Dostępność i architektura chromatyny

Rysunek 3: Techniki konformacji chromosomów. Różne etapy technik 3C, 4C, 5C, ChIA-PET i Hi-C.

Chromatin conformation capture (3C)

3C wykorzystuje sieciowanie formaldehydem do zablokowania trójwymiarowej struktury chromatyny w miejscu, po czym następuje trawienie enzymami restrykcyjnymi. Wycięte fragmenty DNA są następnie analizowane przez qPCR i sekwencjonowanie w celu zidentyfikowania, gdzie odległe regiony DNA są połączone. To podejście do analizy struktury chromatyny 3D i interakcji in vivo zostało po raz pierwszy opracowane w 2002 roku (Dekker i in., 2002), i od tego czasu stało się podstawą dla wielu pokrewnych technik, które zostały opracowane w celu osiągnięcia większej skali, przepustowości lub specyficzności.

Circularized chromosome conformation capture (4C)

4C umożliwia identyfikację wcześniej nieznanych regionów DNA, które oddziałują z locus zainteresowania, co czyni 4C idealnym do odkrywania nowych interakcji w obrębie określonego regionu (Dekker et al., 2006).

4C pomocne wskazówki:

• Wybierz właściwe enzymy restrykcyjne. Częstsze cięcia (tj. miejsca rozpoznawania o długości czterech bp) są lepsze dla lokalnych interakcji między regionem zainteresowania a pobliskimi sekwencjami na tym samym chromosomie (van der Werken i in., 2012).
• Optymalizacja sieciowania. Niższe stężenia formaldehydu promują niepożądane samozwiązania regionu zainteresowania, ale także zapobiegają powstawaniu „kul włosowych” DNA, które utrudniają cięcie enzymami restrykcyjnymi. Wysokie stężenia formaldehydu obniżają liczbę zdarzeń samozwiązania, ale zwiększają liczbę „hairballs”. Optymalne stężenie formaldehydu powinno być dobrane do konkretnej sytuacji eksperymentalnej, aby zrównoważyć te czynniki. Traktowanie 1% formaldehydem przez 10 min jest dobrym punktem wyjścia dla większości eksperymentów (van der Werken et al., 2012).

Wyłapywanie konformacji chromosomów z kopii węgla (5C)

5C generuje bibliotekę wszelkich produktów ligacji z regionów DNA, które łączą się z docelowymi loci, które są następnie analizowane przez NGS. 5C jest idealnym rozwiązaniem, gdy potrzebne są bardzo szczegółowe informacje o wszystkich interakcjach w danym regionie, na przykład przy tworzeniu diagramu szczegółowej matrycy interakcji danego chromosomu. Jednakże, 5C nie jest prawdziwie genomowa, ponieważ każdy primer 5C musi być zaprojektowany indywidualnie, więc najlepiej nadaje się do konkretnych regionów (Dotsie i Dekker, 2007).

5C pomocne wskazówki:

• Wybierz właściwy enzym restrykcyjny. Wybór enzymu, który działa wydajnie w określonych warunkach eksperymentalnych jest niezbędny. Na przykład, BamHI nie jest zalecany do większości eksperymentów z powodu nieefektywności w warunkach 3C (Dotsie et al., 2007).
• Zoptymalizuj projekt primera. 5C wykorzystuje dwa primery: primer forward 5C, który wiąże się w górę miejsca ligacji i primer reverse, który wiąże się bezpośrednio w dół. Długość primera powinna być dostosowana tak, aby temperatura annealingu wynosiła około 65°C, aby umożliwić primerom dokładne annealowanie z ich fragmentami restrykcyjnymi. Upewnij się, że startery 5C są syntetyzowane z fosforanem na końcu 5′ do ligacji.
• Użyj szablonu kontrolnego. Pozwoli to na kontrolę różnic w wydajności primerów. Zalecana jest biblioteka kontrolna skonstruowana z całego badanego regionu genomu. Jeśli taka biblioteka nie jest skonstruowana, badacze powinni być świadomi, że częstotliwości interakcji będą mniej precyzyjne.

Chromatynowa analiza interakcji przez sekwencjonowanie znaczników sparowanych (ChIA-PET)

ChIA-PET wykorzystuje aspekty ChIP i 3C do analizy wzajemnego oddziaływania odległych regionów DNA przez określone białko.

ChIA-PET jest najlepiej wykorzystywana do eksperymentów odkrywczych z udziałem interesującego białka i nieznanych celów wiązania DNA. Miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego, na przykład, są najlepiej badane za pomocą ChIA-PET, ponieważ technika ta wymaga wiązania DNA przez czynnik transkrypcyjny in vivo, aby interakcja mogła zostać nazwana (Fullwood i in., 2009).

Pomocne wskazówki ChIA-PET:

• Zakładanie znaczników PET w celu zmniejszenia tła. Podobnie jak w przypadku większości technologii 3C, szum tła stanowi wyzwanie techniczne. Szczególnie w ChIA-PET, szum może utrudniać znalezienie interakcji dalekiego zasięgu z interesującym nas locus. Przydatną wskazówką do przezwyciężenia tego problemu jest wymaganie, aby PET nakładały się na obu końcach regionu, aby interakcja była interakcją dalekiego zasięgu.

ChIP-loop

ChIP-loop jest mieszanką ChIP i 3C, która wykorzystuje przeciwciała ukierunkowane na białka podejrzane o wiązanie regionu DNA będącego przedmiotem zainteresowania. ChIP-loop jest idealny, aby dowiedzieć się, czy dwa znane regiony DNA oddziałują za pośrednictwem interesującego nas białka. ChIP-loop nadaje się również dobrze do potwierdzania podejrzewanych interakcji, ale nie do odkrywania nowych (Horike i in., 2005).

