Inżynieria rybosomów ujawnia znaczenie autonomii 5S rRNA dla montażu rybosomów

Budowa plazmidów

Wszystkie plazmidy zostały skonstruowane metodą montażu Gibsona50, przy czym szkielet plazmidu przygotowano metodą odwróconej PCR lub trawienia nukleazą restrykcyjną, a inserty wygenerowano metodą PCR lub zsyntetyzowano chemicznie w Integrated DNA Technologies. Plazmidy kodujące rRNA były wstępnie elektroporowane do komórek E. coli POP2136 (genotypy wszystkich szczepów użytych w tym badaniu są wymienione w Tabeli Dodatkowej 1), a transformanty były odzyskiwane na płytkach LB uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami; płytki były inkubowane w temperaturze 30 °C, aby zapobiec ekspresji genów rRNA kontrolowanej przez promotor lambda PL31. Wszystkie inne plazmidy były transformowane i namnażane w szczepie E. coli JM109 i hodowane w temperaturze 37 °C w podłożu LB uzupełnionym w razie potrzeby 100 μg/ml ampicyliny (Amp), 50 μg/ml kanamycyny (Kan) lub 50 μg/ml spektynomycyny (Spc).

Konstrukcja plazmidu ptRNA100

Szkielet plazmidu, w tym początek replikacji pA15 i gen oporności na Spc, amplifikowano metodą PCR z plazmidu ptRNA6751 przy użyciu starterów NA1 i NA2 (wszystkie startery wymieniono w Tabeli Dodatkowej 4). Klaster genów tRNA (kodujący tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp i tRNAAsp), pod kontrolą promotora Ptac i terminatora T1, został zsyntetyzowany jako gBlock (Integrated DNA Technology). Plazmid pTRNA100 został wytworzony metodą Gibsona. Strukturę plazmidu zweryfikowano trawieniem restrykcyjnym, a obecność urodzonego w plazmidzie klastra tRNA potwierdzono amplifikacją PCR z użyciem starterów NA3 i NA4 oraz sekwencjonowaniem.

Konstrukcja plazmidów pDH42, pDH39 i pCH84

Konstrukty niosące hybrydowy gen 23S-cp5S rRNA zostały wygenerowane na podstawie plazmidu pAM55229, który zawiera operon rrnB rRNA E. coli. Gen 5S rRNA został usunięty metodą odwróconej PCR przy użyciu starterów NA17 i NA18, które zawierają miejsce restrykcyjne Xho1, trawienie produktu PCR przez Xho1 i ligację DNA. Następnie do genu 23S rRNA wprowadzono mutację oporności na Ery – A2058G metodą mutagenezy ukierunkowanej miejscowo przy użyciu zestawu QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenesis (Agilent Technologies) ze starterem NA7. Otrzymany plazmid, pAM552Δ5S został użyty do wprowadzenia genów cp5S rRNA z linkerami w trzech różnych miejscach w obrębie genu 23S rRNA.

Przygotowanie sekwencji cp5S rDNA do integracji z 23S rDNA przeprowadzono w pojedynczej reakcji PCR, w której pary primerów NA8/NA9 (dla konstruktów DH39 i DH42) lub NA26 i NA27 (dla konstruktu CH84) (każda po 100 nM), które zawierały wstawkę cp5S rDNA, zostały połączone z parami primerów (250 nM każdy) wprowadzającymi losowe łączniki sekwencji, o wielkości od 0 do 3 nt, w „lewym” i „prawym” złączu 23S-cp5S, jak następuje: NA10-NA13 i NA14-NA17 dla DH39; NA18-NA21 i NA22-NA25 dla DH42; NA28-NA31 i NA32-NA35 dla CH84.

Do generacji bibliotek plazmidowych DH39, DH42, i CH84, plazmid pAM552Δ5S został otwarty przez odwróconą PCR przy użyciu par primerów NA36/NA37, NA38/NA39, i NA40/NA41, odpowiednio. Inserty cp5S rDNA wprowadzano do powstałych w wyniku amplifikacji PCR szkieletów plazmidowych za pomocą reakcji montażu Gibsona. Produkty reakcji transformowano do komórek E. coli POP2136 metodą elektroporacji, a transformanty odzyskiwano na płytkach agarowych LB/Amp hodowanych w temperaturze 30 °C (warunki zapobiegające ekspresji rRNA przenoszonego przez plazmid). Każda biblioteka miała co najmniej 3-krotnie więcej klonów niż szacowana teoretyczna różnorodność 7225 wariantów. Kolonie wymywano z płytek LB, biblioteki plazmidowe ekstrahowano i przechowywano.

