Emerging Applications of Bacterial Spores in Nanobiotechnology

Powłoki zarodników składają się z białek, mają uporządkowane tablice podjednostek protomerycznych, wykazują samoorganizację i mają właściwości ochronne . Jako uśpione, nieaktywne metabolicznie formy życia, zarodniki mogą przetrwać w stanie wysuszonym w nieskończoność i rzeczywiście zostały udokumentowane jako przetrwanie w stanie nienaruszonym przez miliony lat. Zarodnik może oprzeć się temperaturze tak wysokiej jak 90°C, jak również narażenie na szkodliwe chemikalia . Większość (ale nie wszystkie) bakterii tworzących przetrwalniki należy do dwóch głównych rodzajów, Bacillus i Clostridium. Bakterie tworzące przetrwalniki Clostridia, w przeciwieństwie do Bacillus, różnicują się tylko w warunkach beztlenowych, co czyni Bacillus najbardziej podatnym rodzajem do badań.

Gatunki Bacillus wytwarzają pojedyncze przetrwalniki lub endospory (w przeciwieństwie do egzospor grzybów), w komórce bakteryjnej przez proces różnicowania wymagający skoordynowanego działania setek genów rozwojowych. Typowe dojrzałe zarodniki mają długość 0,8-1,2 μm i kształt kulisty lub elipsoidalny (patrz Rysunek 1A). Pojedynczy chromosom bakteryjny jest skondensowany w centrum przetrwalnika, zwanym jądrem. Warstwy błony lipidowej i zmodyfikowanego peptydoglikanu otaczają rdzeń zarodnika, ale najważniejszą strukturą jest płaszcz zarodnika. Ta laminowana, białkowa powłoka zapewnia zarodnikowi odporność na rozpuszczalniki organiczne i lizozym. U Bacillus subtilis aż 25 różnych białek płaszcza jest obecnych w dwóch odrębnych warstwach płaszcza (Rysunek 1B), wewnętrznej i zewnętrznej, ale u innych gatunków istnieją dowody, że płaszcz jest mniej złożony i w niektórych przypadkach może składać się tylko z kilku typów białek. Struktura i montaż płaszcza zarodników staje się obecnie systemem modelowym do zrozumienia złożonych procesów morfogenetycznych, podobnych do klasycznych badań nad montażem faga T4. Zewnętrzna, elektronowo gęsta warstwa płaszcza B. subtilis składa się z 5 głównych polipeptydów: CotA (65 kDa), CotB (59 kDa), CotG (24 kDa), CotC (11 kDa) i CotF (8 kDa). CotA jest oksydazą wielomiedziową i może gromadzić się w formie multimerycznej (obserwowanej mikroskopowo) w komórkach sporulujących u niektórych mutantów z defektem płaszcza. Przypuszczalnie oligomeryzacja i samoskładanie się CotA poprzedza osadzanie się na powierzchni płaszcza zarodnika. Wykazano również, że białka CotG i CotB oddziałują ze sobą kowalencyjnie, a ponadto CotG i CotC mają wyjątkowo nietypowe sekwencje aminokwasowe zawierające liczne powtórzenia (>13) 12-13 aminokwasów bogatych w lizyny i tyrozyny. Ponadto, wiele z białek płaszcza zarodników ma nietypowe profile, tj. formy multimeryczne i nietypowe masy cząsteczkowe, gdy są badane metodą SDS-PAGE. Ostatnio wykazano, że płaszcz zarodnika jest w istocie elastyczny i może się rozszerzać i kurczyć, a cecha ta jest krytyczna dla tworzenia zarodników, gdy zarodnik się odwadnia i podobnie dla kiełkowania, gdy zarodnik się nawadnia. Ten aspekt samoskładającej się struktury jest szczególnie interesujący i może zaoferować wiele przyszłych zastosowań w dostarczaniu leków, nanofabrykacji i powłokach powierzchniowych.