Pomocne wskazówki dotyczące ChIP-loop:

• Unikaj nierodzimych pętli. Największym problemem napotykanym w ChIP-loop jest powstawanie nierodzimych pętli tworzących się podczas koncentracji DNA przed ligacją. Prostym sposobem na uniknięcie tego problemu jest wybór protokołu, który wykonuje wytrącanie po etapie ligacji (Simons i in., 2007).
• Walidacja interakcji ChIP-loop. Innym wyzwaniem w ChIP-loop może być dokładna kwantyfikacja produktów ligacji. Technologie 3C, zwłaszcza ChIP-loop, często wychwytują przypadkowe interakcje. Aby temu zapobiec, należy rozważyć równoległe wykonanie eksperymentu ChIP i wykorzystanie go do walidacji interakcji ChIP-loop. Jeśli interakcja DNA-białko-DNA zidentyfikowana przez ChIP-loop jest rzeczywiście prawdziwa, to obie interakcje DNA-białko powinny również pojawić się w danych ChIP (Simons i in., 2007).

Hi-C

Hi-C amplifikuje produkty ligacji z całego genomu i ocenia ich częstotliwość przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Hi-C jest doskonałym wyborem, gdy wymagane jest szerokie pokrycie całego genomu, a rozdzielczość nie ma większego znaczenia, na przykład mapowanie zmian w strukturze chromosomów w komórkach nowotworowych (Lieberman-Aiden i in., 2009).

Pomocne wskazówki Hi-C:

• Optymalizacja amplifikacji biblioteki. Amplifikacja biblioteki Hi-C musi generować wystarczającą ilość produktu do analizy, jednocześnie unikając artefaktów PCR. Aby to osiągnąć, liczba cykli PCR powinna być zoptymalizowana (w zakresie 9-15 cykli). Jeśli nie można wytworzyć wystarczającej ilości produktu (50 ng DNA), należy raczej połączyć wiele reakcji PCR niż zwiększać liczbę cykli, pięć reakcji jest zazwyczaj wystarczających (Belton i in., 2012).
• Zrównoważone długości odczytów. Jak w przypadku każdego eksperymentu sekwencyjnego, najważniejsza jest wysoka jakość odczytów. Długość odczytu musi być optymalna, aby zrównoważyć potrzebę długich odczytów do mapowania interakcji, ale nie za długich, aby przejść przez złącze ligacyjne do fragmentu partnera. Dlatego w większości przypadków optymalne są odczyty o długości 50 bp (Belton i in., 2012).
• Należy wybrać odpowiedni rozmiar bin. Ma to krytyczne znaczenie dla analizy danych. Rozmiar binów powinien być odwrotnie proporcjonalny do liczby oczekiwanych interakcji w danym regionie. Użyj mniejszych binów dla częstszych interakcji wewnątrzchromosomalnych i większych dla rzadszych interakcji międzychromosomalnych (Belton i in., 2012).

Capture-C

Capture-C wykorzystuje kombinację technologii 3C i technologii wychwytywania oligonukleotydów (OCT), wraz z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości do badania setek loci jednocześnie. Capture-C jest idealny, gdy wymagana jest zarówno wysoka rozdzielczość, jak i skala genomiczna. Na przykład, analizując funkcjonalny wpływ każdego SNP w genomie związanego z chorobą na lokalną strukturę chromatyny (Hughes i in., 2014).

Pomocne wskazówki Capture-C:

• Starannie wybierz pozycje sond. Najlepiej jest umieścić sondy blisko miejsc enzymów restrykcyjnych, nawet nakładając je na siebie, gdy jest to możliwe (Hughes i in., 2014).
• Zachowaj złożoność bibliotek. Utrzymanie złożoności biblioteki jest najwyższym priorytetem. Złożona biblioteka oznacza więcej wysokiej jakości interakcji na wyjściu. Z tego powodu należy unikać wszystkiego, co mogłoby zmniejszyć złożoność biblioteki, jak np. wychwyt biotyny Hi-C (Hughes i in., 2014).
• Uważaj na fałszywe interakcje w zduplikowanych regionach. Proces mapowania może stymulować silne interakcje między tymi regionami (takie jak pseudogeny), które w rzeczywistości są artefaktami (Hughes et al., 2014)

Belton JM, McCord RP, Gibcus JH, Naumova N, Zhan Y and Dekker J (2012). Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods, 58, 268-76.

Dekker J, Rippe K, Dekker M and Kleckner N (2002). Capturing chromosome conformation. Science, 295, 1306-1311.

Dekker J. (2006). The three 'C’ s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21.

Dostie J i Dekker J (2007). Mapowanie sieci fizycznych oddziaływań między elementami genomu przy użyciu technologii 5C. Nat Protoc, 2, 988-1002.

Dostie J, Zhan Y i Dekker J (2007). Chromosome conformation capture carbon copy technology. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.14.

Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat Genet, 37, 31-40.

Fullwood MJ, et al. (2009). An estrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature, 462, 58-64.

Lieberman-Aiden E, et al. (2009). Kompleksowe mapowanie interakcji dalekiego zasięgu ujawnia zasady składania ludzkiego genomu. Science, 326, 289-293.

Hughes JR (sierpień 2014). Email interview.

Hughes JR, et al. (2014). Analiza setek krajobrazów cis-regulacyjnych w wysokiej rozdzielczości w pojedynczym, wysokowydajnym eksperymencie. Nat Genet, 46, 205-212.

Simonis M, Kooren J and de Laat W (2007). An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat Methods, 11, 895-901.

van de Werken H, de Vree PJ, Splinter E, Holwerda SJ, Klous P, de Wit E i de Laat W (2012). Technologia 4C: protokoły i analiza danych. Methods Enzymol, 513, 89-112

.