Regulacja Syntezy Cholesterolu

00:00:08.12Nazywam się Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03i jestem z Wydziału Genetyki Molekularnej
00:00:12.01at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas.
00:00:15.17W tej prezentacji,
00:00:17.19Będę mówił o regulacji zwrotnej reduktazy HMG CoA,
00:00:20.27, który jest enzymem ograniczającym tempo syntezy cholesterolu.
00:00:25.06Slajd ten przedstawia strukturę cholesterolu
00:00:27.06 i niektóre z cech tej ważnej cząsteczki.
00:00:31.01Cholesterol jest sterolem,
00:00:33.10który jest wyróżniony przez tę czteropierścieniową strukturę.
00:00:36.00Ta czteropierścieniowa struktura nadaje sztywność tej cząsteczce,
00:00:39.02, co czyni go idealnym składnikiem błon komórkowych.
00:00:43.18Teraz, ponieważ cholesterol ma dużą liczbę
00:00:46.07 wiązań węgiel-węgiel i węgiel-wodór,
00:00:49.02this molecule is virtually insoluble in water.
00:00:52.07So, because of this reason,
00:00:54.13cells must be able to maintain cholesterol in a narrow range,
00:00:58.03such that enough cholesterol is produced for the cellular needs of the molecule
00:01:02.13but avoides the toxic overaccumulation of cholesterol.
00:01:06.16Overaccumulation of cholesterol can be toxic at the cellular level.
00:01:12.11Teraz, ten slajd pokazuje niektóre z istotnych funkcji cholesterolu.
00:01:15.10Cholesterol jest absolutnie niezbędny do życia.
00:01:17.26Jak wspomniałem wcześniej,
00:01:19.27one of the most well-recognized role for cholesterol
00:01:22.26is its role in cell membranes,
00:01:25.08where it maintains optimal membrane fluidity.
00:01:29.00Teraz, cholesterol okazuje się być ważnym prekursorem
00:01:32.01 dla bardzo ważnych cząsteczek, takich jak hormony steroidowe,
00:01:34.25 które pomagają odróżnić dziewczynki od chłopców;
00:01:38.19kwasy lotne, które pomagają w trawieniu i żywieniu poprzez rozpuszczanie tłuszczów i witamin rozpuszczalnych w tłuszczach;
00:01:47.10i wreszcie, cholesterol jest obfite w mózgu,
00:01:50.18gdzie znajduje się w osłonkach mielinowych, które otaczają aksony
00:01:53.17i pomagają w synap… transmisjach synaptycznych.
00:01:58.18Teraz, komórki w naszych ciałach — ssaki… komórki ssaków —
00:02:02.01 pozyskują cholesterol z dwóch źródeł.
00:02:04.21Jedno ze źródeł jest zilustrowane na tym slajdzie,
00:02:07.06i to poprzez syntezę cholesterolu
00:02:09.19z prekursora acetylo-CoA.
00:02:13.00Teraz, konwersja acetylo-CoA do cholesterolu
00:02:15.21occurs poprzez działanie ponad 20 enzymów.
00:02:20.22Now, jak można sobie wyobrazić,
00:02:22.21synteza cholesterolu obejmuje produkcję kilku produktów pośrednich,
00:02:26.16i te półprodukty same
00:02:29.14mogą być również przekształcone w bardzo ważne produkty końcowe.
00:02:33.11Na przykład, ten związek, pirofosforan farnezylu,
00:02:36.29jest prekursorem ważnego związku o nazwie dolichol,
00:02:40.25który jest zaangażowany w N-linked glycosylation.
00:02:43.26Jest również prekursorem hemu i ubichinonów,
00:02:46.10które są zaangażowane w oddychanie komórkowe;
00:02:49.26witaminy K, która jest zaangażowana w krzepnięcie krwi;
00:02:53.12i wreszcie, ten pirofosforan farnezylu i pirofosforan geranylu
00:02:58.06będzie dołączony do wielu białek sygnalizacyjnych,
00:03:01.16małe białka GTP,
00:03:03.22kierując je do błon,
00:03:06.12i ta modyfikacja jest absolutnie niezbędna do normalnego funkcjonowania komórki.
00:03:13.04Now, ten slajd pokazuje, że synteza cholesterolu
00:03:16.02occurs w różnych tkankach w różnym tempie.
00:03:19.29Now, wątroba i nadnercza
00:03:23.14syntetyzują najwięcej cholesterolu w naszych ciałach.
