Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamase CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Clinical Isolates

Tło

Na całym świecie pojawiła się i rozprzestrzeniła lekooporność wśród niektórych bakterii Gram-ujemnych (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii i Pseudomonas aeruginosa). Wśród bakterii z rodziny Enterobacterales, Escherichia coli i Klebsiella spp. są często izolowanymi organizmami, które wykazują znaczną lekooporność. β-laktamy są powszechnie przepisywanymi lekami przeciwko tym opornym szczepom i same stanowią około dwóch trzecich ostatnio przepisywanych leków klinicznych.1 Grupa ta obejmuje cztery główne klasy chemiczne: penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy i monobaktamy, w których karbapenemy są stosowane jako leki ostatniej szansy w terapii empirycznej przeciwko patogennym szczepom bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i beztlenowych.2

Oporność na β-laktamy wynika z wytwarzania β-laktamaz, enzymów hydrolitycznych, które są w stanie unieczynnić antybiotyki zanim dotrą one do białek wiążących penicyliny (PBP) zlokalizowanych w błonie cytoplazmatycznej.3 Główne rodziny β-laktamaz obejmują plazmidowe β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania (ESBL), AmpC, cefalosporynazy i karbapenemazy. Wszystkie klasy zostały wykryte na całym świecie, a kilka z nich skoncentrowano w określonych krajach.1

Geny kodujące β-laktamazę AmpC rozprzestrzeniły się szeroko i są powszechnie wykrywane w plazmidach bakteryjnych. Pierwszy wariant AmpC kodowany na plazmidach został zidentyfikowany w 1989 roku u Klebsiella pneumoniae wyizolowanej w Korei Południowej. Nazwano go CMY-1 ze względu na cechę fenotypową związaną z cefamycyną i notoryczną opornością na cefoksytynę.4,5 W krótkim czasie wykryto wiele rodzin plazmidowych wariantów AmpC, głównie z izolatów K. pneumoniae i E. coli. Bakterie posiadające plazmidowe genotypy AmpC zostały przypisane na podstawie homologii sekwencji kwasów nukleinowych, tworząc większą liczbę rodzajów bakterii, które stanowiły źródło tych plazmidów i szereg rodzin AmpC.6 Do tej pory na świecie odnotowano następujące rodziny AmpC: dwie rodziny β-laktamaz CMY (CMY-1 i CMY-2) wyizolowane odpowiednio z Aeromonas hydrophila i Citrobacter freundii; enzymy typu FOX i MOX wyizolowane z Aeromonas spp.Rodzina ACC pochodzi z H. alvei; rodzina LAT cefalosporynaz wyizolowana z C. freundii; rodziny MIR i ACT pochodzą z Enterobacter spp. oraz rodzina DHA wyizolowana z Morganella morganii.4,6,7 Większość genów AmpC kodowanych przez plazmidy znajduje się w izolatach E. coli i K. pneumoniae w zakażeniach szpitalnych, podczas gdy oporność innych bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. cloacae, C. freundii, S. marcescens i M. morganii, jest nadawana przez β-laktamazy AmpC indukowane przez chromosomy, co zwiększa oporność na cefalosporyny o szerokim spektrum działania.8 Organizmy wytwarzające ESBL, często charakteryzujące się koekspresją z β-laktamazami AmpC, stanowią poważne zagrożenie w diagnostyce i leczeniu patogenów.

Co więcej, geny β-laktamaz AmpC, zwłaszcza MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM i ACCM, są odpowiedzialne za rozwój oporności o szerokim spektrum na większość β-laktamów (poza cefepimem i karbapenemami). Ponadto, nabycie tych genów u bakterii może jeszcze bardziej zwiększyć oporność, ponieważ inhibitory enzymów klasy A (w tym kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam) oraz p-chloromerkuribenzoesan nie są skuteczne wobec β-laktamaz AmpC, chociaż niektóre z nich mogą być hamowane przez tazobaktam lub sulbaktam.6

