VIRAL PLAQUE ASSAY

Materiały:

30ml wykładniczej hodowli komórek SF9 przy 5×105 komórek/ml

6 płytek dołkowych (po 2 sztuki)

1butelka 4% żelu agarozowego

1butelka SF-900 (1.3X) medium

1sterylna butelka

0.5ml supernatantu bakulowirusowego

100ml SFM

1. W warunkach sterylnych dozować 2 ml zawiesiny komórkowej na studzienkę.

2. Pozwolić komórkom osiąść na dnie płytki i inkubować, pod przykryciem, w RT przez 1h.

3. Umieścić butelkę z żelem agarozowym w łaźni wodnej w 70oC. Umieścić pustą butelkę i SF-900 (1.3X) w łaźni wodnej w 40oC.

4. Po 1h inkubacji płytek w RT, obserwować monowarstwy pod mikroskopem odwróconym w celu potwierdzenia przyłączenia komórek i 50% konfluencji.

5. Wytworzyć 8-logowe seryjne rozcieńczenia zebranego supernatantu wirusowego poprzez sekwencyjne rozcieńczanie 0,5 ml poprzedniego rozcieńczenia w 4,5 ml pożywki SFM w 12-mld jednorazowych probówkach. Powinno się uzyskać 8 probówek zawierających każde z rozcieńczeń 10-1 do 10-8 oryginalnego zapasu wirusa.

7. Sekwencyjnie usunąć supernatant z każdego dołka, odrzucić i natychmiast zastąpić 1 ml odpowiedniego rozcieńczenia wirusa do każdego zduplikowanego dołka. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT.

8. Przenieść butelki z łaźnią wodną do sterylnego kaptura, gdy agaroza się upłynni (20 do 30 minut).Szybko dozować 30 ml podłoża SF-900 (1.3X) i 10 ml 4% żelu agarozowego do pustej butelki i delikatnie wymieszać. Zwrócić butelkę z nakładkami do plastrowania do łaźni wodnej o temperaturze 40oC do czasu użycia.

9. Po drugiej 1-godzinnej inkubacji ponownie umieścić butelkę z rozcieńczoną agarozą i płytki 6-dołkowe w kapturze.

10.Sekwencyjnie (od wysokiego do niskiego rozcieńczenia) usunąć wirusa z dołków i zastąpić go 2 ml rozcieńczonej agarozy. Pracować szybko, aby uniknąć wysuszenia monowarstwy.Pipeta Pasteura podłączona do pompy próżniowej łatwo usuwa ślady inokulum.

11.Pozostawić żel do stwardnienia na 10 do 20 minut przed przeniesieniem.

12.Inkubować w temperaturze 27oC w nawilżonym inkubatorze przez 4 do 10 dni.

13.Rekombinantwirus wytwarza mleczno-szare płytki o niewielkim kontraście, widoczne bez barwienia lub innych metod wykrywania.

14.Monitorować płytki codziennie, aż liczba policzonych płytek nie zmieni się przez dwa kolejne dni.

15.W celu określenia miana zastosowanego inokulum, optymalny zakres liczenia wynosi od 3 do 20 płytek na studzienkę płytki 6-studzienkowej. Miano (pfu/ml) można obliczyć według następującego wzoru:

16. Nakładanie agarozy z barwnikiem czerwieni naturalnej:

Przygotować 0,5% roztwór agarozy w SFM

Dodać roztwór Czerwieni Naturalnej do końcowego stężenia 50mg/ml (rozcieńczyć 3,33mg/ml roztwór podstawowy 1:66,6).

Nałożyć 1ml roztworu barwnika do każdej studzienki (na płytce 6 studzienkowej).

.