00:03:25.10I powinienem zaznaczyć, że to faktycznie zostało zrobione na myszach,
00:03:28.06ale podobne efekty są widziane u ludzi
00:03:31.07i innych naczelnych.
00:03:33.19Wątroba… wątroba syntetyzuje duże ilości cholesterolu
00:03:36.24 głównie do produkcji lipoprotein
00:03:39.14 a także do syntezy kwasów żółciowych.
00:03:42.10Nadnercza produkują cholesterol
00:03:45.28przede wszystkim do syntezy hormonów steroidowych,
00:03:48.13gdzie jelita syntetyzują cholesterol do…
00:03:51.27dla podziału komórek.
00:03:54.12Duża liczba komórek w jelitach jest złuszczana każdego dnia
00:03:57.12i muszą być zastąpione przez nowe komórki,
00:03:59.27co wymaga znacznej ilości syntezy cholesterolu.
00:04:03.28Powinienem również zaznaczyć, że jelito jest również źródłem produkcji lipoprotein.
00:04:09.21So, teraz drugie źródło cholesterolu
00:04:12.12jest rzeczywiście z lipoprotein
00:04:15.16at są produkowane przez wątrobę i jelito.
00:04:18.06Więc, pokazany tutaj jest model lipoproteiny o niskiej gęstości.
00:04:23.02Jest to główny nośnik cholesterolu w ludzkim osoczu.
00:04:28.02Więc, lipoproteina o niskiej gęstości, lub LDL,
00:04:31.14 składa się z rdzenia, który składa się z wolnego cholesterolu.
00:04:36.19Tak więc, hydrofobowy cholesterol tworzy rdzeń cząsteczki LDL.
00:04:41.19Teraz, ten hydrofobowy cholesterol
00:04:44.01jest otoczony przez powłokę, która składa się z fosfolipidu
00:04:47.02z różnymi ilościami zestryfikowanego cholesterolu
00:04:51.13–jest to cholesterol, do którego został przyłączony kwas tłuszczowy —
00:04:55.14, który jest interkalowany do fosfolipidowej powłoki.
00:04:59.03Teraz, cała ta cząsteczka LDL
00:05:02.18 jest otoczona przez białko zwane apolipoproteiną B.
00:05:08.02Więc, ten slajd właściwie przedstawia
00:05:10.17 jak komórki pozyskują cholesterol z tych dwóch źródeł:
00:05:13.13endogennej syntezy i z LDL.
00:05:18.19Więc, receptory LDL
00:05:21.09– znajdują się na powierzchni komórek —
00:05:23.20wiążą się z LDL poprzez interakcję z tą cząsteczką apolipoproteiny B
00:05:29.12, która otacza otoczkę lipoproteiny.
00:05:32.25Gdy cząsteczka LDL zwiąże się z receptorem LDL,
00:05:35.27Cały kompleks jest internalizowany do opłaszczonych dołków.
00:05:40.06I te opłaszczone dołki są następnie kierowane do lizosomów,
00:05:43.07gdzie cząsteczka LDL jest degradowana, a cholesterol
00:05:47.15– wolny cholesterol —
00:05:49.25 jest teraz uwolniony i dostarczony do komórki do różnych zastosowań.
00:05:54.18Więc, znowu, te dwa źródła komórkowego cholesterolu
00:05:58.03– albo z receptora… LDL receptor-mediowana endocytoza LDL,
00:06:03.07lub poprzez endogenną syntezę —
00:06:06.02 mogą być używane zamiennie.
00:06:09.01Więc, na przykład, jeśli LDL staje się ograniczający,
00:06:12.00komórka przełącza się na endogenną syntezę dla swoich źródeł cholesterolu.
00:06:18.02A jeśli endogenna synteza jest zablokowana,
00:06:20.05to komórki mogą teraz używać egzogennego LDL
00:06:23.01dla ich źródła cholesterolu.
00:06:27.00Więc, rozmawialiśmy o zasadniczej funkcji cholesterolu.
00:06:30.10Jest ważny w błonach komórkowych.
00:06:32.11Jest ważnym prekursorem hormonów steroidowych
00:06:34.28i kwasów żółciowych.
00:06:36.16Jednakże jest zła strona cholesterolu,
00:06:38.13i to jest zilustrowane na tym slajdzie.
