Enterokoki

2.4.3.2 Aktywność hydrolityczna enterokoków

Wiadomo, że enterokoki wytwarzają trzy rodzaje enzymów, które przyczyniają się do ich oportunistycznej patogenności: hialuronidazę, żelatynazę i proteazę serynową. Hialuronidaza, kodowana przez chromosomalny gen hyl, degraduje główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej komórek gospodarza, kwas hialuronowy, ułatwiając inwazję tkanek i rozprzestrzenianie się toksyn .

Żelatynaza, kodowana przez chromosomalny gen gelE, jest metaloproteazą cynkową aktywną na żelatynie, ale także na kolagenie, kazeinie, hemoglobinie, β-insulinie i innych biologicznie aktywnych peptydach . Enzym ten przyczynia się również do procesu tworzenia biofilmu, który może ułatwiać kolonizację tkanek i utrzymywanie się w miejscach zakażenia. Proteaza serynowa, kodowana przez gen sprE, znajdujący się powyżej gelE i współtranskrybowany z tym ostatnim, również uczestniczy w patogenezie poprzez degradację tkanek gospodarza .

Enterokoki przyczyniają się do rozwoju smaku sera podczas dojrzewania ze względu na ich aktywność proteolityczną i lipolityczną oraz zdolność do wytwarzania lotnych lub długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, diacetylu, acetoiny i innych związków lotnych . Według , E. faecium jest zaangażowany w rozwój smaku, aromatu, koloru i tekstury. Dlatego też przyczynia się do ogólnego profilu sensorycznego niektórych serów. Te cechy czynią go również florą z wyboru dla innych produktów fermentowanych, takich jak warzywa lub mięsa .

Podczas gdy aktywność proteolityczna bakterii kwasu mlekowego jest dobrze opisana w literaturze dotyczącej produktów fermentowanych, aktywność enterokoków jest mniej znana . Są one raczej niskie w produktach mleczarskich, z wyjątkiem niektórych szczepów E. faecalis. W obrębie tego rodzaju, poziom aktywności proteolitycznej zależy od gatunku i od szczepu wewnątrz tego samego gatunku. Najlepiej opisane proteazy są w stanie hydrolizować kazeinę, ale także β-laktoglobulinę i α-laktalbuminę. Wiele badań wskazuje, że sery produkowane z mleka zaszczepionego E. faecalis mają wyższą aktywność proteolityczną niż sery produkowane bez tych enzymów. Prace nad wzrostem 24 szczepów E. faecium i 60 szczepów E. faecalis w odtłuszczonym mleku w temperaturze 37°C wykazały, że aktywność proteolityczna E. faecalis jest znacznie wyższa niż E. faecium. Wyniki te są potwierdzone przez i w produktach mlecznych i przez na enterokoki wyizolowane z pasteryzowanych płynnych całych jaj i odpowiedzialne za ich psucie się.

Uważa się, że późniejsza degradacja aminokwasów ma duży wpływ na rozwój aromatu serów. Aktywność proteolityczna może być również odpowiedzialna za tworzenie amin biogennych przez enterokoki z uwolnionych przez nie (lub inne rodzaje bakterii) aminokwasów. Rysunek 2.6 przedstawia różne aminy biogenne potencjalnie powstające w żywności ulegającej zepsuciu.

Rysunek 2.6. Powstawanie amin biogennych w matrycach żywności w odpowiedzi na mikrobiologiczną aktywność metaboliczną. Szare strzałki przedstawiają reakcje dekarboksylacji bezpośrednio prowadzące do powstania amin biogennych, linie przerywane wskazują aminy biogenne powstające na drodze metabolicznej, która różni się od jednoetapowych reakcji dekarboksylacji.

(Rysunek zaczerpnięty z , dostosowany zgodnie z )

Histamina, tyramina, fenyloetyloamina i kadaweryna są wytwarzane w jednostopniowej reakcji dekarboksylacji z ich odpowiednich prekursorów histydyny, tyrozyny, fenyloalaniny i lizyny. Wytwarzanie tych biogennych amin, a następnie ich wydzielanie, wymaga (1) aktywnych systemów transportu aminokwasów prekursorowych, (2) dekarboksylacji i (3) systemów wydalania amin będących wynikiem tych dekarboksylacji. W transporcie zazwyczaj uczestniczy białko, które wymienia aminokwas prekursorowy z aminą powstałą w wyniku jego dekarboksylacji. Po dostaniu się do komórki aminokwas ulega dekarboksylacji katalizowanej przez specyficzną dekarboksylazę (karboksylazy EC 4.1.1.1.) w obecności fosforanu pirydoksalu. Najczęściej badane dekarboksylazy to dekarboksylaza histydyny (HDC), dekarboksylaza tyrozyny (TDC) i dekarboksylaza lizyny (LDC), kodowane odpowiednio przez geny hdcA, tdcA i cadA. Później są one zorganizowane w operony z innymi genami zaangażowanymi w inne etapy procesu produkcji amin biogennych, takie jak transport i dojrzewanie. Specyficzność tych dekarboksylaz była długo dyskutowana i obecnie wiadomo, że jedna dekarboksylaza może dekarboksylować kilka substratów. Na przykład, Enterococcus TDC może dekarboksylować fenyloalaninę i tyrozynę, tworząc odpowiednio fenyloetyloaminę i tyraminę. Putrescyna, agmatyna, spermidyna i spermina są syntetyzowane przez różne szlaki katalizowane przez grupy genów, które mogą być specyficzne dla gatunku lub szczepu, ponieważ są one potencjalnie nabyte przez horyzontalny transfer .