Replacement of ptRNA67 with ptRNA100

The E. coli SQ171, który nie posiada chromosomalnych alleli rRNA i przenosi plazmid pCSacB jako źródło genów rRNA oraz plazmid ptRNA67 jako źródło brakujących chromosomalnych genów tRNA32,52, został użyty jako wyjściowy szczep gospodarza. W celu zastąpienia plazmidu ptRNA67 przez ptRNA100, komórki SQ171 transformowano najpierw ptRNA-Amp (dostarczonym przez Michaela O’Connora, University of Missouri, Kansas City), który przypomina ptRNA67, ale nadaje odporność na Amp i zawiera początek replikacji pBR322. Transformanty były następnie oczyszczane z plazmidu ptRNA67 przez pasażowanie w pożywce LB uzupełnionej Amp i Kan przez ~100 pokoleń. Utrata plazmidu ptRNA67 została zweryfikowana przez wrażliwość klonów na Spc podczas replikacji. Otrzymany szczep transformowano następnie ptRNA100 i posiewano na agar LB uzupełniony Spc i Kan. Transformanty były pasażowane przez ~100 pokoleń w podłożu LB uzupełnionym Spc i Kan. Utrata plazmidu ptRNA-Amp została zweryfikowana przez wrażliwość poszczególnych klonów na Amp, ujawnioną przez replikację płytek. Obecność ptRNA100 i brak ptRNA67 zostały dodatkowo zweryfikowane przez PCR i trawienie restrykcyjne całkowitych plazmidów przygotowanych z powstałego klonu.

Inaktywacja genu recA w komórkach SQ171/ptRNA100

Gen recA w szczepie SQ171/ptRNA100 został inaktywowany przez transdukcję fagiem P1. Szczep dawcy BW25113 recA::cat został najpierw przygotowany za pomocą konwencjonalnej procedury rekombinacji52 z użyciem kasety oporności na chloramfenikol (Chl) z plazmidu pKD352. Kasetę amplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów NA42 i NA43. Fragment PCR transformowano do szczepu BW25113 niosącego plazmid pDK46 z rekombinazą Red. Po sprawdzeniu integracji kasety z kotem i utwardzeniu pKD46, komórki BW25113 recA::cat wykorzystano jako donory do transdukcji fagowej. Transdukcję fagów P1 przeprowadzono zgodnie ze standardowym protokołem53 z tą różnicą, że inkubację regeneracyjną przedłużono z 1 do 3 h przed posiewem transduktantów na płytki LB/agar uzupełnione Kan, Spc i 15 μg/ml Chl. W celu eliminacji kasety z genem kota, otrzymany szczep transformowano plazmidem pZFLP-TetR kodującym enzym flippazę, a transformanty umieszczano na płytkach LB/agar z dodatkiem Kan, Spc i 2,5 μg/ml tetracykliny (Tet). Eliminację genu kota potwierdzono metodą PCR oraz na podstawie wrażliwości klonów na Chl. Następnie, plazmid pZFLP-TetR został utwardzony poprzez pasażowanie komórek przez ~100 pokoleń w podłożu LB uzupełnionym Kan, Spc, a powstałe klony przetestowano pod kątem wrażliwości na Tet. Powstały szczep nazwano SQA18 (Tabela uzupełniająca 1).

Introdukcja bibliotek 23S-cp5S do komórek SQA18

Biblioteki plazmidowe wyekstrahowane z komórek POP2136 transformowano do komórek SQA18 metodą elektroporacji. Po 2 h regeneracji w temperaturze 37 °C, transformanty umieszczano na płytkach agarowych LB/Amp, które następnie inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C. Kolonie wypłukiwano z płytek agarowych i 0,01 A600 (~106 komórek) umieszczano w objętości 2 ml podłoża LB uzupełnionego 150 μg/mL Ery i 0,25% sacharozy. Po wzroście przez 16 h, komórki umieszczano na płytkach agarowych zawierających Amp, 1 mg/ml Ery i 5% sacharozy. Płytki inkubowano przez 48 h w temp. 37 °C. Żywe kolonie pojawiły się z bibliotekami DH42 i CH84, ale nie z biblioteką DH39. Kilka z kolonii, które pojawiły się na płytkach zostało przebadanych metodą PCR na obecność 23S-cp5S rDNA przy użyciu par primerów NA44/NA45 dla konstrukcji DH42 i primerów NA46/NA47 dla konstrukcji CH84. Nieobecność genu wt 5S rRNA została zweryfikowana przez PCR kolonii przy użyciu starterów NA48 i NA49.