Bakteryjne endospory. Panel A pokazuje endospory z B. subtilis, z których jedna jest nadal zachowana wewnątrz prętokształtnej „komórki macierzystej”. U B. subtilis, zarodniki mają około 1,2 μm długości i są elipsoidalne. Uwolnione zarodniki mają przezroczystą powłokę ochronną, zwaną płaszczem zarodnika, składającą się z aż 25 różnych składników protomerycznych połączonych w dyskretne warstwy. Panel B pokazuje typowe frakcjonowanie SDS-PAGE (12,5%) rozpuszczonych białek płaszcza zarodnika ujawniające dominujące gatunki.

Engineering the Bacterial Spore Coat

Strategia inżynierii zarodników Bacillus subtilis do wyświetlania heterologicznych antygenów na powierzchni zarodnika została ostatnio zgłoszona i jest zilustrowana na Rysunku 2. System wyświetlania oparty na przetrwalnikach zapewnia kilka korzyści w odniesieniu do systemów opartych na wykorzystaniu komórek bakteryjnych, obejmują one wytrzymałość przetrwalnika bakteryjnego umożliwiającą przechowywanie w postaci wysuszonej, łatwość produkcji, bezpieczeństwo i platformę technologiczną wspieraną przez obszerne narzędzia do manipulacji genetycznej.

Wyświetlanie na powierzchni przetrwalnika przy użyciu białek płaszcza przetrwalnika. Zarodnik B. subtilis składa się z wewnętrznego rdzenia (żółty) otoczonego peptydoglikanopodobną korą (czerwony) i białkowego płaszcza podzielonego na część wewnętrzną (zielony) i zewnętrzną (czarny). Białko fuzyjne, złożone z części nośnikowej (niebieskiej) i pasażerskiej (fioletowej), jest eksponowane na powierzchni zarodnika.

W przeciwieństwie do bogactwa dostępnych informacji o tym, jak ekspresja genów kontroluje różnicowanie rosnącej komórki w uśpione zarodniki, niewiele wiadomo o mechanizmach wbudowywania białek do płaszcza, naturze składników strukturalnych tworzących najbardziej zewnętrzną część płaszcza i czy istnieją motywy kotwiczące. Pierwsze próby ekspozycji heterologicznych białek na powierzchni zarodników koncentrowały się na dwóch komponentach płaszcza, CotB i CotC. W przypadku CotB wiadomo, że to białko płaszcza zarodnika jest zlokalizowane na powierzchni, natomiast w przypadku CotC, w porównaniu z innymi białkami płaszcza, gatunek ten charakteryzuje się wysoką względną liczebnością. Obserwacja, że oba te składniki płaszcza są zbędne do tworzenia pozornie normalnych zarodników, jak również do ich kiełkowania, była dodatkową pozytywną cechą przy wyborze CotB i CotC jako potencjalnych białek nośnikowych.

Dwa antygeny zostały początkowo wybrane jako białka modelowe do umieszczenia na powierzchni zarodnika: i) nietoksyczny 459 aminokwasowy C-końcowy fragment toksyny tężcowej (TTFC), dobrze scharakteryzowany i wysoce immunogenny peptyd o masie 51.8 kDa peptyd, kodowany przez gen tetC Clostridium tetani; i ii) 103 aminokwasowa podjednostka B toksyny termolabilnej enterotoksycznych szczepów Escherichia coli (LTB), peptyd 12 kDa, kodowany przez gen eltB .

CotB jako białko nośnikowe

Podobnie jak inne składniki płaszcza, CotB został powiązany z zewnętrzną warstwą płaszcza na podstawie dowodów genetycznych i dopiero niedawno analiza immunocytofluorymetryczna przeprowadzona na nienaruszonych zarodnikach wykazała, że CotB jest dostępny dla przeciwciał specyficznych dla CotB, a zatem, że jest najprawdopodobniej eksponowany na powierzchni zarodników .

