CHAPTER 1

EtsuoNiki*a and KouichiAbeb
a University of Tokyo, Research Center for Advanced Science and Technology (RCAST), Komaba, Tokyo 153-8904, Japan. E-mail: [email protected]
b SSCI Laboratories, Faculty of Pharmacology, Musashino University, Nishi-Tokyo-Shi, Tokyo 202-0023, Japan.

Witamina E to zbiorcza nazwa lipofilnych, naturalnie występujących związków, których struktura molekularna składa się z pierścienia chromanolu z łańcuchem bocznym zlokalizowanym w pozycji C2 i obejmuje cztery tokoferole i cztery tokotrienole. Witamina E, odkryta jako czynnik żywieniowy niezbędny do prawidłowej reprodukcji, jest obecnie uznawana za główny antyoksydant zmiatający wolne rodniki u ludzi i chroniący cząsteczki biologiczne przed szkodliwymi modyfikacjami oksydacyjnymi. Podsumowano struktury i właściwości homologów witaminy E oraz ich źródła, funkcje i zastosowania.

1.1 Wprowadzenie

W 1922 roku Evans i Bishop wykazali istnienie dotychczas nierozpoznanego czynnika żywieniowego niezbędnego do normalnej reprodukcji u szczura.1. Przyjęto w tym czasie, że najbardziej uderzające funkcji witaminy E było zapewnienie normalnej ciąży w ciąży szczura, aby zapobiec resorpcji zarodków, które niezmiennie występuje w jego braku.2 Ten nieznany czynnik diety X stwierdzono, że jest obecny w zielonej sałacie, suszone liście lucerny, pszenicy i owsa. Evans wyizolował czynnik X z oleju z kiełków pszenicy, podał wzór chemiczny C29H50O2 i zaproponował nazwę α-tokoferol w 1936.3 Wzór strukturalny dla α-tokoferolu został dostarczony przez Fernholz w 1938.4 Tocotrienols zostały odkryte znacznie później niż tokoferol i nazwane na początku 1960s.5,6

Olcott stwierdził, że frakcje lipidowe olejów roślinnych zawierały przeciwutleniacze przeciwko utleniającej degradacji smalcu.7. Od tego czasu jednoznacznie wykazano, że witamina E działa jako istotny przeciwutleniacz in vivo oraz in vitro i odgrywa ważną rolę w zapobieganiu szkodliwym uszkodzeniom oksydacyjnym cząsteczek biologicznych.8-11 Ostatnio wiele uwagi poświęcono również nieutleniającym funkcjom witaminy E, w tym sygnalizacji komórkowej, regulacji genów, procesom błonowym i funkcjom nerwowym.12-14 Jednak wiele kwestii pozostaje nadal kontrowersyjnych i nie zostało wyjaśnionych. Rzetelne informacje oparte na solidnych dowodach chemicznych są niezbędne do zrozumienia roli witaminy E in vivo, jak również in vitro.

1.2 Homologi: Nomenklatura i Struktura

Witamina E jest substancją pochodzenia roślinnego, rozpuszczalną w lipidach, której struktura molekularna składa się z pierścienia chromanolu z łańcuchem bocznym umieszczonym w pozycji C2. Witamina E odnosi się do grupy ośmiu różnych związków: α-, β-, γ-, i δ-tokoferoli i odpowiadających im czterech tokotrienoli. Cztery tokoferole mają nasycony fitylowy łańcuch boczny, podczas gdy tokotrienole mają nienasycony izoprenylowy łańcuch boczny zawierający trzy wiązania podwójne przy C3′, C7′ i C11′. Wiązania podwójne w łańcuchach bocznych tokotrienoli w C3′ i C7′ mają konfigurację trans. Formy α-, β-, γ- i δ- różnią się w odniesieniu do liczby i pozycji grup metylowych na pierścieniu chromanolu. Formy α tokoferolu i tokotrienolu mają trzy grupy metylowe w pozycjach C5, C7 i C8 pierścienia chromanolu, podczas gdy formy β- i γ- mają dwie, a formy δ- jedną grupę metylową, jak pokazano na rysunku 1.1.