Wybór preferowanych łączników 23S-cp5S rRNA

Całkowita biblioteka plazmidowa DH42 wyizolowana z komórek POP2136 została transformowana do komórek SQA18 i posiana na płytkach LB/Amp jak opisano powyżej. Kolonie (~50,000) zostały wypłukane z płytki, a całkowity plazmid został wyekstrahowany z ~109 komórek i użyty jako biblioteka wstępnej selekcji.

Około 109 komórek zostało następnie poddanych procedurze wymiany plazmidu. W szczególności, umieszczano je w objętości 20 ml pożywki LB uzupełnionej 150 μg/mL Ery i 0,25% sacharozy. Po wzroście przez 4 h komórki umieszczano na płytkach agarowych zawierających Amp, 1 mg/ml Ery i 5% sacharozy. Płytki inkubowano przez 48 h w temperaturze 37 °C. Kolonie (~50,000) zostały wypłukane z płytki. Wyekstrahowany całkowity plazmid z tych komórek stanowił bibliotekę po-selekcyjną.

Cp5S rDNA flankowany sekwencjami 23S rDNA i linkerami został amplifikowany PCR z preparatów plazmidowych bibliotek przed-selekcyjnych i po-selekcyjnych przy użyciu starterów NA50 i NA51. Biblioteki PCR poddano sekwencjonowaniu następnej generacji.

Fold-enrichment factor dla każdej kombinacji linkerów obliczono stosując następującą procedurę. Po przycięciu adaptera, cała sekwencja cp5S rRNA, z wyjątkiem końcowych 4 nukleotydów na każdym końcu, została wyeliminowana w celu zmniejszenia liczby fałszywych wariantów sekwencji, które pojawiły się z powodu błędów sekwencjonowania w obrębie sekwencji kodującej 5S. Powstałe motywy sekwencyjne zliczono w bibliotekach przed i po selekcji oraz obliczono częstość frakcji każdego wariantu linkera.

Przygotowanie całkowitego komórkowego RNA

Nocne hodowle szczepów E. coli POP2136 lub SQA18 hodowano odpowiednio w temperaturze 30 °C lub 37 °C w podłożu LB/Amp. Hodowle rozcieńczano w stosunku 1:100 do 2 ml świeżej pożywki i hodowano w temperaturze 37 °C do A600 ~ 0,5. Komórki zbierano przez odwirowanie (5000 × g, 1 min) i ponownie zawieszano w 100 μl buforu lizującego. Po kolejnym dodaniu 400 μl buforu ekstrakcyjnego (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) i inkubacji przez 5 min w temperaturze pokojowej, całkowite RNA ekstrahowano metodą ekstrakcji fenol/chloroform. RNA wytrącano etanolem, osad RNA przemywano 1 ml 70% etanolu, rozpuszczano w wodzie wolnej od RNazy, zamrażano migawkowo i przechowywano w temperaturze -80 °C.

Analiza gradientu sacharozowego rybosomów i polisomów

Nocne hodowle E. coli rozcieńczano w 50 ml podłoża LB/Amp i hodowano do A600 ~ 0,5. Chl dodawano do końcowego stężenia 125 μg/ml, a po 5 min inkubacji komórki zbierano przez wirowanie (5000 × g, 10 min, 4 °C). Osad komórkowy zawieszano ponownie w zimnym buforze lizującym (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lizozymu, 0,25% dezoksycholanu sodu i 2U RQ1 RNase-free DNase I). Komórki były lizowane przez trzy cykle zamrażania-rozmrażania. Lizaty klarowano przez odwirowanie (20,000 × g, 15 min, 4 °C) i 20 jednostek A260 lizatu ładowano na 12 mL 10-40% liniowego gradientu sacharozy w buforze 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-merkaptoetanolu. Gradienty odwirowywano (3 h, 4 °C) przy 39,000 rpm w rotorze SW41 (Beckman). Gradienty frakcjonowano przy użyciu frakcjonatora (BioComp), rejestrując absorbancję przy 254 nm. Frakcje odpowiadające podjednostkom 50S, rybosomom 70S i polisomom były łączone razem. RNA wyizolowano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem.