00:06:41.00Od wielu lat podwyższony poziom cholesterolu LDL we krwi
00:06:46.14jest związany z ryzykiem choroby wieńcowej serca
00:06:49.19i zawałów serca.
00:06:51.16Więc, pokazany tutaj widać, że
00:06:54.27the level of blood cholesterol
00:06:57.26literally correlates with risk for coronary heart disease.
00:07:01.09And this is because elevated cholesterol
00:07:04.21can actually deposit in the arteries that lead to the… to the heart.
00:07:08.12And over time, this deposition
00:07:11.15results in a disease called atherosclerosis,
00:07:13.09in which this deposition of cholesterol
00:07:15.04can lead to the production of plaques
00:07:17.12that ostatecznie może zablokować przepływ krwi do serca,
00:07:19.18ereby tworząc atak serca.
00:07:23.06Now, jeden z najczęściej przepisywanych leków
00:07:28.16do obniżenia cholesterolu LDL
00:07:31.11jest grupa leków zwanych statynami.
00:07:33.03Pokazano tutaj typową strukturę rdzenia statyn
00:07:37.26 i niektóre z różnych form statyn
00:07:41.29, które zostały wykorzystane w klinice.
00:07:44.22Przez lata, statyny
00:07:47.12 stały się jednym z najbardziej… największą sprzedażą leków…
00:07:49.10medykamentów w Stanach Zjednoczonych
00:07:51.20z powodu ich zdolności do obniżania cholesterolu LDL we krwi.
00:07:57.19Więc, pokazane w tym eksperymencie jest podsumowanie co najmniej czterech badań
00:08:02.23that reveal that statins indeed reduce LDL cholesterol
00:08:06.06and that reduction leads to a reduced incidence
00:08:10.04of coronary heart disease.
00:08:12.11So, shown here in the closed circles are clinical trials
00:08:15.11, w których pacjenci byli albo leczeni statyną, pokazaną w… pokazaną w zamkniętych kółkach,
00:08:20.22lub placebo.
00:08:22.11I w każdym z tych badań, leczenie statyną prowadziło do
00:08:25.17spadku poziomu cholesterolu LDL,
00:08:28.06and this drop in LDL cholesterol levels
00:08:31.19led to a reduction in coronary events, i.e. heart attacks.
00:08:35.13So, then the question becomes, you know, how do statins work?
00:08:38.21And what do statins do?
00:08:40.28Więc, najpierw odpowiedzieliśmy, co robią statyny?
00:08:43.16Statyny hamują enzym reduktazę HMG CoA.
00:08:47.05Reduktaza HMG CoA katalizuje
00:08:50.20stopień graniczny w syntezie cholesterolu.
00:08:53.28Jest to właściwie czwarty krok w szlaku syntezy cholesterolu.
00:08:58.06Więc statyny konkurencyjnie hamują reduktazę HMG CoA
00:09:01.20poprzez naśladowanie produktu reakcji reduktazy,
00:09:05.13mevalonate.
00:09:07.20So, this competitive inhibition of the reductase
00:09:10.19underlies the ability of statins to downregulate
00:09:14.18LDL cholesterol in the blood.
00:09:18.07So, how do statins work?
00:09:20.17So, again, by competitively inhibiting HMG CoA reductase,
00:09:24.01this leads to a drop in the amounts of mevalonate
00:09:27.09and of course a drop in cholesterol.
00:09:30.18This cholesterol depletion leads to an increase
00:09:33.12in the transcription of the gene
00:09:36.06encoding the LDL receptor.
00:09:37.25I w rezultacie, liczba receptorów LDL na powierzchni…
00:09:41.14zwłaszcza komórek wątroby,
00:09:43.15i ten wzrost receptorów LDL prowadzi
00:09:48.01do zwiększonego lub wzmocnionego wychwytu LDL we krwi.
00:09:52.25And that reduction in blood LDL
00:09:55.26is responsible for the lowering of coronary heart disease
00:09:58.20in statin-treated patients.
00:10:02.12However, the clinical effects of statins
00:10:05.26are actually blunted by
00:10:09.06the compensatory increase in HMG CoA reductase
00:10:11.10at accompanies statin therapy.
00:10:13.19And that’s illustrated in this slide.
00:10:15.13This is an immunoblot of HMG CoA reductase protein
00:10:19.03w wątrobach myszy, które były karmione statyną,
00:10:22.17lub nawet w hodowlanych komórkach
00:10:25.00które były leczone statynami in vitro.