Oprócz tokoferoli i tokotrienoli, w przyrodzie znaleziono również tocomonoenole i tocodienole zawierające odpowiednio jedno i dwa podwójne wiązania nienasycone. Na przykład, tocomonoenol z pojedynczym podwójnym wiązaniem przy węglu 11′, 2,5,7,8-tetrametylo1-2-(4′,8′,12′-trimetylotrideca-11′-enyl)-6-chromanol, został wyizolowany z oleju palmowego i oleju z otrębów ryżowych.15 Od tego czasu kilka grup wykryło tocomonoenole w roślinach i żywności roślinnej, takie jak α-tocomonoenol w oleju palmowym,16-22 oleju z pestek dyni (Cucurbita pepo L.),23 i oleju słonecznikowym (Helianthus annuus),24 γ-tokomonoenol w oleju z pestek dyni,22,23 δ-tokomonoenol w kiwi (Actinidia chinensis),25 oraz β-, γ-, i δ-tokomonoenol w liściach Kalanchoe daigremontiana i Phaseolus coccineus.26. Tocomonoenol z nienasyconym zakończeniem łańcucha izoprenoidowego został również znaleziony w tkankach łososia.27 Ponadto, tocodienole z dwoma podwójnymi wiązaniami przy węglu 7′ i 11′ zostały zidentyfikowane w oleju palmowym.16,21

Tokoferole zawierają trzy chiralne węgle, jeden przy C2 w pierścieniu chromanolu i dwa w łańcuchu bocznym przy C4′ i C8′. Naturalnie występujący α-tokoferol zawiera chiralne węgle w konformacji R, 2R, 4′R i 8′R-α-tokoferol. α-Tokotrienol ma jedno centrum chiralne przy C2 w pierścieniu chromanolu i naturalne tokotrienole występują jako izoforma R. Z drugiej strony, w wyniku chemicznej syntezy α-tokoferolu powstaje równomolowa mieszanina ośmiu różnych stereoizomerów: RRR, SRR, RSR, RRS, RSS, SSR, SRS i SSS. Syntetyczny α-tokoferol nazywany jest all-rac-α-tokoferolem. Równomolowa mieszanina RRR-α-tokoferolu i SRR-α-tokoferolu nazywana jest 2-ambo-α-tokoferolem. Nazwy IUPAC RRR-α-tokoferolu i RRR-α-tokotrienolu to odpowiednio (2R)-2,5,7,8-tetrametylo-2-chroman-6-ol i (2R)-2,5,7,8-tetrametylo-2–3,4-dihydrochromen-6-ol.

Przygotowano formy estrowe tokoferolu i tokotrienoli, w tym octan, nikotynian, bursztynian i fosforan, a także zbadano ich działanie i potencjalne zastosowania. Witamina E łatwo ulega utlenieniu pod wpływem ciepła, światła i w warunkach alkalicznych, ale estry są mniej podatne na utlenianie i dlatego są bardziej odpowiednie do zastosowań w żywności, kosmetykach i farmaceutyce niż jej wolna forma. Koniugaty glikolu polietylenowego z tokoferolami i tokotrienolami mają zdolność do tworzenia mieszalnych miceli w wodzie ze względu na właściwości amfifilowe i zwiększają biodostępność u zwierząt i ludzi poprzez poprawę ich rozpuszczalności w wodzie i absorpcji.28 Zgłoszono, że bursztynian RRR-α-tokoferylu glikolu polietylenowego 1000 działał jako bezpieczna i skuteczna forma witaminy E w celu odwrócenia lub zapobiegania niedoborowi witaminy E podczas przewlekłej cholestazy dziecięcej.29

1.3 Właściwości fizykochemiczne

Tokoferole są lepkimi olejami w temperaturze pokojowej, nierozpuszczalnymi w wodzie, ale rozpuszczalnymi w etanolu i rozpuszczalnikach aprotycznych. Witamina E jest lekko żółtym do bursztynowego, prawie bezwonnym, klarownym, lepkim olejem, który ciemnieje pod wpływem powietrza lub światła w wyniku utleniania. Właściwości fizykochemiczne α-tokoferolu, najbardziej obfitej i aktywnej formy witaminy E u ludzi, podsumowano w tabeli 1.1.30 Temperatura topnienia RRR-α-tokoferolu wynosi 3°C. Rotacje optyczne tokoferoli są bardzo małe i zależą od rodzaju rozpuszczalnika. Widma absorpcji w ultrafiolecie tokoferoli i tokotrienoli w etanolu wykazują maksimum absorpcji przy 292-298 nm, natomiast widma w podczerwieni wykazują rozciąganie OH (2,8 ± 3,0 µm) i CH (3,4 ± 3,5 µm) oraz charakterystyczne pasmo przy 8,6 µm. α-Tokoferol jest fluorescencyjny z maksimum emisji około 325 nm w roztworze hydrofobowym. Energia dysocjacji wiązania O-H α-tokoferolu wynosi 77,1 kcal mol-1.31 Wartości pKa dla α-, β-, γ- i δ-tokoferolu w roztworze micelarnym podano odpowiednio jako 13,1, 12,8, 12,7 i 12,6.32

Współczynnik podziału α-tokoferolu wynosi 12,2, natomiast kwasu askorbinowego -1,85,30 co wskazuje na ich odpowiednio lipofilowy i hydrofilowy charakter.