Pomimo wysiłków podejmowanych w celu zahamowania wzrostu i rozprzestrzeniania się patogenów lekoopornych, badania nad AmpC β-laktamazami w warunkach ograniczonych zasobów są nadal niewystarczające. Najważniejszym krokiem w radzeniu sobie z rosnącą opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) jest precyzyjne wykrywanie patogennych (i/lub opornych) szczepów w laboratoriach diagnostycznych. Niemniej jednak, protokoły laboratoryjne stosowane w rutynowym raportowaniu nie zapewniają precyzyjnych wyników w Nepalu, ponieważ β-laktamazy AmpC są trudne do zidentyfikowania wyłącznie za pomocą testów fenotypowych i często są fałszywie wykrywane jako ESBL w laboratoriach klinicznych. Izolaty Enterobacterales, które są pozytywne w teście przesiewowym fenotypu ESBL, ale negatywne w teście potwierdzającym, są zwykle uważane za potencjalnych producentów AmpC β-laktamaz, albo nadanych przez chromosomalną depresję lub transfer plazmidu.9

Nawet eksperci mikrobiolodzy kliniczni nie są w stanie zidentyfikować plazmidowej AmpC β-laktamazy, sugerując w ten sposób potrzebę bardziej precyzyjnej i specyficznej metody do szybkiego wykrywania. Jednakże niektóre z tych procedur wymagają dużych nakładów, często wymagają zastosowania odczynników, które nie są łatwo dostępne.10 Z tych powodów β-laktamazy AmpC nie są wykrywane w próbkach klinicznych. Dlatego też opracowano bardziej wiarygodny i poprawny protokół laboratoryjny składający się z reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby ułatwić diagnostykę genów AmpC kodowanych przez plazmidy, które są odpowiedzialne za ekspresję β-laktamaz AmpC w różnych zakażeniach klinicznych.11

Większość badań koncentruje się na występowaniu enzymów ESBL w Gram-ujemnych izolatach klinicznych w Nepalu.12-16 Liczba badań dotyczących enzymów β-laktamaz AmpC u bakterii Gram-ujemnych w Nepalu jest ograniczona. Jedno z badań przeprowadzonych w dolinie Katmandu wykazało, że 27,8% izolatów Enterobacterales jest producentami AmpC β-laktamaz przy użyciu metody fenotypowej.17 Według naszej wiedzy, w Nepalu istnieje ograniczona liczba badań związanych z wykrywaniem i charakterystyką enzymów AmpC β-laktamaz u bakterii Gram-ujemnych przy użyciu zarówno metod fenotypowych, jak i genotypowych. Niezbędne jest wprowadzenie standardowych metod fenotypowych i genotypowych w zakresie badania wrażliwości na antybiotyki w celu wykrycia patogenów lekoopornych w szpitalach. Niniejsze badanie zostało podjęte w celu izolacji i identyfikacji genów β-laktamaz AmpC (blaCITM i blaDHAM) w izolatach bakterii Gram-ujemnych przy użyciu zarówno fenotypowych metod przesiewowych, jak i potwierdzających.

Metody

Projekt badania

Jest to szpitalne badanie przekrojowe przeprowadzone od czerwca 2017 r. do stycznia 2018 r. w Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). W sumie zebrano 1151 nieduplikowanych próbek klinicznych, które zostały przetworzone w okresie badania. Próbki obejmowały mocz (n=412), krew (n=206), końcówkę cewnika (n=163), ropę (n=132), stolec (n=89), płyn mózgowo-rdzeniowy (n=53), wymaz z rany (n=58) i wymaz z pochwy (n=38). Próbki były pobierane do sterylnego, dobrze oznakowanego i szczelnego pojemnika, a następnie przetwarzane tak szybko, jak to możliwe.18 Do badania włączono wszystkich odwiedzających pacjentów, u których podejrzewano infekcje bakteryjne i którzy wyrazili zgodę na udział w badaniu. Uczestnicy badania z niewystarczającymi informacjami demograficznymi zostali wykluczeni.