Isolacja rybosomów 70S i podjednostek rybosomalnych

Do izolacji rybosomów tight-couple54, nocne hodowle E. coli rozcieńczono w 1 L pożywki LB/Amp i hodowano do A600 ~ 0,5. Komórki zbierano przez odwirowanie (5,000 g, 15 min, 4 °C), ponownie zawieszano w buforze A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-merkaptoetanol, 10 U/ml RQ1 RNase-free DNase I) i lizowano przy użyciu prasy francuskiej pod ciśnieniem 10,000 psi. Lizaty klarowano przez wirowanie w wirniku JA25-50 (Beckman) przy 13 000 rpm przez 30 min w 4 °C, a supernatanty ładowano na 10 ml 1,1 M poduszkę sacharozy przygotowaną w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 i 6 mM β-merkaptoetanolu, w 35 ml probówkach wirówkowych Quick-Seal (Beckman). Rybosomy były granulowane przez wirowanie przez 16 h przy 36,000 rpm (4 °C) w rotorze Ti70 (Beckman). Osad rybosomów zawieszano ponownie w buforze B (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl i 6 mM β-merkaptoetanolu) i 100 jednostek A260 ładowano na gradient sacharozy 10-40% przygotowany w buforze B w probówkach rotora SW27 (Beckman). Gradienty wirowano przez 21 h przy 20.000 rpm (4 °C) w rotorze SW27, frakcjonowano przy użyciu frakcjonatora gradientowego (BioComp) i oddzielnie łączono frakcje zawierające rybosomy 70S i podjednostki rybosomalne 50S. Materiał zatężano przy użyciu 2 ml koncentratorów Vivaspin (Sartorius) z membraną z trioctanu celulozy i odzyskiwano w buforze do przechowywania rybosomów (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoetanolu). Skrawki rybosomów i podjednostek rybosomalnych były zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C. W razie potrzeby rRNA wyizolowano przez ekstrakcję fenolu / chloroformu i wytrącanie etanolu.

Do izolacji podjednostek 50S z rybosomów 70S, 130 pmol rybosomów, przygotowanych jak opisano powyżej, ale skoncentrowanych przez granulowanie i przechowywanych w buforze do przechowywania rybosomów (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-merkaptoetanol) rozcieńczono w buforze D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-merkaptoetanol), aby osiągnąć końcowe stężenie MgCl2 wynoszące 1,5 mM. Podjednostki rybosomalne rozdzielano przez wirowanie w gradientach sacharozy 10-40% przygotowanych w buforze D, który zawierał 1,5 mM MgCl2. Gradienty wirowano przez 16 h przy 27 000 rpm (4 °C) w rotorze SW27 (Beckman), frakcjonowano, zatężano i odzyskiwano w buforze do przechowywania rybosomów, jak opisano powyżej. Alikwoty zostały błyskawicznie zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C.

AnalizaLC-MS/MS białek rybosomalnych

Skład białek wt i zmutowanych rybosomów 70S tight-couple oraz podjednostek 50S rybosomalnych, przygotowanych jak opisano powyżej, określono przy użyciu ilościowej spektrometrii mas55. Preparaty rybosomalne mieszano w stosunku molowym 1:1 z rybosomami wt znakowanymi SILAC, zawierającymi masowo znakowaną argininę (Arg6: 6HN4O2 i lizynę (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Niemcy). Białka rybosomalne trawiono trypsyną (Sigma) lub proteazą Lys-C (Wako, USA). Uzyskane peptydy frakcjonowano i analizowano metodą LC-MS/MS przy użyciu LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Identyfikację i analizę ilościową białek przeprowadzono przy użyciu programów Maxquant v1.5.6.056 i Perseus v1.6.2.357. Do przeszukiwania Maxquant wykorzystano bazę danych sekwencji białek E. coli MG1655 z UniProtKB (24.04.2019). Obfitość białek normalizowano osobno dla białek dużej i małej podjednostki poprzez przesunięcie średniego stosunku L/M do 1.