1.4 Źródła

Liczne pokarmy dostarczają witaminy E. Nasiona i owoce są jednym z najlepszych źródeł witaminy E. Zielone warzywa liściaste są również ważnym jej źródłem. Tylko rośliny i organizmy fotosyntetyzujące są w stanie syntetyzować witaminę E.33,34 Synteza jest ułatwiona przez enzymy do produkcji stereospecyficznych tokoferoli: RRR-tokoferoli.35 Tokoferole i tokotrienole mogą być ekstrahowane i oczyszczane lub koncentrowane z olejów roślinnych i innych materiałów roślin wyższych. Suplementy diety są kolejnym źródłem witaminy E. Większość suplementów witaminy E zawiera znacznie większe ilości witaminy E niż żywność. Witamina E w suplementach diety i żywności wzbogaconej jest często estryfikowana w celu przedłużenia okresu trwałości przy jednoczesnej ochronie jej właściwości przeciwutleniających.

Zawartość i skład tokoferoli i tokotrienoli w olejach naturalnych różni się znacznie w zależności od gatunku rośliny, a nawet w obrębie tego samego gatunku. Tokoferole są szeroko rozpowszechnione w roślinach wyższych, podczas gdy tokotrienole występują tylko w niektórych tkankach niefotosyntetyzujących. Przykładowe zawartości w naturalnych olejach jadalnych, zaczerpnięte z kilku doniesień36-41, przedstawiono w tabeli 1.2. α-tokoferol jest głównym tokoferolem w olejach palmowym, oliwkowym i słonecznikowym, natomiast zawartość γ-tokoferolu w niektórych olejach jadalnych, takich jak kukurydziany, rzepakowy i sojowy, jest wyższa niż α-tokoferolu.

Głównymi źródłami tokotrienoli są palma, ryż i annato, stosunek tokoferolu do tokotrienolu w każdym z nich wynosi 25 : 75, 50 : 50 i 0,1 : 99,9, odpowiednio.42 Olej palmowy zawiera znaczne ilości α-, γ-, i δ-tokotrienoli. γ-tokotrienol jest główną izoformą witaminy E w oleju ekstrahowanym z otrębów ryżowych39,43 podczas gdy β-tokoferol jest jedną z głównych izoform występujących w oleju z kiełków pszenicy.36,37 Co ciekawe, frakcja lipidowa nasion annato (Bixa orellana L.) zawierała tylko tokotrienole, głównie δ-tokotrienol, ale nie zawierała tokoferoli.44

1.5 Synteza chemiczna

Ze względu na szerokie zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i kosmetycznym, na całym świecie produkuje się rocznie około 35 000 ton witaminy E.45 All-racemic-α-tocopherol, all-rac-α-tocopherol, równomolowa mieszanina wszystkich ośmiu stereoizomerów, jest przemysłowo najważniejszym produktem i jest przygotowywany w drodze całkowitej syntezy lub pochodzi ze źródeł naturalnych. Jest on stosowany głównie jako ester octanowy. Synteza przemysłowa składa się z trzech głównych części: przygotowania 2,3,5-trimetylohydrochinonu, produkcji składnika łańcucha bocznego i reakcji kondensacji.45

Czysty RRR-α-tokoferol jest chemicznie przygotowywany w drodze półsyntezy. Oleje roślinne rafinowane na dużą skalę i izolowane przez połączenie kilku metod separacji zawierają mieszaniny RRR-tokoferoli, które są przekształcane w RRR-α-tokoferol przez reakcje permetylacji. Wysiłki i strategie syntezy tokoferoli i tokotrienoli zostały szczegółowo opisane.45

