Apoenzym

5.11.3 Rola białka-Interakcje pomiędzy enzymem, koenzymem i substratem

We wszystkich przypadkach, koenzym jest związany z apoenzymem bez głębokiej zmiany w widmie absorpcji. Ta obserwacja sugeruje, że enzym nie zniekształca pierścienia korinowego z jego konformacji w stanie podstawowym w roztworze. Jednak na podstawie widma absorpcji UV kompleksu koenzym-białko nie ma informacji o tożsamości ligandu α-aksjalnego. Badania wykazały, że α-osiowy ligand 5,6-dimetylobenzimidazolowy jest zastąpiony łańcuchem bocznym histydyny z odpowiedniego białka w co najmniej trzech enzymach zależnych od kobalaminy: syntazie metioninowej,4,7 mutazie metylomalonylo-CoA,8,45,46 i mutazie glutaminianowej.47. W przeciwieństwie do tego ligand 5,6-benzimidazolowy z kobalaminy nadal zajmuje α-osiową pozycję ligandu w AdoCbl związanym z dehydrazą diolową48 i reduktazą rybonukleotydową (patrz rozdział 5.08).

Aby umożliwić koordynację przez łańcuch boczny histydyny, „pętla nukleotydowa” bazy 5,6-dimetylobenzimidazolowej, rybofuranozylofosfodiester i łańcuch boczny propionamidu muszą odchylać się od pierścienia korrynowego i wstawiać do kieszeni wiążącej w obrębie białka. Sekwencja konsensusowa DxHxxG została zidentyfikowana w enzymach zależnych od kobalaminy, które zastępują łańcuch boczny histydyny ligandem α-aksjalnym.7,49,50 Histydyna koordynująca z atomem kobaltu z pewnością oddziałuje z resztą asparaginianową poprzez wiązanie wodorowe. Poza rolą liganda koordynacyjnego, dokładna funkcja dyady His/Asp jako modulatora aktywności enzymatycznej nie jest jeszcze jasna.49 Inne reszty w miejscu aktywnym mogą również uczestniczyć w rozbudowanej sieci wiązań wodorowych w celu kontrolowania reaktywności w centrum metalu.7

Adenozylokobalaminozależne enzymy muszą zwiększyć szybkość homolizy wiązania CoC o co najmniej współczynnik 1012, aby osiągnąć obserwowaną szybkość katalizy.14 Labilizacja adenozylokobalaminy wymaga osłabienia wiązania CoC, aby umożliwić rozszczepienie homolityczne. Chociaż nie jest to udowodniona koncepcja w enzymach zależnych od kobalaminy, wystarczająca energia do zniekształcenia (osłabienia) wiązania CoC może łatwo pochodzić z wykorzystania nadmiaru energii wiązania, która pochodzi z wielu oddziaływań wiązań wodorowych z kofaktorem kobalaminy, w tym bocznych łańcuchów amidowych, które zdobią pierścień korrynowy.51 Boczne łańcuchy amidowe są również ważnymi elementami rozpoznawczymi dla wiązania z nieenzymatycznymi białkami transportującymi kobalaminę: transkobalaminą, haptokoryną i czynnikiem wewnętrznym.52 Usunięcie lub chemiczna derywatyzacja określonych amidowych łańcuchów bocznych zmienia wiązanie z transkobalaminą o 3-40 razy52 , a całkowite usunięcie bocznego łańcucha c-amidowego umożliwia wprowadzenie dodatkowego wiązania podwójnego w szkielecie makrocyklicznym, spłaszczając w ten sposób pierścień korrinowy z towarzyszącym czerwonym przesunięciem maksimum absorpcji.53