Gen strukturalny CotB, cotB, znajduje się pod podwójną kontrolą transkrypcyjną σK i białka wiążącego DNA GerE. W konsekwencji, cotB jest transkrybowany tylko w przedziale komórki macierzystej komórki sporulującej. Po syntezie w cytoplazmie komórki macierzystej, CotB jest montowany wokół tworzącego się przetrwalnika w sposób w pewnym stopniu zależny od CotE, CotG i CotH. Dlatego CotB i heterologiczne białko ostatecznie połączone z nim, nie przechodzą etapu translokacji ściany komórkowej, typowego dla systemów wyświetlania w innych bakteriach.

CotB ma silnie hydrofilową C-końcową połowę utworzoną przez trzy 27 aminokwasowe powtórzenia bogate w reszty seryny, lizyny i glutaminy. Reszty serynowe stanowią ponad 50% C-końcowej połowy CotB. Reszty lizyny w powtórzeniach CotB zostały zasugerowane jako miejsca wewnątrz- lub międzycząsteczkowych wiązań krzyżowych, przez analogię do białek tkanki łącznej – kolagenu i elastyny. Białko CotB ma wydedukowaną masę cząsteczkową 46 kDa, ale migruje na SDS-PAGE jako polipeptyd o masie 59 kDa. Ostatnio rozbieżność między zmierzoną i wydedukowaną masą cząsteczkową została wyjaśniona przez wykazanie, że CotB jest początkowo syntetyzowany jako gatunek 46 kDa i przekształcany w homodimer 59 kDa, który zachowuje zarówno N- jak i C-końcowe końce przewidywane z sekwencji nukleotydowej cotB.

Strategia otrzymywania rekombinowanych zarodników B. subtilis wyrażających CotB-TTFC lub CotB-LTB na swojej powierzchni opierała się na (i) wykorzystaniu genu cotB i jego promotora do konstrukcji fuzji translacyjnych oraz (ii) chromosomalnej integracji fuzji genów cotB-tetC i cotB-eltB do sekwencji kodującej nieistotnego genu amyE (Figura 3A) . Umieszczenie białek fuzyjnych pod sygnałem transkrypcyjnym i translacyjnym cotB zapewniło prawidłowy czas ekspresji podczas sporulacji, a ich chromosomalna integracja zagwarantowała stabilność genetyczną konstruktu. Ze względu na brak informacji na temat składania płaszcza CotB oraz wymagań dotyczących motywów kotwiczących, wstępne próby przeprowadzono pozycjonując białko pasażerskie na C-końcu, N-końcu lub w środku CotB (Rys. 3B).

System wyświetlania na powierzchni porów w B. subtilis . (A) Schematyczny widok integracji fuzji genów na chromosomie. Czerwone paski reprezentują fuzję genów, szare i zielone paski reprezentują odpowiednio nieistotny gen amyE B. subtilis używany jako miejsce integracji oraz gen acetylotransferazy chloramfenikolu (cat) używany jako marker selekcyjny. (B) Schematyczne przedstawienie białek fuzyjnych wykorzystujących CotB o pełnej długości (380 aminokwasów), CotBΔ105 (275 aminokwasów) lub CotC (66 aminokwasów) jako białka nośnikowe (wszystkie w kolorze niebieskim). Trzy 27-aminokwasowe powtórzenia CotB o pełnej długości oraz ich część pozostała w CotBΔ105 są zaznaczone na czarno. Fioletowe paski reprezentują heterologiczną część fuzji (TTFC lub LTB).

Gdy TTFC i LTB zostały połączone z C-końcem CotB, chimeryczne białka nie zdołały prawidłowo złożyć się na powierzchni zarodnika (Isticato i Ricca, niepublikowane). Takie początkowe niepowodzenia przypisywano potencjalnej niestabilności konstruktów, zarówno na poziomie DNA (powtarzające się sekwencje DNA), jak i na poziomie białek. W celu ominięcia tych problemów TTFC i LTB zostały połączone z C-końcowym końcem formy CotB pozbawionej trzech 27 aminokwasowych powtórzeń, CotBΔ105-TTFC (Rys. 3A). W przeciwieństwie do wersji o pełnej długości, białko chimeryczne CotBΔ105-TTFC było prawidłowo złożone i wyeksponowane na powierzchni zarodnika. Ilościowy dot blot wykazał, że każdy rekombinowany zarodnik eksponował ilość białka fuzyjnego CotBΔ105-TTFC równą 0,00022 pg, co pozwala stwierdzić, że 1,5 × 103 cząsteczki chimeryczne są obecne na powierzchni każdego rekombinowanego zarodnika .