Hodowla próbek i identyfikacja izolatów

Próbki pobierano zgodnie ze standardowymi wytycznymi mikrobiologicznymi dotyczącymi pobierania moczu, stolca, rop, krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego i końcówki cewnika. Zakwalifikowane próbki posiewano następnie na agar z krwią (BA), agar czekoladowy (CA) i agar MacConkey’a (MA). Dodatkowo, próbki moczu posiewano na agar chromogenny UTI. Izolaty identyfikowano przy użyciu standardowych parametrów mikrobiologicznych, takich jak wygląd morfologiczny kolonii, reakcje barwienia i właściwości biochemiczne.19,20

Testy wrażliwości na antybiotyki

Wszystkie zidentyfikowane izolaty Gram-ujemne poddano następnie testowi wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe in vitro przy użyciu zmodyfikowanej metody dyfuzyjno-krążkowej Kirby-Bauera.21 Po pierwsze, inokulum sporządzano poprzez przeniesienie kolonii bakterii z agaru odżywczego do sterylnej soli fizjologicznej. Mętność inokulum ustalono jako równoważną standardowi 0,5 McFarlanda, zgodnie z wytycznymi CLSI. Hodowle dywanowe z badanych inokulów przygotowywano również na agarze Mullera-Hintona (MHA). Krążki z antybiotykami (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, Indie) stosowano w następujących proporcjach: amoksycylina (10 μg), azytromycyna (10 μg), amikacyna (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoksytyna (30 μg), ceftazydym (30 μg), ciprofloksacyna (5 μg), imipenem (10 μg), piperacylina/tazobaktam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), kotrimoksazol (25 μg) i cefepim (30 μg). Zaszczepioną płytkę inkubowano tlenowo w temperaturze 37°C do 18 godzin. Po wystarczającej inkubacji mierzono strefy zahamowania wzrostu (ZOI) wokół krążków, a wynik klasyfikowano jako wrażliwy, pośredni lub oporny.21 Izolaty wykazujące oporność na trzy lub więcej antybiotyków z różnych klas interpretowano jako wielolekooporne.22

Screening for AmpC β-Lactamases

Izolaty były najpierw przesiewane pod kątem możliwego wytwarzania AmpC β-laktamaz zgodnie z wytycznymi CLSI, 2019.23 Do badań przesiewowych w AST poddawano ceftazydym lub cefotaksym lub cefoksytynę lub ceftriakson, każdy po 30 µg, a organizmy oporne na te antybiotyki (wykazujące strefę zahamowania o średnicy ≤ 18 mm) przesiewano jako potencjalnych producentów AmpC i poddawano dalszym badaniom potwierdzającym.

Potwierdzenie dla AmpC β-laktamaz

Pozytywne wyniki badań przesiewowych dla producentów AmpC β-laktamaz potwierdzano testem krążkowym AmpC oraz testem potwierdzającym opartym na inhibitorach (test z kwasem boronowym).

W teście z kwasem boronowym hodowlę dywanową badanego drobnoustroju wykonywano na płytce MHA przyjmując 0,5 roztworu McFarlanda. Dwa krążki z cefoksytyną (30µg), z których jeden z dodatkiem kwasu fenyloborowego (400 µg) umieszczano na hodowli dywanowej na płytce MHA i inkubowano, a wyniki interpretowano. Jeśli nastąpiło zwiększenie strefy zahamowania o ≥5 mm, gdy oceniano pożądany krążek antybiotyku (ceftazydym lub cefotaksym) w połączeniu z kwasem fenyloborowym niż podczas oznaczenia bez połączenia (sam krążek antybiotyku), izolat oznaczano jako posiadający pozytywny test potwierdzenia.

W teście aproksymacji krążków, krążki umieszczano na hodowli dywanowej E. coli ATCC 25922. W centrum płytki umieszczono krążek z 30μg ceftazydymu, a następnie krążki z 10μg imipenemu, 30μg cefoksytyny i 20/10μg amoksycyliny/klawulanianu, które umieszczono w odległości 20mm od krążka z ceftazydymem. Kolonie badanych drobnoustrojów dodawano do krążka, a następnie płytkę odwracano i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w warunkach tlenowych. Jakiekolwiek wgłębienie lub spłaszczenie ZOI wskazywało na produkcję β-laktamazy AmpC przez izolaty.20,24

Preservation of AmpC β-Lactamase Positive Isolates

Do konserwacji zastosowano metodę przygotowania zapasu glicerolu. Organizmy konserwowano w Tryptic Soy Broth (TSB) zawierającym 40% glicerolu i przechowywano w temperaturze -20ºC.25

