ISH: protokół hybrydyzacji in situ

Przechowywanie próbek

Konserwacja RNA
Konserwacja RNA jest utrudniona z powodu obecności enzymu RNazy. Enzym ten znajduje się na naczyniach szklanych, w odczynnikach oraz na operatorach i ich odzieży. RNaza szybko niszczy każdy RNA w komórce lub samą sondę RNA, więc użytkownicy muszą upewnić się, że używają sterylnych technik, rękawiczek i roztworów, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą sondy lub tkankowego RNA.

Ogólne przechowywanie próbek podczas używania zamrożonych przekrojów
Aby uzyskać najlepsze wyniki na starszych szkiełkach, nie należy przechowywać szkiełek na sucho w temperaturze pokojowej. Zamiast tego, należy je przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20°C lub w plastikowym pudełku przykrytym folią saran w temperaturze -20°C lub -80°C. Takie przechowywanie zachowuje szkiełka przez kilka lat.

Wybór sondy

Sondy RNA

Sondy RNA powinny mieć długość 250-1,500 zasad; sondy o długości około 800 zasad wykazują najwyższą czułość i specyficzność. Szablony transkrypcyjne powinny umożliwiać transkrypcję zarówno RNA sondy (nić antysensu), jak i RNA kontroli negatywnej (nić sensu). Klonować do wektora z przeciwstawnymi promotorami, aby to osiągnąć. Szablony kołowe muszą być zlinearyzowane przed wykonaniem sondy, chociaż można również użyć szablonów PCR.

Sondy DNA

Sondy DNA zapewniają wysoką czułość hybrydyzacji in situ. Nie hybrydyzują one tak silnie do docelowych cząsteczek mRNA w porównaniu z sondami RNA, dlatego formaldehyd nie powinien być stosowany w popłuczynach po hybrydyzacji.

Swoistość sond jest ważna. Jeśli znana jest dokładna sekwencja nukleotydów mRNA lub DNA w komórce, można zaprojektować precyzyjną sondę komplementarną. Jeśli >5% par zasad nie jest komplementarnych, sonda będzie tylko luźno hybrydyzować do sekwencji docelowej. Oznacza to, że sonda jest bardziej prawdopodobne, aby zostać zmyte podczas mycia i etapów wykrywania i może nie być prawidłowo wykryte.

Protokół hybrydyzacji in situ sond RNA znakowanych Digoksigeniną (DIG)

Protokół ten opisuje użycie jednoniciowych sond RNA znakowanych DIG do wykrywania ekspresji interesującego genu w wycinkach zatopionych w parafinie.

1) Deparafinacja

W przypadku wycinków mrożonych, rozpocząć od kroku 2. Jeśli używane są skrawki utrwalone formaldehydem w parafinie, należy kontynuować od tego kroku.

Przed przystąpieniem do pracy należy zdeparafinować preparaty i ponownie uwodnić. Niekompletne usunięcie parafiny może spowodować słabe wybarwienie wycinka.

Umieścić szkiełka w stojaku i wykonać następujące płukania:

• ksylen: 2×3 min
• ksylen 1:1 ze 100% etanolem: 3 min
• 100% etanol: 2×3 min
• 95% etanol: 3 min
• 70 % etanol: 3 min
• 50 % etanol: 3 min
• Opłukać zimną wodą z kranu

Przechowywać szkiełka w wodzie z kranu aż do pobrania antygenu. Od tego momentu szkiełka nie mogą wyschnąć, ponieważ spowoduje to niespecyficzne wiązanie przeciwciał i wysokie wybarwienie tła.

2) Odzyskanie antygenu

Trawić za pomocą 20 µg/mL proteinazy K we wstępnie ogrzanym 50 mM Tris przez 10-20 min w temperaturze 37°C. Czas inkubacji i stężenie proteinazy K mogą wymagać optymalizacji.

Zalecamy przeprowadzenie eksperymentu miareczkowania proteinazą K w celu określenia optymalnych warunków. Niedostateczne trawienie zmniejszy sygnał hybrydyzacji, a nadmierne trawienie spowoduje słabą morfologię tkanki, co bardzo utrudni lokalizację sygnału hybrydyzacji. Optymalne stężenie proteinazy K będzie się różnić w zależności od rodzaju tkanki, długości utrwalania i wielkości tkanki.

3) Przepłukać szkiełka 5x w wodzie destylowanej.
4) Zanurzyć szkiełka w lodowato zimnym 20% (v/v) kwasie octowym na 20 sekund. Permeabilizuje to komórki, aby umożliwić dostęp do sondy i przeciwciała.
5) Odwodnić szkiełka przez płukanie przez około 1 minutę na płukanie w 70% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu, a następnie wysuszyć na powietrzu.
6) Dodać 100 µL roztworu hybrydyzacyjnego do każdego szkiełka.