00:10:26.24I jak widać,
00:10:28.20leczenie statyną powoduje wyraźne nagromadzenie
00:10:31.09reduktazy HMG CoA.
00:10:33.10I ta akumulacja, jak wspomniałem wcześniej,
00:10:35.24blunduje kliniczne efekty statyn.
00:10:38.12Więc, nasze następne pytanie brzmi, dlaczego statyny powodują
00:10:41.27 akumulację reduktazy HMG CoA do tak wysokiego poziomu?
00:10:44.14Co powinienem zaznaczyć, zostało oszacowane jako
00:10:47.02co najmniej 200-krotne.
00:10:49.29Więc, normalnie reduktaza HMG CoA
00:10:51.25 podlega ogromnej ilości regulacji zwrotnej.
00:10:55.02I ta regulacja zwrotna jest pośredniczona częściowo
00:10:57.29przez sterole.
00:11:00.02Terapia statyną, jak wspomniałem wcześniej,
00:11:02.05blokuje aktywność reduktazy HMG CoA,
00:11:04.12i zapobiega syntezie tych cząsteczek sterolu.
00:11:07.29I oczywiście, że zapobieganie syntezie steroli
00:11:10.26rzeczywiście jest odpowiedzialny za upregulation receptorów LDL
00:11:14.17i późniejsze zmniejszenie cholesterolu LDL.
00:11:18.09Jednakże, ponieważ statyny
00:11:21.03 blokują syntezę steroli,
00:11:22.18zaburzają regulację zwrotną reduktazy.
00:11:25.14I w rezultacie dochodzi do trzech zdarzeń.
00:11:27.28Po pierwsze, z powodu tego zmniejszenia cholesterolu
00:11:31.09i innych produktów szlaku syntetycznego cholesterolu,
00:11:35.08there’s an enhanced transcription of the reductase gene,
00:11:39.07there’s an enhanced of translation
00:11:41.28of the reductase mRNA,
00:11:43.17 i wreszcie jest zwiększona stabilność
00:11:45.24 białka reduktazy.
00:11:47.13Więc, te trzy zdarzenia są odpowiedzialne
00:11:49.19 za ten wyraźny wzrost białka reduktazy
00:11:52.03 Pokazałem wam na poprzednim slajdzie.
00:11:55.18 Tak więc, przez lata,
00:11:57.06 moje laboratorium było zainteresowane próbą zrozumienia
00:11:59.27 molekularnych mechanizmów, które leżą u podstaw
00:12:02.22 tej zwiększonej stabilności białka,
00:12:04.09and that will be the subject of the remainder of this presentation.
00:12:09.16So, this slide illustrates that sterols
00:12:13.08indeed accelerate the degradation
00:12:15.26of HMG CoA reductase.
00:12:17.14So, in this experiment,
00:12:19.11wykorzystaliśmy klasyczną analizę pulse-chase
00:12:20.29do monitorowania stabilności reduktazy w komórkach
00:12:23.16które zostały potraktowane w nieobecności lub obecności steroli.
00:12:26.00Więc, to co tu robimy, to typowo znakujemy komórki radioaktywnością,
00:12:29.Następnie zabieramy radioaktywność,
00:12:33.25 i śledzimy stabilność białka reduktazy
00:12:39.26 w nieobecności lub obecności steroli.
00:12:44.10I jak widać tutaj,
00:12:46.08gdy komórki są ścigane w mediach
00:12:49.07które nie zawierają radioaktywności,
00:12:51.01w nieobecności steroli
00:12:52.28reduktaza jest dość stabilna w czasie.
00:12:55.16Jednakże, jak widać,
00:12:57.21dodanie steroli w pożywce pościgowej
00:12:59.26 powoduje, że poziomy reduktazy wyraźnie maleją.
00:13:02.20Ponownie, to wskazuje na przyspieszoną przez sterole degradację
00:13:06.04 reduktazy HMG CoA.
00:13:09.16Teraz, by zrozumieć molekularne mechanizmy
00:13:11.22dla tej indukowanej sterolem degradacji reduktazy,
00:13:14.15musimy zrozumieć strukturę białka reduktazy HMG CoA.
00:13:18.05A struktura domeny reduktazy
00:13:20.14is actually illustrated in this slide.
00:13:22.18So, HMG CoA reductase
00:13:24.16consists of two distinct domains.