Ekstrakcja surowego plazmidowego DNA

Wyizolowaną kolonię badanego organizmu inokulowano w bulionie Luria Bertani (LB). Inokulum inkubowano tlenowo przy użyciu wytrząsarki z łaźnią wodną w temperaturze 37°C przez 18-24 godziny. Tak otrzymaną czystą kulturę poddawano metodzie alkalicznej w celu ekstrakcji plazmidowego DNA. Wyekstrahowany plazmidowy DNA był następnie zawieszany w buforze TE i przechowywany w temperaturze -20°C do czasu dalszych badań.26

Amplifikacja genów β-laktamaz AmpC (blaCITM i blaDHAM) metodą PCR

Geny β-laktamaz AmpC (blaCITM i blaDHAM) amplifikowano metodą PCR z użyciem plazmidowego preparatu DNA jako szablonu. Startery użyte dla genu blaCITM to CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) i CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) jako startery odpowiednio do przodu i do tyłu, natomiast startery dla genu blaDHAM to sekwencja forward DHAM for (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) i sekwencja reverse DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC -5ʹ).11 Objętość reakcji ustalono na 25µL poprzez dodanie 12,5µL 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estonia), po 0,5µL primerów forward i reverse oraz 4µL szablonu DNA i ddH2O 7,5µL. Zoptymalizowana amplifikacja PCR obu genów wynosiła 94ºC przez 3 minuty dla początkowej denaturacji; 35 cykli denaturacji w 94ºC przez 30 sekund; 25 cykli annealingu w 62ºC przez 30 sekund; 35 cykli przedłużenia w 72º przez 1 minutę; i końcowe przedłużenie w 72ºC przez 7 minut.11,27

Purification of DNA

Plazmidowe DNA oczyszczano metodą wytrącania etanolem. W tej metodzie, osad DNA płukano lodowatym 70% etanolem i pozostawiano do wyschnięcia na 10 minut, co ułatwiało odparowanie alkoholu. Osad DNA zawieszano w roztworze buforowym zawierającym Tris, EDTA i RNazy w celu wypłukania pozostałych zanieczyszczeń.

Detection of PCR Products by Gel Electrophoresis

Zmultiplikowane produkty były wizualizowane przy użyciu elektroforezy żelowej w 1,5% żelu agarozowym barwionym 0,1µL bromku etydyny. Po przygotowaniu żelu, do pierwszego dołka dodawano 2µL drabinki DNA 100bp jako marker, do kolejnego dołka dodawano 2µL kontroli ujemnej, do kolejnego 2µL kontroli dodatniej, a do pozostałych dołków 2µL produktów PCR. Na koniec, żel wizualizowano pod transiluminatorem UV.28

Kontrola jakości

Standardowa procedura aseptyczna została przyjęta dla procedur w tym badaniu. Wszystkie partie podłoży hodowlanych i odczynników chemicznych były przetwarzane z zastosowaniem technik aseptycznych zgodnie z wytycznymi CLSI. W AST kontrola jakości była utrzymywana poprzez użycie kontrolnych szczepów E. coli ATCC 25922. Podczas PCR kontrola jakości była zapewniona przez użycie izolatów Klebsiella niosących oba badane geny, podczas gdy kontrole ślepej próby lub negatywne były przygotowywane bez zastosowania kwasów nukleinowych. Wszystkie te kontrole były używane w każdej partii testu PCR.

Analiza statystyczna

Dane zostały wprowadzone i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 24.0. Zależności badano przy użyciu testów Chi-kwadrat przy 95% przedziale ufności (CI) wśród zmiennych demograficznych, takich jak płeć i wiek badanych.

Wyniki

Charakterystyka demograficzna i kliniczna badanych pacjentów

Wśród 1151 pacjentów 54,2% (624/1151) stanowili mężczyźni, a 45,8% (527/1151) kobiety. Spośród 253 przypadków wzrostu bakterii, 47,8% (121/253) pochodziło od mężczyzn, a 52,2% (132/253) od kobiet. Spośród wszystkich (253) wzrostów bakterii, 26,1% (66/253) pochodziło z próbek moczu, następnie z końcówek cewników (17,4%; 44/253), krwi (16,2%; 41/253), ropy (11,9%; 30/253) i wymazów z ran (10,7%; 27/253). W zależności od wieku pacjentów, największy wzrost patogenów bakteryjnych stwierdzono w grupie wiekowej 16-45 lat (39,5%; 100/253), następnie 46-60 lat (30,1%; 76/253), >60 lat (24,1%; 61/253) oraz 0-15 lat (6,3%; 16/253) (Tabela 1).