Chemiczne sondowanie struktury rRNA

Strukturę rRNA sondowano w rybosomach 70S wyizolowanych z komórek wt lub zmutowanych. Rybosomy (10 pmol) umieszczano w 50 μl buforu modyfikującego i aktywowano poprzez inkubację przez 5 min w temp. 42 °C. Reakcję modyfikacji rozpoczynano przez dodanie 2 μl siarczanu dimetylu (Sigma) rozcieńczonego 1:10 w etanolu. Próbki inkubowano przez 10 min w temperaturze 37 °C. Reakcje modyfikacji zatrzymywano przez dodanie 50 μl świeżo przygotowanego roztworu zatrzymującego (600 mM NaOAc, 1 M β-merkaptoetanol) i 300 μl etanolu. Próbki wytrącano, zawieszano ponownie w buforze (300 mM octan sodu, 5 mM EDTA, pH 8,0, pH 7,0, 0,5% SDS) i izolowano RNA przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem. Przedłużanie primerów przeprowadzono przy użyciu primerów NA56-NA57.

Analiza zawartości zmutowanego rRNA

Do analizy obecności zmodyfikowanego 23S-cp5S rRNA, całkowite RNA wyizolowano z frakcji gradientu sacharozy, jak opisano powyżej. Zawartość zmutowanego 23S-cp5S rRNA oceniano przez wydłużenie primera przy użyciu primerów NA58 lub NA59. W szczególności, 5′-oznakowany primer (0,5 pmol) był annektowany do 1 μg całkowitego RNA w buforze hybrydyzacyjnym (50 mM K-HEPES, pH 7.0, 100 mM KCl) poprzez inkubację w 90 °C przez 1 min, a następnie chłodzenie przez 15 min do 42 °C, i przedłużany z 2 U odwrotnej transkryptazy AMV (Roche) przez 20 min w 42 °C w końcowej objętości reakcji 8 µl. Dla primera NA58, reakcja zawierała 0,25 mM ddATP i 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP. Dla primera NA59 reakcja zawierała 0,25 mM ddCTP i 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Reakcje kończono przez dodanie 120 μl buforu zatrzymującego (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70% EtOH), chłodzenie w temperaturze -80 °C przez 15 min i granulowanie kwasów nukleinowych przez wirowanie przy 15 000 × g przez 1 h w temperaturze 4 °C. Supernatanty usuwano, peletki suszono i rozpuszczano w barwniku ładującym formamid. Produkty cDNA były rozdzielane w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym i wizualizowane przez fosforescencję.

Translacja in vitro

Reakcje translacji in vitro przeprowadzono w systemie translacji bezkomórkowej Δribosome PURExpress (New England Biolabs). Szablony DNA zawierające promotor polimerazy T7 RNA, miejsce wiązania rybosomu i sekwencję kodującą białko przygotowano metodą PCR. Szablon ermBL został przygotowany przy użyciu starterów NA52-NA55. Szablon GFP został wygenerowany z genu sf-gfp plazmidu pY71-sfGFP58 przy użyciu starterów NA31 i NA32. Reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) uległa ekspresji z szablonu plazmidu dostarczonego z zestawem PURExpress.

Reakcja translacji dla ekspresji GFP została zmontowana w całkowitej objętości 10 μl i zawierała 2 μl roztworu A zestawu PURExpress, 1.2 μl mieszaniny czynników, 1 μl mieszaniny aminokwasów (3 mM każdy), 1 μl tRNA (20 μg/ml), 16 U inhibitora RNazy RiboLock (ThermoFisher), 10 ng szablonu GFP i 12 pmol wt lub zmutowanych rybosomów. Próbki umieszczano w studzienkach 384-dołkowych płytek do hodowli tkankowych z czarną ścianką/płaskim dnem (BD Biosciences) i przykrywano pokrywką. Reakcje inkubowano w temperaturze 37 °C w czytniku mikropłytek (Tecan) z fluorescencją GFP rejestrowaną co 10 min przy λexc = 488 nm i λem = 520 nm przez okres 4 h.