W przeciwieństwie do CotBΔ105-TTFC, CotBΔ105-LTB nie był prawidłowo zmontowany. Szczep wyrażający tę chimerę wykazywał obniżoną wydajność sporulacji i kiełkowania, a jego zarodniki nie były odporne na lizozym. Obserwacje te, wraz z analizą SDS-PAGE uwolnionych białek płaszcza, sugerują, że obecność CotBΔ105-LTB silnie zmienia warstwę płaszcza zarodników. Analiza in-silico wykazała pewną homologię pomiędzy produktem chimerycznym (w regionie fuzyjnym) a LytF, endopeptydazą związaną ze ścianą komórkową, produkowaną przez B. subtilis podczas wzrostu wegetatywnego, co nasuwa przypuszczenie, że produkt chimeryczny może zakłócać prawidłowe formowanie płaszcza poprzez degradację niektórych jego składników (Mauriello i Ricca, dane nie pokazane).

Oprócz opisanej powyżej fuzji na C-końcu modelowe białko pasażerskie TTFC uległo fuzji również na N-końcu i w środku CotB (Rys. 3B). W obu przypadkach użyto formy CotBΔ105, aby uniknąć problemów związanych z fuzją C-końcową (patrz wyżej). Zarówno w przypadku fuzji N-terminalnej jak i kanapkowej powstały produkty chimeryczne, które były prawidłowo wbudowane w strukturę płaszcza zarówno z jakościowego jak i ilościowego punktu widzenia. Przynajmniej w przypadku CotB można było wówczas stwierdzić, że tam, gdzie białko pasażera jest wyeksponowane, nie ma ono wpływu na ekspozycję na powierzchni zarodnika.

CotC jako białko nośnikowe

CotC jest rozpuszczalnym w zasadach składnikiem płaszcza zarodników B. subtilis o masie 12 kDa, zidentyfikowanym wcześniej za pomocą genetyki odwrotnej, a następnie związanym z zewnętrzną warstwą płaszcza na podstawie dowodów genetycznych. CotC był początkowo uważany za kandydata na nośnik ze względu na jego względną obfitość w płaszczu (Figura 1B). Wraz z CotG i CotD, CotC stanowi około 50% wszystkich rozpuszczonych białek płaszcza. Taka stosunkowo wysoka ilość mogłaby pozwolić na zgromadzenie znacznej liczby chimer opartych na CotC na płaszczu, zapewniając w ten sposób wydajną ekspozycję heterologiczną. Ekspresja genu CotC odbywa się pod kontrolą specyficznego dla komórek macierzystych czynnika σK oraz regulatorów transkrypcji GerE i SpoIIID. Podobnie jak w przypadku CotB, CotC jest również transkrybowany w komórce macierzystej, a jego montaż na płaszczu nie wymaga translokacji błonowej. Pierwotnym produktem genu CotC jest 66 aminokwasowy polipeptyd niezwykle bogaty w reszty tyrozynowe (30,3%) i lizynowe (28,8%). Jednakże, ostatnio wykazano, że CotC jest składany w co najmniej cztery różne formy białkowe, o wielkości od 12 do 30 kDa. Dwie z nich, o masach cząsteczkowych 12 i 21 kDa i odpowiadające najprawdopodobniej odpowiednio monomerycznej i homodimerycznej formie CotC, są montowane na tworzących się zarodnikach zaraz po ich syntezie, osiem godzin po rozpoczęciu sporulacji. Pozostałe dwie formy, 12,5 i 30 kDa, są prawdopodobnie produktami modyfikacji potranslacyjnych dwóch pozostałych form, zachodzących bezpośrednio na powierzchni otoczki podczas dojrzewania zarodników .