Table 1 Demographic and Clinical Character of Patients Attending at Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distribution of Bacterial Isolates in Clinical Specimens

Among a total of 1151 clinical samples, 22% (253/1151) wykazało wzrost na podłożach hodowlanych. Spośród 253 izolatów bakteryjnych, większość (89,3%; 226/253) stanowiły bakterie Gram-ujemne. Wśród wzrostu bakterii dominowały E. coli (28,5%; 72/253), a następnie Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), bakterie Gram-dodatnie (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253) i Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Rycina 1)

Rycina 1 Rozkład rodzajów bakterii w dodatnich w hodowli próbkach klinicznych (n=253).

Antibiotic Susceptibility Pattern of Isolated Gram-Negative Bacteria

Wśród 226 izolatów bakterii Gram-ujemnych, 66.8% (151/226) było opornych na cefoksytynę, następnie na ceftazydym (58,4%; 132/226), ciprofloksacynę (53,5%; 121/226) i cefepim (51.8%; 117/226), podczas gdy izolaty były najbardziej wrażliwe na meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%;155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacynę (61,1%;138/226), piperacylinę/tazobaktam (56,6%;128/226) i azytromycynę (53.1%; 120/226) (tab. 2).

Tabela 2 Antibiotic Susceptibility Pattern of Gram-Negative Bacterial Isolates (n=226)

Multidrug Resistance (MDR) Pattern in the Isolates

Z 226 izolatów, 46.9% (106/226) izolatów było MDR. Najwyższy odsetek MDR stwierdzono wśród E. coli (31,1%; 33/106), następnie P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) i K. oxytoca (4,7%; 5/106) (ryc. 2). W poszczególnych gatunkach najwyższy odsetek oporności wielolekowej stwierdzono wśród C. freundii (100%; 8/8), następnie odpowiednio P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) i E. coli (45,8% 33/72) (ryc. 2).

Rysunek 2 Rozmieszczenie bakterii MDR i ogólny % MDR oraz MDR w obrębie każdego gatunku.

Wykrywanie AmpC różnymi testami

Wśród 226 izolatów Gram-ujemnych 50% (113/226) wykazywało oporność na cefoksytynę. Izolaty wytwarzające β-laktamazy AmpC zostały potwierdzone dwoma różnymi testami potwierdzającymi: testem dyskowym i testem z kwasem boronowym. Spośród dziewięćdziesięciu jeden izolatów, 91,2% (83/91) wykazało pozytywny wynik w obu testach, a 8,8% (8/91) izolatów wykazało pozytywny wynik tylko w teście z kwasem boronowym, potwierdzony przez co najmniej jeden test i zostały uznane za producentów β-laktamazy AmpC.

Prevalence of blaCITM and blaDHAM Genes in AmpC β-Lactamase Producing Gram-Negative Isolates

W badaniu PCR, 90,1% (82/91) i 87,91% (80/91) izolatów wykazało wynik pozytywny dla blaCITM i blaDHAM. Odpowiednio, wykryto amplifikowane geny blaCITM i blaDHAM o wielkości amplikonu 465bp i 405bp (Ryc. 3 i 4).

Ryc. 3 Elektroforeza na żelu agarozowym (1,5%) używanym do rozdziału produktów PCR. Pasy 2, kontrola pozytywna; Pasy 3, 5, i 7 są CITM pozytywne; Pasy 4 i 6, CITM negatywne; i Pas 8. kontrola negatywna.

Rysunek 4 Elektroforeza na żelu agarozowym (1,5%) stosowana do rozdzielania produktów PCR. Pas 2, kontrola pozytywna; Pasy 3, 4, 6 i 7 są pozytywne dla Dham; Pas 5, negatywne dla Dham; i Pas 8, kontrola negatywna.