Po ekspresji DHFR następowała inkorporacja -L-metioniny do pełnowymiarowego białka. Translację przeprowadzono w 10 μl reakcji zmontowanych jak opisano powyżej, ale uzupełnionych o 5 μCi -L-metioniny (1175 Ci/mmol), używając 50 ng szablonu DNA i 6 pmol wt lub zmutowanych rybosomów. Reakcje inkubowano w temperaturze 37 °C. Co 12 min pobierano podwielokrotności 1 μl, mieszano z 3 μl barwnika obciążającego żel zawierającego SDS i przechowywano na lodzie do zakończenia przebiegu reakcji. Produkty białkowe analizowano metodą elektroforezy na żelu SDS w 16,5% żelach Bis-Tris (Biorad) przy użyciu buforu NuPAGE MES/SDS (Invitrogen). Żele barwiono, suszono i naświetlano przez noc na ekranie fosforymagera. Radioaktywne pasma były wizualizowane przez fosforyzowanie.

Analiza kryo-EM rybosomów 70S i podjednostek 50S

Siatki kryo-EM przygotowano w następujący sposób. Siatki miedziane 400 M pokryte węglem koronkowym i 2 nm cienką warstwą węgla (Ted Pella Inc.) wyładowywano jarzeniowo prądem 20 mA z polaryzacją ujemną przez 60S w urządzeniu do wyładowań jarzeniowych PELCO easiGlow. Urządzenie Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) zostało wstępnie skalibrowane do temperatury 4 °C i wilgotności względnej 95%. Podwielokrotność uprzednio zamrożonych rybosomów rozmrażano, a gdy zauważono opalizację, roztwór oczyszczano w mikrowirówce (10 minut przy 16 000 × g w 4 °C). Stężenie oczyszczonego supernatantu uzyskano z A260 mierzonego za pomocą Nanodropu (ThermoFisher), a rybosomy rozcieńczono do 200 nM w buforze LPP. Trzy µl roztworu rybosomów 200 nM nanoszono na siatkę; po 10S opóźnienia siatkę blotowano przez 4S, a następnie zanurzano w ciekłym etanie chłodzonym ciekłym azotem.

Dane zbierano w mikroskopie elektronowym Talos (ThermoFisher) pracującym przy 200 KV i wyposażonym w detektor elektronów bezpośrednich K3 (Gatan Inc.) celujący w 0,5-1,8 μm podogniska. Zbieranie danych było zautomatyzowane za pomocą programu SerialEM59 wykorzystującego pochylenie wiązki do zbierania wielu filmów (np. jedno ujęcie na środku, 6 z przesunięciem) w każdej pozycji stolika60. Filmy superrozdzielcze miały w sumie 19 klatek z 1,5 e-/Å2 na klatkę dla całkowitej dawki 30 e-/Å2 na próbce. W sumie zebrano 5222 filmy w ciągu 22 h. Filmy były wyrównywane w locie podczas zbierania danych przy użyciu IMOD61 w celu dekompresji klatek, zastosowania odniesienia do wzmocnienia, podzielenia danych superrozdzielczych na fizyczne piksele o wielkości 0,87 Å na próbce i skorygowania dryfu obrazu.

Wczesne etapy generowania mapy 3D z wyznaczania CTF, wybierania cząstek bez odniesienia (489 732 cząstek) i tworzenia stosu przeprowadzono w cisTEM. Wyrównanie i rafinację cząstek przeprowadzono w programach Frealign 9.11 i cisTEM62,63. Aby przyspieszyć przetwarzanie, stosy 2×-, 4×- i 8×-binned były przygotowywane przy użyciu programu resample.exe, który jest częścią dystrybucji FREALIGN64. Początkowym modelem do wyrównywania cząsteczek na mapach 70S był EMD-100365, który został poddany downsamplingowi, aby dopasować go do stosu obrazów z binowaniem 8× przy użyciu EMAN266. Dwie rundy przeszukiwania w trybie 3 z odcięciem wysokiej rozdzielczości 30 Å, a następnie 20 Å zostały przeprowadzone przy użyciu 8× bined stack. Następnie przeprowadzono 7 rund rafinacji w trybie 1 z użyciem stosu 4×, ostatecznie bez binowania, dodając stopniowo powłoki rozdzielczości (limit 5 Å) i osiągając rozdzielczość 2.94 Å. Zastosowano rafinację z przesunięciem wiązki, aby poprawić całkowitą rozdzielczość do 2.87 Å.