00:13:26.28It has an N-terminal domain
00:13:29.06that anchors the protein in the membranes of the endoplasmic reticulum,
00:13:32.14or the ER.
00:13:35.00Now, this N-terminal domain,
00:13:36.29which we refer to as the membrane domain,
00:13:39.04zawiera osiem regionów rozprzestrzeniających się w błonie.
00:13:42.05Po niej następuje druga domena reduktazy HMG CoA,
00:13:45.07 którą nazywamy domeną katalityczną.
00:13:47.24So, domena katalityczna wystaje do cytozolu komórek
00:13:51.24i zawiera całą aktywność enzymatyczną reduktazy HMG CoA.
00:13:56.03W rzeczywistości, okrojona wersja reduktazy
00:13:59.29at zawiera tylko domenę katalityczną
00:14:02.13 może całkowicie uratować syntezę mewalonianu
00:14:06.28 w komórkach, w których brakuje reduktazy HMG CoA.
00:14:10.13Więc, domena katalityczna jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca
00:14:13.01 do syntezy mewalonianu.
00:14:15.29Co następnie rodzi pytanie,
00:14:17.28dlaczego to białko jest związane z błoną?
00:14:19.26I okazuje się, że reduktaza
00:14:22.02jest w rzeczywistości białkiem związanym z błoną już u drożdży.
00:14:25.18Więc, funkcja domeny błonowej reduktazy
00:14:28.26was illustrated in this early experiment
00:14:31.27at compared the stability of the catalytic domain
00:14:35.08– which, remember, contains all enzymatic activity —
00:14:37.26to the full-length enzyme.
00:14:40.20And again, a simple pulse-chase analysis
00:14:42.21was used to monitor the stability of these two proteins.
00:14:47.13Jak widać w panelu po lewej,
00:14:49.03 okrojona domena katalityczna wytwarza
00:14:53.14bardzo stabilne białko, które… co ważne,
00:14:57.08 jego degradacja nie jest pod wpływem steroli.
00:14:59.20W przeciwieństwie do tego, białko o pełnej długości — które, ponownie, zawiera domenę błonową —
00:15:03.07 jest mniej stabilne, nawet w nieobecności steroli.
00:15:06.13I można zauważyć, że sterole znacznie przyspieszają
00:15:09.25 degradację reduktazy HMG CoA,
00:15:12.09 co wskazuje, że domena błonowa…
00:15:15.12funkcja domeny błonowej
00:15:17.25jest dla tej przyspieszonej przez sterol lub indukowanej przez sterol degradacji.
00:15:22.08Więc, co poprzednie badania wskazały
00:15:25.12jest to, że domena błonowa reduktazy
00:15:28.03jest konieczna i wystarczająca do przyspieszonej degradacji steroli,
00:15:30.25i sugerowały one, że domena błonowa,
00:15:33.16bezpośrednio lub pośrednio,
00:15:35.16może wyczuwać wewnątrzkomórkowe poziomy steroli.
00:15:38.00I wyczuwanie powoduje, być może,
00:15:41.02a zmiana konformacyjna w domenie błonowej reduktazy
00:15:43.29at powoduje, że białko jest podatne na szybką degradację.
00:15:48.14I oczywiście, ponieważ statyny blokują syntezę cholesterolu,
00:15:52.01 statyny rzeczywiście blokują to
00:15:54.22 co nazywamy ER-associated degradation — lub ERAD —
00:15:57.08 reduktazy HMG CoA.
00:16:02.23Więc, kluczowy przełom w naszym rozumieniu
00:16:04.23 ERAD reduktazy HMG CoA
00:16:06.15 nastąpił wraz z odkryciem pary białek
00:16:08.28– białek błony ER —
00:16:10.23 nazwanych Insig-1 i Insig-2.
00:16:14.15Te białka Insig, dla celów tego wykładu,
00:16:16.27 są bardzo redundantne.
00:16:18.Pełnią nadmiarowe role w degradacji, lub ERAD, reduktazy HMG CoA.
00:16:22.06 Są identyczne… są w około 85% identyczne,
00:16:26.23 i są wysoce hydrofobowymi białkami.
00:16:29.24Teraz, rola Insigs w ERAD reduktazy HMG CoA
00:16:34.28 została po raz pierwszy zilustrowana w tym eksperymencie.