Distribution of AmpC β-Lactamase, blaCITM and blaDHAM Genes Among Gram-Negative Isolates and Their Relation to Gender, Age, Clinical Specimens and Clinical Isolates

Z 91 producentów AmpC, 50,6% (46/91) izolatów pochodziło od kobiet, a 49,4% (45/91) od mężczyzn. Podobnie, jednakowy odsetek (50%; 41/82) genów blaCITM uzyskano od osobników obu płci, podczas gdy 51,3% (41/80) i 48,7% (39/80) genów blaDHAM wykryto w próbkach uzyskanych odpowiednio od pacjentów płci męskiej i żeńskiej. Nie stwierdzono istotnego związku płci pacjenta z produkcją enzymów AmpC i genów AmpC (tab. 3).

Table 3 Distribution of AmpC β-Lactamase, CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Bacterial Isolates and Their Relation to Gender, Age and Clinical Specimens

Najwięcej producentów β-laktamazy AmpC (40.7%; 37/91) oraz częstość występowania izolatów wytwarzających blaCITM (40,2%; 33/82) i blaDHAM (41,2%; 33/80) uzyskano w grupie wiekowej (46-60) lat, a następnie (16-45) lat (odpowiednio 30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) i 31,3%; 25/80). Stwierdzono istotny związek pomiędzy produkcją enzymu β-laktamazy AmpC a grupą wiekową (p=0,01), podczas gdy inne czynniki, w tym nabycie genów blaCITM i blaDHAM, nie miały istotnego związku z wiekiem pacjentów (tab. 3).

Wśród materiałów klinicznych najwięcej izolatów wytwarzających β-laktamazy AmpC (20,9%; 19/91) wykryto z krwi i końcówek cewników, następnie z moczu (18,7%; 17/91), ropy (13,3%; 12/91) i wymazów z ran (9,9%; 9/91). Podobnie, najwięcej izolatów wytwarzających blaCITM i blaDHAM wykryto z końcówek cewników (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), a następnie odpowiednio z krwi (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) moczu (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) i rop (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80). Nie stwierdzono istotnego związku między materiałem klinicznym, produkcją β-laktamaz AmpC a genami: blaCITM i blaDHAM (tab. 3).

Distribution of AmpC β-Lactamases and Acquisition of blaCITM and blaDHAM Genes in Various Gram-Negative Bacteria

Najwyższą częstość występowania enzymów β-laktamaz AmpC stwierdzono u E. coli (28,6%; 26/91), następnie P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) i K. pneumoniae (10,9%; 10/91). Najwyższą częstość występowania genów blaCITM i blaDHAM wykryto u E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80), a następnie odpowiednio u P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80) A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) i K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80) (tab. 3).

Dyskusja

Rosnąca częstość występowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe pozostaje jednym z głównych problemów zdrowia publicznego w krajach rozwijających się, takich jak Nepal29, co prowadzi do wydłużenia pobytu w szpitalu, zwiększenia kosztów leczenia, ograniczenia opcji terapeutycznych oraz zwiększenia zachorowalności i śmiertelności.29,30 Produkcja β-laktamaz jest głównym mechanizmem obronnym przeciwko antybiotykom β-laktamowym. Badanie to zostało przeprowadzone w celu zbadania obecności β-laktamaz klasy C (AmpC) w organizmach Gram-ujemnych pochodzących z próbek klinicznych uzyskanych w ANIAS, Kathmandu, Nepal. W badaniu tym oceniono również częstość występowania genów β-laktamaz AmpC (blaCITM i blaDHAM) metodą PCR. Stwierdziliśmy wysoką częstość występowania tych enzymów i genów, chociaż częstość występowania tych enzymów różniła się w zależności od regionu geograficznego, wewnątrz i między krajami.

Z 1151 próbek klinicznych, tylko 253 (21,9%) wykazało znaczący wzrost organizmów. Z całkowitej liczby (253) wzrost bakterii, ponad dziewięćdziesiąt procent stanowiły bakterie Gram-ujemne, E. coli była najbardziej dominującym izolatem wśród nich. Nasze wyniki są zgodne z wynikami poprzednich badań przeprowadzonych w Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, Indie,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Etiopia,38 i Mexico City, Meksyk.39 Nieco wyższy odsetek zakażeń bakteriami Gram-ujemnymi obserwowano wśród pacjentek i może to być spowodowane częstszym występowaniem zakażeń układu moczowego u kobiet. Jest to zgodne z wynikami wcześniejszych badań przeprowadzonych w Model Hospital, Katmandu,17 i Andra-Pradesh, Indie.40 Podobnie jak w niniejszym badaniu, w jednym z badań przeprowadzonych w stanie Uttar Pradesh w Indiach odnotowano wyższy odsetek zakażeń ropnych w przypadkach pooperacyjnych u kobiet (63,33%) niż u mężczyzn (43,75%).41