Dwadzieścia rund klasyfikacji maksymalnej wiarygodności 3D bez maskowania i z rozdzielczością 14 Å zastosowano do szybkiego rozdzielenia 8x zbindowanych cząstek na 12 klas o różnym składzie, ujawniających podjednostki 50S, rybosomy 70S bez tRNA lub rybosomy 70S z tRNA i 30S w konformacji obróconej lub nie (Supplementary Fig. 3a). Podstacki cząsteczek 50S (133 490), pustych cząsteczek 70S (120 428) lub związanych z tRNA, nieobróconych cząsteczek 70S (55 677) zostały utworzone przy użyciu stosu 1x binowanego za pomocą merge_classes.exe, będącego częścią pakietu Frealign, wymagającego punktacji cząsteczek równej 0 i minimum 50% zajętości. Podstacki były następnie ponownie binowane do 4x przy użyciu resample.exe, aby przyspieszyć dalsze etapy klasyfikacji.

Podstack cząsteczek 50S został rozdzielony na 6 klas z maską ogniska o promieniu 55-Å wokół części 5S rRNA hybrydowego rRNA 23S-cp5S. Wydzielono klasy ze słabym lub nieobecnym uL16 i/lub bL33 oraz klasy różniące się pozycją 5S rRNA. Klasy zostały zrekonstruowane z oryginalnym wyrównaniem i parametrami pochylenia wiązki przy 1x binningu, a jedna z tych klas została użyta do modelowania strukturalnego, jak szczegółowo opisano w następnym rozdziale.

Badano również cząsteczki 70S. Pusty (bez tRNA) substack cząsteczek 70S został rozdzielony na 12 klas przy użyciu tej samej 55-Å maski ogniskowania. Klasy te wykazywały różnice w zajętości uL16 i/lub bL33 oraz pozycji 5S rRNA, podobnie jak opisane powyżej klasy 50S. Jednakże, w przeciwieństwie do cząsteczek 50S, 3 z 12 pustych klas 70S ujawniły normalnie złożone PTC.

Klasyfikacja klasycznego substratu cząsteczek 70S związanych z tRNA na 12 klas z tą samą maską ujawniła prawie stechiometryczną okupację 16 uL, a wszystkie cząsteczki miały normalnie złożone PTC i silną gęstość P-tRNA. W przeciwieństwie do tego, zajęcie miejsca A przez tRNA było słabe w niektórych klasach ze słabszą gęstością L33. Klasyfikacja cząsteczek 70S z obróconym 30S i hybrydowym stanem P/E-tRNA w 12 klasach również ujawniła różne zajętości uL16 i bL33, a siedem klas charakteryzowało się nieprawidłowym PTC.

3,2-Å struktura cryo-EM rybosomu 70S związanego z A i P tRNA67 została użyta jako model wyjściowy do rafinacji struktury. Komponenty/domenę rybosomu dopasowano do map za pomocą programu Chimera68. Tutaj, 50S, łodyga L1, łodyga L11, ciało i głowa 30S oraz tRNA były dopasowywane niezależnie. Modelowanie 5S rRNA oraz dopasowania do PTC i centrum dekodującego wykonano przy użyciu PyMOL69. Modele strukturalne były rafinowane przy użyciu symulowanego ujednolicania w przestrzeni rzeczywistej z wykorzystaniem RS Ref 70,71 względem odpowiednich map. Parametry rafinacji, takie jak względna waga ograniczeń stereochemicznych i określenie energii eksperymentalnej, zostały zoptymalizowane w celu uzyskania optymalnej stereochemii struktury, współczynnika korelacji w przestrzeni rzeczywistej i współczynnika R, który informuje o dopasowaniu modelu do mapy72. Ograniczenia struktury drugorzędowej, obejmujące ograniczenia wiązań wodorowych dla białek rybosomalnych i ograniczenia parowania zasad dla cząsteczek RNA, zostały zastosowane zgodnie z opisem73. Struktury były następnie rafinowane przy użyciu phenix.real_space_refine74 , po czym następowała runda rafinacji w RSRef z zastosowaniem ograniczeń harmonicznych w celu zachowania geometrii białek70,71. Phenix został użyty do dopracowania współczynników B modeli względem ich odpowiednich map bez filtrowania współczynników B74. Otrzymane modele strukturalne mają dobre parametry stereochemiczne, charakteryzują się niskimi odchyleniami od idealnych długości i kątów wiązań oraz są zgodne z odpowiednimi mapami, na co wskazują wysokie współczynniki korelacji i niskie współczynniki R przestrzeni rzeczywistej (Tabela 2). Rysunki zostały przygotowane w PyMOL69.

Podsumowanie

Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.