00:16:37.19Więc, tutaj ponownie użyliśmy analizy pulse-chase
00:16:40.15, aby zmierzyć przyspieszoną przez sterol degradację
00:16:43.29 reduktazy w komórkach
00:16:47.02, które były albo transfekowane cząsteczkami kontrolnymi,
00:16:51.06called siRNAs,
00:16:53.05or cells that were transfected with siRNAs
00:16:55.26at would lead to the knockdown of expression
00:16:58.13of both Insig-1 and Insig-2.
00:17:02.I jak widać w panelu po lewej stronie,
00:17:04.13 w komórkach transfekowanych kontrolnym siRNA,
00:17:08.04sterole wyraźnie przyspieszają degradację
00:17:12.07 reduktazy HMG CoA.
00:17:14.13Więc, otwarte kółka to eksperymenty przeprowadzone w nieobecności,
00:17:17.09 a zamknięte kółka to eksperymenty przeprowadzone
00:17:20.15 w obecności steroli.
00:17:22.12I co można łatwo zauważyć, to że knockdown Insig-1 i Insig-2
00:17:26.23kompletnie znosi degradację przyspieszoną przez sterole,
00:17:30.02 wskazując, że te białka
00:17:32.28 odgrywają kluczową rolę w tym procesie.
00:17:35.27Nasze kolejne pytanie brzmi,
00:17:38.02 jaki jest mechanizm
00:17:39.26 dzięki któremu Insigs przyspieszają ERAD reduktazy HMG CoA?
00:17:47.09Więc, ten eksperyment…
00:17:48.21 ten slajd pokazuje, że inhibitory proteasomu, proteasomu 26S,
00:17:53.21 blokują indukowaną sterolem degradację reduktazy HMG CoA.
00:17:57.15Więc, jak widać w tym eksperymencie…
00:18:00.18 w pierwszych dwóch pasach, sterole spowodowały znaczną degradację reduktazy,
00:18:04.17 and this degradation is completely blocked
00:18:06.19when these cells are treated with the proteasome inhibitor.
00:18:12.03So, with… this allows us to create another model
00:18:15.27, w którym, ponownie, domena błonowa reduktazy
00:18:18.25bezpośrednio lub pośrednio
00:18:21.22wykrywa poziom wewnątrzkomórkowych steroli,
00:18:24.15. To powoduje, że reduktaza wiąże się z Insigami,
00:18:28.12i że wiązanie Insigów prowadzi do reakcji, które powodują, że reduktaza
00:18:32.06jest teraz degradowana przez proteasom 26S.
00:18:37.22Teraz wiadomo, że większość substratów proteasomów
00:18:41.00wymaga ich wcześniejszej ubikwitynacji.
00:18:44.05Ubiikwitynacja jest procesem, w którym
00:18:46.23małe białko ubikwityna zostaje kowalencyjnie przyłączone
00:18:50.16do cząsteczek substratów.
00:18:52.08A gdy łańcuch ubikwityn
00:18:54.16jest przyłączony do substratów,
00:18:56.08 staje się rozpoznawany przez proteasomy w celu degradacji.
00:19:00.25Teraz nazywa się to polubikwitynacją,
00:19:02.25i polubikwitynacja białek
00:19:05.14wymaga działania co najmniej trzech różnych typów enzymów.
00:19:07.29Zilustrowano to na tym slajdzie.
00:19:11.09W pierwszym etapie,
00:19:13.15ubiquitin becomes activated
00:19:15.20w sposób zależny od ATP przez enzym zwany E1,
00:19:19.11lub białko aktywujące ubikwitynę.
00:19:22.15W kolejnym kroku ubikwityna jest przenoszona z E1 do…
00:19:27.13do innego enzymu zwanego E2, czyli ubiquitin-conjugating enzyme.
00:19:32.16W ostatnim kroku E2 łączy się z E3,
00:19:36.24lub ligazy ubikwitynowej,
00:19:39.08, która z kolei wiąże się z substratem,
00:19:42.09 pokazanym tutaj na zielono.
00:19:44.11Co robi E3, to ułatwia transfer ubikwityny
00:19:47.27z enzymu sprzęgającego ubikwitynę
00:19:50.00do reszty lizynowej w białku substratowym,
00:19:53.08generując ubikwitynowany substrat.
00:19:57.28Teraz proces ten zachodzi wiele razy,
00:20:00.02aż do momentu, gdy łańcuch ubikwitynowy zostanie zbudowany na białku substratowym.
00:20:06.02To może być teraz rozpoznane przez proteasomy w celu degradacji.