Roztwór soli (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7,5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Roztwór Denhardta (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (poliwinylopirolidyna)
• 10 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA)

.

• 500 mL sterylnej dH2O

7) Inkubować szkiełka przez 1 h w nawilżonej komorze hybrydyzacyjnej w pożądanej temperaturze hybrydyzacji. Typowe temperatury hybrydyzacji mieszczą się w zakresie 55-62°C.
8) Rozcieńczyć sondy w roztworze hybrydyzacyjnym w probówkach PCR. Ogrzewać w temperaturze 95°C przez 2 minuty w bloku PCR w celu denaturacji sondy RNA lub DNA. Natychmiast schłodzić na lodzie, aby zapobiec ponownemu wyżarzaniu.
9) Odsączyć roztwór do hybrydyzacji. Dodać 50-100 μL rozcieńczonej sondy na sekcję, pokrywając całą próbkę. Inkubować w nawilżanej komorze hybrydyzacyjnej w temperaturze 65°C przez noc. Przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec parowaniu.

Podczas tego etapu sonda RNA będzie hybrydyzować do odpowiedniego mRNA, lub sonda DNA będzie hybrydyzować do odpowiedniego komórkowego DNA. Zoptymalizuj temperaturę hybrydyzacji w zależności od sekwencji użytej sondy, jak również od typu komórki lub tkanki. Temperatura ta powinna być zoptymalizowana dla każdego analizowanego typu tkanki.

Optymalna temperatura hybrydyzacji dla sond zależy od procentowej zawartości zasad obecnych w sekwencji docelowej. Stężenie cytozyny i guaniny w sekwencji są ważnymi czynnikami.

10) Stringency washes

Parametrami roztworu takimi jak temperatura, stężenie soli i detergentu można manipulować w celu usunięcia niespecyficznych interakcji.

Aby przygotować 1 L 20x soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC)

• 175.3 g NaCl (3 M)
• 88.2 g cytrynianu sodu
• 800 mL sterylnej dH2O
• Doprowadzić do pH 5 przy użyciu kwasu cytrynowego, napełnić do 1 L i autoklawować

Prać 1

• 50% formamid w 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Wash away excess probe and hybridization buffer with higher temperatures (up to 65°C) for short periods of time. Zbyt długie pozostawienie może spowodować zmycie zbyt dużej ilości zhybrydyzowanej sondy RNA/DNA.

Wash 2

• 0.1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75°C

Ten etap usuwa niespecyficzną i/lub powtarzalną hybrydyzację DNA/RNA.

Postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami, aby zoptymalizować temperaturę i stężenie soli dla płukań typu stringency:

• Dla bardzo krótkich sond DNA/RNA (0.5-3 kb) lub bardzo złożonych sond, temperatura płukania powinna być niższa (do 45°C), a czułość niższa (1-2x SSC).
• Dla sond jednoogniskowych lub dużych, temperatura powinna wynosić około 65°C, a czułość wysoka (poniżej 0.5x SSC).
• Temperatura i restrykcyjność powinny być najwyższe dla sond powtarzalnych (takich jak powtórzenia alfa-satelitarne).

11) Przepłukać dwukrotnie w MABT (bufor kwasu maleinowego zawierający Tween 20) przez 30 min w temperaturze pokojowej. MABT jest łagodniejszy niż PBS i jest bardziej odpowiedni do wykrywania kwasów nukleinowych.

Aby przygotować 5x MABT stock

• 58 g kwasu maleinowego
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 mL wody

Przywrócić pH do 7,5 przez dodanie zasady Tris. Potrzebne będzie około 100 g. Doprowadzić objętość końcową do 1 L.

12) Wysuszyć szkiełka mikroskopowe.
13) Przenieść do nawilżonej komory i dodać 200 µL buforu blokującego do każdej sekcji (MABT + 2% BSA, mleko lub surowica). Blokować przez 1-2 h w temperaturze pokojowej.
14) Odsączyć bufor blokujący. Dodać przeciwciało anty znakujące w wymaganym rozcieńczeniu w buforze blokującym. Sprawdzić arkusz danych przeciwciała, aby uzyskać zalecane stężenie/rozcieńczenie. Inkubować przez 1-2 h w temperaturze pokojowej.
15) Przemyć szkiełka 5×10 min z MABT w temperaturze pokojowej.
16) Przemyć szkiełka 2×10 min każde w temperaturze pokojowej z buforem do wstępnego barwienia (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) W przypadku wykrywania fluorescencji, przejść do etapu 18. W przypadku innych form detekcji, szkiełka należy umieścić z powrotem w komorze nawilżonej i postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu wywołania koloru.

18) Opłukać szkiełka w wodzie destylowanej.
19) Suszyć szkiełka na powietrzu przez 30 min. Przemyć w 100% etanolu i dokładnie wysuszyć na powietrzu.
20) Zamontować używając roztworu montażowego DePeX.

.