W tym badaniu izolaty bakterii Gram-ujemnych wykazywały wyższą oporność na następujące antybiotyki: cefoksytynę, ceftazydym, ciprofloksacynę i cefepim, a następnie kotrimoksazol, podczas gdy meropenem, imipenem, piperacylina-tazobaktam i azytromycyna zostały zgłoszone jako najbardziej wrażliwe antybiotyki. Porównywalny wzór zaobserwowano w niektórych wcześniejszych wynikach z Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoksytyna i ceftazydym z niskimi wskaźnikami wrażliwości są lekami pierwszego wyboru, które są łatwo hydrolizowane przez enzymy bakteryjne i są mniej przydatne w leczeniu infekcji wywołanych przez patogeny Gram-ujemne. Podobnie jak w naszym badaniu, imipenem/meropenem były najbardziej wrażliwymi lekami w poprzednich badaniach z Model Hospital, Kathmandu,17 Madryt Hiszpania,44 i Wisconsin, USA.45

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) z rosnącym rozprzestrzenianiem się MDR jest problemem globalnym, a jej wpływ jest większy w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie obciążenie chorobami zakaźnymi jest wysokie.30 Leczenie drobnoustrojów MDR jest kosztowne i trudne, a dodatkowo potęguje je wysoka częstość występowania zakażeń szpitalnych.46 W niniejszym badaniu prawie połowa izolowanych bakterii Gram-ujemnych (46,9%; 106/226) okazała się być MDR. Wyższą częstość występowania bakterii MDR odnotowano w kilku innych badaniach przeprowadzonych w Katmandu46-49 i innych dystryktach Nepalu.15,50,51 Produkcja ESBL, metalo β-laktamazy (MBL) lub β-laktamazy AmpC może być przyczyną zmniejszonej wrażliwości na antybiotyki nowszej generacji.52 Ponadto oporność wielolekowa występuje z powodu agregacji i ekspresji różnych genów na opornych (R) plazmidach lub genów kodujących pompy effluksu wielolekowego.53 Ponadto geny odpowiedzialne za ekspresję enzymów β-laktamazowych są stale związane z antybiotykami nieβ-laktamowymi, takimi jak aminoglikozydy i fluorochinolony.

W niniejszym badaniu wytwarzanie AmpC było wyższe wśród pacjentów płci męskiej (41,67%) niż żeńskiej (38,98%). Wyniki tego badania są zgodne z wynikami innych badań przeprowadzonych w Kano, w północno-zachodniej Nigerii.54 Jednakże nasze wyniki różniły się od wyników badań przeprowadzonych w Benin, w Nigerii.55 Wyższa częstość występowania UTI z opornością wielolekową wśród kobiet została opisana w wielu badaniach, co może być spowodowane wyższą częstością występowania patogenów wytwarzających AmpC wśród kobiet, ponieważ są one bardziej podatne na UTI niż mężczyźni.

Używanie oporności na cefoksytynę w laboratoriach diagnostycznych służy jako wiarygodny czynnik przesiewowy/marker do wykrywania wytwarzania AmpC. Co więcej, marker ten zapewnia dobrą negatywną wartość predykcyjną.

Mimo szerokiego zakresu badań, niektóre z nich podkreślały użycie cefoksytyny jako słabego czynnika przesiewowego dla produkcji AmpC. Może to wynikać z istnienia alternatywnych mechanizmów innych niż AmpC (jednym z nich jest mutacja kanału porinowego), które mogą prowadzić do fałszywie pozytywnej interpretacji (jako oporność na cefoksytynę).52 Nasze badanie wykazało, że jedna trzecia izolatów Gram-ujemnych (>40%) była odpowiedzialna za wytwarzanie AmpC. Wyniki tego badania kontrastowały z wynikami badania przeprowadzonego w Model Hospital, Kathmandu.17 Różnica może wynikać z zastosowanej w tym badaniu metody detekcji fenotypowej, w której wykorzystano test oporności na cefoksytynę oraz metodę testu dyskowego AmpC z użyciem cefoksytyny (30µg). Testem potwierdzającym był test z kwasem fenyloboronowym z użyciem cefoksytyny 30µg/400µg kwasu fenyloboronowego. Pochodne kwasu boronowego okazały się odwracalnymi inhibitorami enzymów β-laktamaz AmpC.56