00:20:10.18Więc, biorąc pod uwagę, że te białka Insig
00:20:12.26 są wymagane do degradacji reduktazy,
00:20:15.08 i że reduktaza rzeczywiście jest degradowana przez proteasomy,
00:20:19.02 nasze następne pytanie brzmi, czy reduktaza jest ubikwitynowana?
00:20:23.20Na to pytanie uzyskaliśmy odpowiedź w tym eksperymencie
00:20:26.11pokazanym na tym slajdzie.
00:20:28.21Więc, to co zrobiliśmy w tym eksperymencie to potraktowaliśmy komórki
00:20:31.15 w nieobecności i obecności steroli
00:20:33.20 i inhibitora proteasomu.
00:20:37.05Po tych zabiegach,
00:20:39.11wykonaliśmy immunoprecypitację reduktazy
00:20:41.21and then probe those immunoprecipitates for either total reductase,
00:20:43.20shown on the bottom panel,
00:20:45.18or ubiquitinated reductase.
00:20:49.07Więc, jak widać w pierwszym pasie,
00:20:51.01nawet jeśli reduktaza jest ściągana w tych eksperymentach,
00:20:55.11nie widzimy żadnej reaktywności z ubikwitynacją.
00:20:58.14However, sterols cause the reductase to become ubiquitinated.
00:21:03.09And this ubiquitination is markedly increased
00:21:07.22if we also include proteasome inhibitors.
00:21:09.27So, co to wskazuje nam jest, że sterole
00:21:12.16powodują, że reduktaza staje się ubikwitynowana,
00:21:14.20i to ubikwitynowane białko jest teraz degradowane przez proteasomy,
00:21:17.18as indicated by the stability of ubiquitinated reductase
00:21:21.21by these proteasome inhibitors.
00:21:24.27Our next question is,
00:21:27.07are Insigs required for this sterol-induced ubiquitination of the reductase?
00:21:32.16And again, we turn to siRNAs.
00:21:35.08Cells were transfected either with the control siRNA
00:21:38.18or siRNAs against Insig-1 and -2.
00:21:41.03We then treat these cells in the absence or presence of sterols,
00:21:43.20and then probe for ubiquitinated reductase.
00:21:47.16I jak widać w pierwszych dwóch pasach,
00:21:49.10reduktaza jest ładnie ubikwitynowana w obecności steroli,
00:21:52.08i knockdown Insig-1 i Insig-2
00:21:56.02completely abolishes this ubiquitination.
00:22:01.01So, that now allows us to fill more gaps in our model
00:22:04.07for the Insig-mediated ERAD of HMG CoA reductase.
00:22:09.14Teraz okazuje się, że podzbiór cząsteczek Insig
00:22:12.00 faktycznie wiąże się z kompleksem ligazy ubikwitynowej E3/E2.
00:22:16.27Ponownie, w obecności steroli,
00:22:20.15domena błonowa reduktazy
00:22:23.03wyczuwa sterol,
00:22:24.25i to wyczuwanie powoduje, że reduktaza wiąże się z Insigs,
00:22:27.28i oczywiście te Insigs
00:22:31.13także mostkują reduktazę do kompleksu ligazy ubikwitynowej E3/E2.
00:22:36.26To mostkowanie powoduje następnie ubikwitynację reduktazy
00:22:40.00 w dwóch resztach lizyny w domenie błonowej.00:22:46.17 zostaje usunięta z błony ER
00:22:50.09 i następnie zdegradowana przez proteasomy,
00:22:52.22poprzez proces, którego nie jesteśmy do końca…
00:22:55.07poprzez proces, który nie jest do końca zrozumiały.
00:23:00.20Więc, podsumowując, powiedziałem wam dzisiaj
00:23:03.16that HMG CoA reductase is the rate-limiting enzyme
00:23:06.07in the cholesterol synthetic pathway,
00:23:08.01and it’s a target of these cholesterol-lowering statin drugs.
00:23:11.Reduktaza jest kontrolowana przez bardzo złożony
00:23:15.16 system regulacji zwrotnej
00:23:18.01, w którym pośredniczy cholesterol i inne rodzaje steroli.
00:23:20.18 I że statyny zakłócają ten system regulacji zwrotnej,
00:23:24.03 częściowo przez blokowanie tego Insig-mediated ubikwitynacji
00:23:27.10i ERAD reduktazy HMG CoA.

.