Enterokoki są opisane jako zdolne do powodowania aktywności dekarboksylazy odpowiedzialnej za produkcję amin biogennych w fermentowanej żywności. Są one nawet uznawane za posiadające najsilniejsze aktywności dekarboksylazy tyrozyny i fenyloalaniny w świecie bakteryjnym. Bakterie kwasu mlekowego w endogennej florze fermentowanych mięs, takich jak kiełbasy, są uznawane za głównych producentów tyraminy. Sery i niektóre produkty mięsne mogą być odpowiednimi substratami do produkcji 2-fenyloetyloaminy, tyraminy, histydyny lub innych amin. Szczepy te posiadają zatem geny lub operony kodujące dekarboksylazy lub inne enzymy biorące udział w syntezie amin biogennych lub w ich katabolizmie. W przypadku produktów z owoców morza, synteza amin biogennych nie jest przypisywana enterokokom . Podczas gdy bakterie odporne na ciepło, takie jak enterokoki, które są głównymi bakteriami biorącymi udział w produkcji amin biogennych w produktach mlecznych, są tylko częściowo eliminowane przez pasteryzację, obróbka cieplna obniża poziom amin biogennych. Zjawisko to może wynikać z obniżenia poziomu zanieczyszczenia żywności i/lub z faktu, że niezbędny kofaktor dekarboksylacji został zdenaturowany przez pasteryzację.

Ale bakterie kwasu mlekowego nie są bardzo aktywne wobec lipidów, wiadomo, że uczestniczą w aromatyzowaniu serów, albo przez konwersję krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych do ketonów lub metylowanych laktonów, albo przez tworzenie aldehydów powstających w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiedzialnych za powstawanie zjełczałych zapachów i smaków, albo przez rozpuszczanie związków aromatycznych wytwarzanych z lipidów, ale także z białek i laktozy. Według , i , enterokoki mają aktywność esterazy, która jest często silniejsza niż innych bakterii kwasu mlekowego. Wśród enterokoków aktywność ta jest również zmienna, a badania wykazały, że jest ona silniejsza u E. faecalis niż u E. faecium. Inne badania wykazują, że aktywność lipolityczna enterokoków jest różna nie w zależności od gatunku, ale od rodzaju sera, z którego szczep pochodzi .

Już w 1965 roku wykazano aktywność esterazy wyrażoną przez szczepy E. faecalis i E. faecium. wykazuje, że enterokoki były bardziej aktywne na triglicerydach niż szczepy Streptococcus oraz że szybkość hydrolizy malała wraz ze wzrostem długości łańcucha węglowego uwalnianych kwasów tłuszczowych (tripropionina > tributyryna > tricapryna > tricaprylina). Podkreślają brak aktywności na trioleinę. wykazują, że enterokoki wykazują niską aktywność lipolityczną po umieszczeniu w podłożu wzrostowym zawierającym mleko pełne. Praca pokazuje hydrolizę tributyryny wyrażoną przez E. faecium i E. faecal wyizolowane z sera, jednak szczepy te nie są aktywne wobec lipidów mleka. pokazują, że lipaza z E. faecalisis jest również bardziej aktywna wobec tributyryny niż wobec trikaproliny, trikapryliny i trioleiny. Jednakże, jak podają autorzy, zdolność enterokoków do hydrolizy lipidów mleka jest bardzo zróżnicowana w zależności od szczepu. Niektóre szczepy nie wykazują żadnej aktywności lipolitycznej, podczas gdy inne wykazują wysoką aktywność w stosunku do szerokiego zakresu kwasów tłuszczowych. Prace przeprowadzone na syntetycznych substratach (4-nitrofenylo-acylach) wykazały aktywność E. faecium na kwasach tłuszczowych o długości łańcucha od 2 do 18 karbonów. W kolejnych badaniach ci sami autorzy wykazali, że wewnątrzkomórkowa esteraza E. faecium rozwija in vitro aktywność na 4-nitrofenylo-acylach, których długość łańcucha wynosi od 2 do 12 karbonów, z optimum w obecności 4-nitrofenylo-maślanu (C2). Badania wykazały, że większość badanych szczepów enterokoków (90%, N = 129), jest zdolna do hydrolizy homogennych triglicerydów zawierających kwasy tłuszczowe o długości łańcucha od 4 do 18 karbonów, przy czym aktywność ta maleje wraz ze wzrostem długości łańcucha węglowego. Wszystkie badane szczepy (100%) w tym samym badaniu wykazują aktywność na syntetycznych substratach, od 4-nitrofenylooctanu (C2) do 4-nitrofenyloestearynianu (C18), przy czym aktywność ta jest również zmniejszana przez wzrost długości łańcucha węglowego kwasu tłuszczowego.

Wśród nielicznych opublikowanych badań dotyczących aktywności hydrolitycznych, które mogą być zaangażowane w psucie się produktów jajecznych, są te, które wykazują aktywność lipolityczną wyrażoną przez szczepy E. faecium, a w szczególności E. faecalis wyizolowane z zepsutych pasteryzowanych płynnych produktów z całych jaj. Prace ujawniają, że aktywność lipazową wykazuje również połowa szczepów Enterococcus pochodzących z przemysłowych białek jaj i badanych pod kątem ich zdolności do psucia jednego z głównych składników deserów pływających wysp, kremu custard.

.