Atesty lucyferazowe

Zrozumienie, w jaki sposób promotor lub element odpowiedzi może kontrolować ekspresję genu jest łatwiejsze, gdy jest badane za pomocą genu reporterowego. Enzymy lucyferazowe są idealnie dostosowane do testów reporterowych z prostą detekcją opartą na świetle i wysoką czułością, która może określić ilościowo nawet małe zmiany w ekspresji. Chociaż testy reporterowe są często wykorzystywane do oceny zmian w aktywności promotora, mogą być również stosowane do badania transdukcji sygnału, funkcji białka, regulacji miRNA, a nawet pomiaru procesów w żywych organizmach w czasie rzeczywistym.

Podstawą testu reporterowego jest wektor, który przenosi gen reporterowy, oraz odczynniki detekcyjne, które dostarczają substratu do przekształcenia aktywności enzymu lucyferazy w sygnał świetlny. Odczynniki do detekcji podwójnej lucyferazy wygaszają pierwszy sygnał reportera przed odczytem drugiego, aby umożliwić sekwencyjny pomiar dwóch reporterów z tej samej próbki. Drugi reporter jest często włączany jako kontrola wewnętrzna dla dokładniejszych danych.

Po wybraniu wektora reportera i sklonowaniu wszelkich elementów (jeśli są potrzebne), wektor jest wprowadzany do hodowanych komórek, zwykle przy użyciu metod opartych na transfekcji, wyrażany i wykrywany za pomocą odczynników litycznych (punkt końcowy) lub odczynników z żywymi komórkami do pomiaru zmian w tych samych komórkach w czasie. Testy reporterowe lucyferazy mogą być multipleksowane z innymi testami w celu oceny apoptozy, metabolizmu i innych. Pomiar testów lucyferazowych jest zwykle wykonywany przy użyciu luminometru opartego na płytkach.