W przypadku CotC skonstruowano do tej pory tylko C-końcowe fuzje (Rysunek 3B). Obie fuzje genów CotC-TTFC i CotC-LTB otrzymano przez klonowanie tetC lub eltB w ramce z ostatnim kodonem CotC pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą regionu promotora CotC. Fuzja genów została następnie zintegrowana z chromosomem B. subtilis w locus amyE poprzez podwójną rekombinację krzyżową (Rysunek 3A). Oba te chimeryczne białka były montowane na powłoce rekombinowanych przetrwalników bez większego wpływu na strukturę i/lub funkcję przetrwalników, ponieważ były one identyczne z przetrwalnikami typu dzikiego pod względem wydajności sporulacji i kiełkowania oraz właściwości odpornościowych. Western blot, analiza cytofluorymetryczna oraz, w przypadku CotC-TTFC, mikroskopia immunofluorescencyjna (Rysunek 4) wykazały, że obie chimery oparte na CotC były widoczne na powierzchni rekombinowanych zarodników. Ilościowe oznaczenie białek rekombinowanych eksponowanych na zarodnikach B. subtilis wykazało, że ok. 9,7 × 102 i 2,7 × 103 cząsteczki odpowiednio CotC-TTFC i CotC-LTB, zostały wyekstrahowane z każdego zarodnika.

Wykrywanie obecności CotC-LTB i CotC-TTFC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Sporulację szczepów B. subtilis wywoływano metodą resuspensji, a próbki pobierano 6 h po rozpoczęciu sporulacji i analizowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, jak opisano wcześniej. Próbki znakowano mysim przeciwciałem anty-LTB, po którym następował koniugat anty-mysiej IgG-TRITC (czerwona fluoresceina, panele A & B), lub króliczym przeciwciałem anty-TTFC, po którym następował koniugat anty-rabickiej IgG-FITC (zielona fluoresceina, panele C & D). Panele A & C, zarodniki typu dzikiego; Panel B, izogeniczne zarodniki wykazujące ekspresję CotC-LTB); Panel D, izogeniczne zarodniki wykazujące ekspresję CotC-TTFC.

Pomimo, że CotC wydaje się być bardziej obfity niż CotB w obrębie płaszcza, porównywalne ilości heterologicznych białek są eksponowane przez systemy oparte na CotC i CotBΔ105. Wynik ten był w pewnym sensie nieoczekiwany, ponieważ CotC wydaje się być znacznie bardziej obfity niż CotB w płaszczu. Możliwe wyjaśnienie pochodzi z niedawnego odkrycia, że C-końcowy koniec CotC jest nie tylko niezbędny do interakcji z innymi cząsteczkami CotC, ale także z innymi składnikami płaszcza (Isticato i Ricca, manuskrypt w przygotowaniu) i dlatego pokazuje, że wykorzystanie CotC jako nośnika nadal wymaga optymalizacji.

Stability of Spore-Displayed Proteins

Jednym z głównych powodów, dla których proponuje się wykorzystanie przetrwalnika bakteryjnego jako korzystnego systemu ekspozycji jest jego dobrze udokumentowana stabilność. Zarodniki mogą być po prostu przechowywane w temperaturze pokojowej przez długi czas bez zmniejszenia ich odporności i stabilności. Byłaby to niezwykle użyteczna właściwość dla różnych zastosowań biotechnologicznych. Na przykład, jeśli białko pasażera jest antygenem, rekombinowany zarodnik mógłby stać się idealną stabilną termicznie szczepionką doustną do stosowania w krajach rozwijających się, gdzie stabilność termiczna jest najbardziej niepokojąca ze względu na słabą dystrybucję i przechowywanie.