W badaniach własnych produkcję AmpC zaobserwowano u 91 (80,53%) izolatów spośród 113. Wskaźnik produkcji AmpC w naszym badaniu jest nieco wyższy niż w innych badaniach przeprowadzonych w Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 i Indiach.59

W celu skompensowania ograniczeń wynikających z jednej z metod, integracja obu technik w rutynowej diagnostyce może zwiększyć czułość i specyficzność testów w warunkach klinicznych.

W sumie 73 izolaty Gram-ujemne wykazywały obecność obu genów blaCITM i blaDHAM. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniejszego badania przeprowadzonego w Ilam w Iranie.27 W podobnym badaniu przeprowadzonym w Indiach wykazano, że geny blaCITM występowały częściej u E. coli.60 W naszym badaniu częstość występowania genów związanych z AmpC (blaCITM i blaDHAM) była badana metodami fenotypowymi i genotypowymi. Badanie to dostarcza szerokiej analizy bakterii Gram-ujemnych związanych z wytwarzaniem β- laktamazy AmpC i ich wrażliwości na antybiotyki wśród izolatów klinicznych. Wyniki tego badania mają istotne znaczenie w informowaniu o wzorcach oporności różnych organizmów na cefalosporyny. Nadzór nad opornością wielolekową z wytwarzaniem β-laktamaz, w tym ESBL, MBL i AmpC, jest potrzebny w rutynowej praktyce klinicznej w celu optymalizacji leczenia i zapobiegania dalszej oporności na antybiotyki β-laktamowe.13,61,62

Mocne strony i ograniczenia

To jest pierwsze badanie badające geny β-laktamazy AmpC (blaCITM i blaDHAM) przy użyciu zarówno testu fenotypowego jak i molekularnego wśród pacjentów uczęszczających do trzeciorzędowego ośrodka opieki zdrowotnej w Nepalu. Wyniki tego badania mogą wpłynąć na politykę przeciwdrobnoustrojową ośrodków opieki zdrowotnej, w tym na przygotowanie postępowania w zakażeniach szpitalnych, protokołu leczenia i procedury diagnostycznej. Istnieje kilka ograniczeń tego badania, które obejmują badanie ograniczonej liczby β-laktamaz AmpC, krótki czas trwania badania i przeprowadzenie go w jednym ośrodku opieki medycznej. Przyszłe badania mogą opierać się na tym badaniu i prowadzić badania podłużne w wielu ośrodkach opieki medycznej z badaniem wszystkich β- laktamaz, takich jak ESBL, MBL, KPC i głównych genów odpowiedzialnych za oporność. Niemniej jednak, jako pierwsze badanie tego typu triangulujące metody fenotypowe i molekularne, badanie to będzie cennym punktem odniesienia dla przyszłych badań nad β-laktamazami AmpC i występowaniem genów blaCITM i blaDHAM w innych środowiskach/szpitalach Nepalu.

Wnioski

Nasze wyniki wskazują, że zmniejszona wrażliwość na cefoksytynę w izolatach Gram-ujemnych jest związana z obecnością plazmidowych genów AmpC. Ze względu na brak jednej ostatecznej metody, sugeruje się jednoczesne wykorzystanie kilku metod detekcji fenotypowej w celu precyzyjnego wykrywania bakterii wytwarzających β-laktamazę AmpC. W niniejszym badaniu metodą PCR wykryto prawie 90% genów β-laktamazy AmpC (blaCITM i blaDHAM) wśród fenotypowo potwierdzonych izolatów. Wysoka częstość występowania genów oporności i MDR wśród izolatów bakterii Gram-ujemnych jest sygnałem alarmującym, wymagającym podjęcia pilnych działań interwencyjnych w celu zahamowania wzrostu i rozprzestrzeniania się tych izolatów.

.