1.6 Analiza

Produkty naturalne zawierają mieszaniny izomerycznych tokoferoli i tokotrienoli wraz z niewielkimi ilościami tocomonoenoli i tocodienoli. Są one metabolizowane i utleniane w celu wytworzenia wielu rodzajów związków. Próbki biologiczne zawierają skomplikowane mieszaniny izoform witaminy E oraz ich metabolitów i produktów utleniania. Identyfikacja i oznaczanie ilościowe izoform witaminy E i ich produktów są ważne dla wyjaśnienia ich roli i funkcji. Przygotowanie próbki jest najbardziej czasochłonnym i najważniejszym etapem analizy, ponieważ jest głównym źródłem błędów. Opisano wiele metod analitycznych, w tym kolorymetryczne, fluorometryczne, chromatografię gazową (GC), wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC),46 GC-MS,47 i HPLC-MS47,48 (patrz również Rozdział 2). Jeśli chodzi o dokumenty publiczne dotyczące metody ilościowego oznaczania witaminy E w aktywnych składnikach farmaceutycznych, Farmakopea Amerykańska i Europejska przyjmują metodę GC, natomiast Farmakopea Japońska metodę HPLC. Każda z tych metod ma swoje zalety i wady. Obecnie, metody HPLC są najczęściej stosowane.

Warunki HPLC dla analizy witaminy E zostały podsumowane w kilku przeglądach.46,47,49,50 Witamina E i jej produkty są uzyskiwane z produktów naturalnych, matryc żywnościowych i próbek biologicznych poprzez bezpośrednią ekstrakcję, ekstrakcję w fazie stałej i zmydlanie. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć artefaktowego utleniania i rozkładu podczas przygotowywania próbek i analizy. Zastosowanie detekcji elektrochemicznej (amperometrycznej), fluorometrycznej (Ex. 290-295 nm, Em. 320-330 nm) lub MS jest znacznie bardziej czułe i specyficzne niż konwencjonalna detekcja UV. Tocol, 2-metylo-2-(4,8,12-trimetylotridecylo)-6-chromanol, może być najlepszym związkiem do wykorzystania jako wzorzec wewnętrzny, ponieważ jego właściwości są podobne do witaminy E. Znakowany deuterem octan α-tokoferolu jest powszechnie stosowany jako wzorzec w analizie MS. W większości analiz witaminy E, jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) jest używana w trybie jonizacji dodatniej. Można zauważyć, że nadkrytyczna chromatografia cieczowa wykorzystująca CO2 i etanol jako fazę ruchomą, NH2 jako fazę stacjonarną i spektrometrię mas do wykrywania i kwantyfikacji homologów witaminy E została zaproponowana jako „bardziej ekologiczna” strategia analityczna.51,52

1.7 Funkcje i zastosowania

Witamina E jest fizjologicznie niezbędnym mikroelementem i została zastosowana w różnych dziedzinach, w tym w medycynie, farmacji, kosmetyce i żywności. Przyjmuje się, że witamina E odgrywa ważną rolę w promocji zdrowia i zapobieganiu i/lub leczeniu niektórych chorób i zaburzeń. Dzienne zalecane spożycie wynosi 15 mg (22,4 IU, jednostka międzynarodowa) dla dorosłych.

Wykazano lub zaproponowano wiele funkcji witaminy E, w tym (1) przeciwutleniacz przez zmiatanie wolnych rodników, zwłaszcza rodników peroksylowych i tlenu singletowego, (2) stabilizacja błony przez tworzenie kompleksów z cząsteczkami destabilizującymi, tak aby zapobiec zakłóceniom równowagi amfipatycznej w strukturze, (3) fizjologiczny regulator aktywności enzymów, sygnalizacji komórkowej, proliferacji komórek i ekspresji genów, co nie jest bezpośrednio związane z działaniem antyoksydacyjnym, (4) hamowanie krzepnięcia płytek krwi, (5) zapobieganie chorobom, w tym zaburzeniom neurologicznym, chorobom układu krążenia, związanym z wiekiem uszkodzeniom oczu i skóry oraz bezpłodności, a także (6) biokompatybilny modyfikator biomateriałów i wyrobów medycznych, na przykład w polietylenie o wysokiej masie cząsteczkowej stosowanym w implantach stawu biodrowego i kolanowego. Argumentowano, że tokotrienole posiadają dodatkowe pozytywne efekty zdrowotne poza tymi z tokoferoli, w tym, na przykład, indukcja odpowiedzi immunologicznej i obniżenie poziomu cholesterolu w surowicy.53-55

Wśród tych funkcji, rola witaminy E jako przeciwutleniacza przeciwko peroksydacji lipidów spowodowanej przez wolne rodniki została jednoznacznie wykazana i wydaje się, że jest to najważniejsza fizjologiczna funkcja tej witaminy. Witamina E hamuje również utlenianie powietrza w żywności, olejach i materiałach przemysłowych, przedłużając ich żywotność. Fizjologiczne znaczenie innych funkcji, które nie są związane z funkcją antyoksydacyjną, musi zostać ustalone w przyszłych badaniach.

