie obserwuje się zależności pomiędzy średnią wielkością kropli a lepkością nanoemulsji, ponieważ wszystkie formulacje zawierały tylko 10% rdzenia olejowego.35 Natomiast pewne różnice w lepkości obserwuje się dla formulacji otrzymanych różnymi metodami preparatyki: emulgacja spontaniczna dawała nieco bardziej lepkie emulsje.

Warto wspomnieć, że składy badanych w tej pracy nanoemulsji są oparte na składach komercyjnych nanoemulsji, w których jako emulgator zastosowano lecytynę jajową. Zastosowanie innego emulgatora może wymagać optymalizacji jego stężenia i/lub warunków emulgowania. Komercyjne nanoemulsje do wstrzykiwania składające się z lecytyny sojowej (Solipid®) wymagają na przykład 1,5 % stężenia emulgatora. Dodatkowe koemulgatory są czasami stosowane w celu stabilizacji emulsji i promowania mniejszej polidyspersyjności i mniejszych kropli. Jednakże ich zastosowanie jest ograniczone do emulsji lipidowych jako nośników leków, ponieważ w tym celu podawane są małe ilości preparatów: koemulgatory nie są często stosowane w emulsjach do żywienia pozajelitowego, ze względu na duże ilości podawanych preparatów i problemy związane z bezpieczeństwem, szczególnie w przypadku wcześniaków. Oleinian sodu jest powszechnie stosowany do stabilizacji receptur iniekcyjnych emulsji lipidowych,36 działając jako anionowy środek powierzchniowo czynny i czynnik solubilizujący.27

WNIOSKI

Wyniki badań wskazują na możliwość przygotowania iniekcyjnych emulsji lipidowych złożonych z lecytyn rzepakowych lub słonecznikowych metodą spontanicznej emulgacji i homogenizacji pod wysokim ciśnieniem, jako alternatywy dla tradycyjnych nanoemulsji jajowo-lecytynowych dla pacjentów wrażliwych na pochodne jaj. Dalsze badania powinny być prowadzone w celu optymalizacji warunków emulsyfikacji, aby poprawić długoterminową stabilność preparatów.

ACKNOWLEDGEMENTS

Autorzy chcieliby podziękować Narodowej Radzie Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq) za wsparcie finansowe i Lipoid GmbH za dostarczone materiały.

1. Waitzberg, D. L.; Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica, 1st ed., Atheneu: São Paulo, 2009.

2. Adolph, M.; Clin. Nutr. 2001,20,11.

3. Bruxel, F.; Laux, M.; Wild, L. B.; Fraga, M.; Koester, L. S.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2012,35,1827.

4. Antunes, M.; Guedes, J.; Arq. Bras. Med. 1994,68,303.

5. Trissel, L. A.; Gilbert, D. L.; Martinez, J. F.; Baker, M. B.; Walter, W. V.; Mirtallo, J. M.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1999,23,67.

6. Almeida, M. E.; Teixeira, H. F.; Koester, L. S.; Lat. Am. J. Pharm. 2008,27,780-88.

7. Benita, S.; Levy, M. Y.; J. Pharm. Sci. 1993,82,1069.

8. Robin, O.; Blanchot, V.; Vuillemard, J. C.; Paquin, P.; Lait 1992,72,511.

9. Mbela, T. K. M. N.; Ludwig, A.; Landau, I.; Deharo, E.; Haemers, A.; Int. J. Pharm. 1994,110,89.

10. Bouchemal, K.; Briançon, S.; Perrier, E.; Fessi, H.; Int. J. Pharm. 2004,280,241.

11. Klang, S.; Benita, S. In Submicron emulsions in drug targeting and delivery; Benita, S., ed; Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 1998, chap. 5.

12. Szuhaj, B. F.; Sipos, E. F. In Food Emulsifiers: Chemistry, Technology, Functional Properties and Application; Charalambous, G., Doxastakis, G., eds.; Elsevier Science Publishers B. V.: Amsterdam, 1989, chap. 10.

13. Schneider, M. In Lecithins: Sources, Manufacture, & Uses, American Oil Chemists’ Society: Illinois, 1989.

14. Szuhaj, B. F. In Bailey’s Industrial Oil and Fat Products; Shahidi, F., ed.; John Wiley and Sons: New Jersey, 2005, vol. 3, chap. 13.

15. Adan, D.; La Gamma, E. F.; Browne, L. E.; Crit. Care Clin. 1995,11,751.

16. Himaya, D. T.; Griggs, B.; Mittman, R. J.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1981,13,318.

17. Buchman, A. L.; Ament, M. E.; JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr. 1991,15,345.

18. Kamath, K. R.; Berry A.; Cummins, G.; New Engl. J. Med. 1981,304,360.

19. Wiesner, A. M.; Romanelli, F.; Stratman, R. C.; Smith, K. M.; Orthopedics 2008,31,149.

20. Yu, W.; Tabosa Do Egito, E. S.; Barrat, G.; Fessi, J. P.; Devissaguet, J. P.; Puisieux, F.; Int. J. Pharm. 1993,89,139.

21. Floyd, A. G.; Pharm. Sci. Technol. 1999,2,134.

22. Driscoll, D. F.; Pharm. Res. 2006,23,1959.

23. Constantinides, P. P.; Tustian, A.; Kessler, D. R.; Adv. Drug Deliver. Rev. 2004,56,1243.

24. Martini, E.; Carvalho, E.; Leão, F.; de Oliveira, M. C.; Teixeira, H. F.; Quim. Nova 2007,30,930.

25. Washington, C.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996,20(2-3),131.

26. Walstra, P.; Smulders, P. E. A. In Modern Aspects of Emulsion Science; Binks, B. P., ed.; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, 1998, chap. 12.

27. Lachman, L.; Liberman, H.; Kanig, L. J. Teoria e Prática na indústria farmacêutica; 3rd ed., Lea & Febiger: Philadelphia, 2001.

28. Lawrence, M. J.; Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 1996,1,826.

29. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,66,1.

30. Dias, D. O.; Colombo, M.; Kelmann, R. G.; Souza, T. P. D.; Bassani, V. L.; Teixeira, H. F.; Anal. Chim. Acta 2012,721,79.

31. Fraga, M.; Laux, M.; Zandoná, B.; Santos, G. R.; Giuberti, C. S.; de Oliveira, M. C.; J. Drug Delivery Sci. Technol. 2008,18,398.

32. Jumaa, M.; Müller, B. M.; Int. J. Pharm. 1998,163,81; Roland, I.; Piel, G.; Delattre, L.; Evrard, B.; Int. J. Pharm. 2003,263,85.

33. Davis, S. S.; Galloway, M.; J. Pharm. Pharmacol. 1981,33,88.

34. Washington, C.; Int. J. Pharm. 1990a,64,67.

35. Silvander, M.; Hellstrom, A.; Warnheim, T.; Claesson, P.; Int. J. Pharm. 2003,252,123.

36. Formariz, T. P.; Sarmento, V. H. V.; Silva-júnior, A. A.; Scarpra, M. V.; Santilli, C. V.; Oliveira, A. G.; Colloids Surf., B 2006,51,54.

Received 03/02/2014; accepted 17/04/2014; published on the web 15/07/2014

.