Jednakże, podczas gdy stabilność zarodników jest dobrze udokumentowana , stabilność heterologicznych białek eksponowanych na powierzchni zarodnika została zbadana dopiero niedawno. Zarodniki z ekspresją CotBΔ105-TTFC (patrz wyżej) oraz zarodniki rodzicielskie przechowywano w temperaturze -80°C, -20°C, +4°C oraz w temperaturze pokojowej i oznaczano w różnych okresach przechowywania do 12 tygodni. We wszystkich przypadkach ilość heterologicznego białka obecnego na powierzchni zrekombinowanych przetrwalników okazała się identyczna pomiędzy świeżo przygotowanymi przetrwalnikami i tymi przechowywanymi do 12 tygodni (Rys. 5). Wyniki te, wskazujące, że heterologiczne białka mogą być stabilnie eksponowane na powierzchni rekombinowanych przetrwalników, potwierdzają system oparty na przetrwalnikach jako bardzo obiecujące podejście do ekspozycji, które może przezwyciężyć niektóre wady innych systemów i które może znaleźć zastosowanie w wielu różnych dziedzinach biotechnologii.

Analiza spot blot białek wyekstrahowanych z zarodników typu dzikiego i z zarodników eksponujących chimerę CotBΔ 105 -TTFC. Świeżo oczyszczone zarodniki eksprymujące chimerę CotBΔ105-TTFC (t0) lub po 4, 8 lub 12 tygodniach (t4, t8 i t12) przechowywania w temperaturze pokojowej badano metodą dot blottingu wyekstrahowanych białek płaszcza zarodników. Podano stężenia oczyszczonego TTFC (w nanogramach) i białek płaszcza (w mikrogramach). Białka były ładowane i reagowały z monoklonalnymi przeciwciałami anty-TTFC (Boeringher), a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fosfatazą. Sygnały o podobnej intensywności uzyskano ze świeżo oczyszczonymi przetrwalnikami i przetrwalnikami przechowywanymi w temperaturze pokojowej przez okres do 12 tygodni.

Proof of Principle for Oral Vaccination Using Tetanus as a Model Disease

Spory wyrażające CotBΔ105-TTFC zostały użyte do immunizacji myszy drogą doustną . IgG w surowicy i sIgA w kale wykazały wyraźną serokonwersję na TTFC. Schemat dawkowania obejmował trzy zestawy po trzy dawki (1,67 × 1010) w ciągu 5 tygodni i był oparty na schematach zoptymalizowanych do immunizacji doustnej. Miana swoistych IgG TTFC po 33 dniach (>103) sugerowały, że były one na poziomie ochronnym, a myszy zakażone toksyną tężcową odpowiadającą 10 LD50 były w pełni chronione. Spośród ośmiu myszy zakażonych dawką 20 LD50 przeżyło siedem, co sugeruje, że jest to próg ochrony. Podobne badanie zostało przeprowadzone przy użyciu nosowej immunizacji zarodnikami CotB-TTFC, ale przy niższej dawce i trzech immunizacjach. Tutaj, odpowiedzi TTFC-specific IgG były niższe, ale nadal wykazywały serokonwersję. Badania te pokazują, że zmodyfikowane zarodniki wyrażające heterologiczny antygen mogą być stosowane do immunizacji ochronnej. Ponadto, chociaż odpowiedzi śluzówkowe nie są ważne dla ochrony przed Clostridium tetani (patogen ogólnoustrojowy), są one oczywiście ważne dla patogenów śluzówkowych. Potrzebne będą dalsze badania w celu optymalizacji reżimów dawkowania (mniej dawek i mniej zarodników), ale te przełomowe badania otworzyły drogę do rozwoju przeciwko specyficznym patogenom śluzówkowym. Chociaż te badania są zachęcające i pokazują odpowiedzi humoralne, nie ma jeszcze jasnych dowodów, które wskazują na odpowiedzi komórkowe. Jednakże wykazano, że zarodniki rozprzestrzeniają się do przewodu pokarmowego i są znajdowane w łatach Peyera (PP) i węzłach chłonnych krezkowych. Mały rozmiar zarodnika (1 μm) pozwoliłby na pobranie go przez komórki M i przetransportowanie do PP, gdzie mógłby oddziaływać z komórkami prezentującymi antygen. Wstępne badania wykazały, że zarodniki mogą kiełkować i utrzymywać się przez krótki okres czasu w makrofagach jelitowych, jak również wywoływać cytokiny Th 1 in vivo, takie jak IFN-γ .

.