Witamina E jest szeroko stosowana jako suplement diety, sama lub wraz z innymi mikroelementami, takimi jak witamina C, w celu promowania zdrowia i zmniejszenia ryzyka lub zapobiegania chorobom, które, jak się zakłada, powstają w wyniku szkodliwej modyfikacji oksydacyjnej cząsteczek biologicznych. Witamina E jest stosowana do wzbogacania niektórych produktów spożywczych i napojów.

Niedobór witaminy E jest rzadki, ponieważ typowe diety wydają się zapewniać wystarczające ilości, chociaż niedożywienie i zaburzenia genetyczne mogą powodować niedobór witaminy E. Wcześniaki o bardzo niskiej masie urodzeniowej mogą mieć niedobór witaminy E. Ponadto osoby z zaburzeniami wchłaniania tłuszczu56 i dziedzicznymi zaburzeniami, w których wątrobowe białko transferowe α-tokoferolu (α-TTP) jest uszkodzone lub nieobecne57 lub występuje obniżony poziom selenoprotein58 są bardziej narażone na niedobór witaminy E i wymagają dużych dawek uzupełniającej witaminy E.

Zwrócono uwagę na potencjalną rolę witaminy E w zwalczaniu chorób przyzębia,59 niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby,60 i sarkopenii61. Niewystarczające spożycie mikroskładników odżywczych (witamin i fosforu) było istotnie związane z ciężkością choroby przyzębia.62 Przegląd systematyczny wykazał znaczącą poprawę parametrów przyzębia przez witaminę E i likopen.63 Witamina E może łagodzić związane z wiekiem zaburzenia funkcji szkieletu i zwiększać regenerację mięśni, zmniejszając w ten sposób sarkopenię.64

Słaba rozpuszczalność witaminy E w wodzie znacznie ograniczyła jej zastosowanie. Badania mające na celu poprawę zarówno doustnej, jak i miejscowej enkapsulacji i formulacji witaminy E były szeroko prowadzone, a różne systemy dostarczania witaminy E zostały opracowane w celu przezwyciężenia tego problemu i zwiększenia rozpuszczalności, przenikania i biodostępności. Liposomy,67 nanoemulsje i nanocząstki lipidowe68 to tylko niektóre przykłady.69 Ester tokoferylu glikolu polietylenowego i fosforan tokoferylu są rozpuszczalne w wodzie. Badano również polietylenowe koniugaty tokotrienoli.28

Dietetyczne polifenole, takie jak kwercetyna, są przekształcane do glukozydowych i/lub siarczanowych pochodnych lub ich O-metylowych pochodnych podczas wchłaniania do organizmu i występują jako te sprzężone metabolity w krwi krążącej. Nie opisano powstawania metabolitów tokoferolu, takich jak glukozyd, pochodne siarczanowe i O-metylowe in vivo, ale glukozyd α-tokoferolu został zsyntetyzowany z 2-hydroksymetylo-2,5,7,8-tetrametylochroman-6-olu i maltozy w wyniku transglikozylacji przy użyciu α-glukozydazy z Saccharomyces species.70 Glikozylowany produkt, 2-(α-d-glukopiranozylo)metylo-2,5,7,8-tetrametylochroman-6-ol, jest rozpuszczalny w wodzie i działa jako antyoksydant zmiatający rodniki.70,71 Otrzymano glukozyd δ-tokoferolu i badano jego działanie podczas stosowania miejscowego na skórę.72

Jednym z ważnych pytań jest to, czy każda izoforma witaminy E pełni swoją specyficzną funkcję, która nie jest wspólna z innymi izoformami. Argumentowano, że tokotrienol pełni pewne funkcje, których nie pełni tokoferol, oraz że tokoferol zakłóca takie funkcje tokotrienolu.42 Te ważne kwestie muszą zostać wyjaśnione w przyszłych badaniach.

1.8 Stabilność

Witamina E jest stabilna w temperaturze otoczenia, ale łatwo ulega utlenieniu w wysokiej temperaturze, pod wpływem światła lub w środowisku alkalicznym. Smażenie jest jedną z najbardziej powszechnych metod przygotowywania żywności i podczas procesu smażenia, zwykle w temperaturze 160-190 °C, witamina E utlenia się, dając skomplikowane mieszaniny produktów, w tym tokoferol (5,6-tokoferyldion) i dimery, które, jak się przypuszcza, powstają w wyniku rekombinacji rodników tokoferoksylowych. α-Tokoferol jest utleniany do rodnika α-tokoferoksylowego przez jony metali przejściowych, takich jak jony żelazowe (Fe3+) i jony miedziowe (Cu2+).