Oprócz promowania pożądanej reakcji, enzymy zależne od adenozylokobalaminy pełnią drugą ważną funkcję, zapobiegając niepożądanym reakcjom ubocznym, które często towarzyszą reakcjom rodnikowym.54 Ta funkcja negatywnej katalizy54 wymaga silnie ograniczonej powierzchni energii swobodnej, którą można wyobrazić sobie jako głęboki kanion, przez który reakcja przebiega wzdłuż powierzchni energii swobodnej. Kanion ten musi mieć strome ściany, aby zapobiec reakcjom ubocznym i ograniczyć wysoce reaktywny rodnik pośredni. Na końcu sekwencji reakcji, rodnik pośredni jest wygaszany przez rekombinację rodnika 5′-deoksyadenozylowego i kob(II)alaminy, co powoduje odtworzenie stanu podstawowego (spoczynkowego) kofaktora adenozylob(III)alaminy. Jeśli enzym zainwestuje 25 kcal mol-1, aby promować homolizę wiązania C-Co w celu rozpoczęcia cyklu katalitycznego, energia ta musi zostać odzyskana na końcu sekwencji reakcji. Odzyskanie energii nie będzie możliwe, jeśli dojdzie do niepożądanej sekwencji rearanżacji, w wyniku której powstanie rodnik, który jest termodynamicznie bardziej stabilny niż rodnik 5′-deoksyadenozylowy. Dlatego enzym musi zapobiegać rearanżacji rodnika alkilowego do niskoenergetycznego pośrednika lub migracji przez rusztowanie białkowe w celu utworzenia stabilnego rodnika, który nie może uczestniczyć w katalizie.55

Gatunek paramagnetyczny nie tworzy się dopóki wszystkie składniki reakcji są obecne w kompleksie enzym-substrat, ponieważ utworzenie rodnika pochodzącego z koenzymu przy braku substratu mogłoby prowadzić do niepożądanych reakcji ubocznych. Eksperymenty EPR z mutazą metylomalonylo-CoA46,55 potwierdzają, że homoliza wiązania CoC zachodzi dopiero po dodaniu substratu, na co wskazuje pojawienie się sygnału EPR podobnego do produktu.46 Podobnie, eksperymenty spektrofotometryczne w zatrzymanym przepływie z liazą amoniakalną etanoloaminy pokazują, że sygnatura kob(II)alaminy pojawia się w widmie widzialnym dopiero po połączeniu enzymu i koenzymu z nasycającym poziomem substratu.56-59

Fotoliza, termoliza i promowana enzymatycznie homoliza wiązania CoC adeno- sylkobalaminy prowadzi do powstania singletowej pary rodnikowej składającej się z kob(II)alaminy i rodnika 5′-deoksyadenozylowego.60,61 Ponieważ wszystkie te procesy prowadzą do powstania tej samej pary rodnikowej, informacje pochodzące z dynamiki reakcji w badaniach fotolizy mogą być powiązane z proponowanymi mechanizmami reakcji enzymatycznej. Fotohomoliza adenozylokobalaminy rozpoczyna się od elektronowej promocji π → π* w pierścieniu korrynowym i musi obejmować pośredni stan przeniesienia ładunku na drodze do homolizy wiązania CoC.60,61 Pikosekundowe badania fotolizy adenozylokobalaminy ujawniają szybkość rekombinacji pary rodników geminianowych 109 s-1, z wydajnością frakcyjnej rekombinacji klatkowej, Fc, około 94%.42,62-64 Nanosekundowe i ciągłe badania fotolizy kobalamin potwierdzają wydajną rekombinację pary rodników w klatce geminianowej, z ogólną fotochemiczną wydajnością kwantową około 20% dla adenozylokobalaminy i 35% dla metylokobalaminy.65,66 W przypadku braku enzymu, duża część par rodników geminianowych rekombinuje zanim nastąpi znaczący rozdział dyfuzyjny. Aby ustabilizować rodnik 5′-deoksyadenozylowy i promować katalizę, enzym musi zwiększyć odległość separacji par rodników, prawdopodobnie poprzez zmianę konformacyjną. Niezależnie od mechanizmu, wysoka szybkość rekombinacji geminianowej w parze rodników wymaga, aby jedną z funkcji enzymu było rozdzielenie rodników lub tymczasowe uwięzienie jednego z rodników w celu zapobieżenia przedwczesnej rekombinacji.

Pomimo że powstałe pary rodników singletowych {5′-deoksyadenozylowy rodnik:kob(II)alamina} mają identyczne stany elektroniczne,59-61,67 enzymatyczna homoliza wiązania CoC nie może uzyskać dostępu do wzbudzonego stanu elektronowego i musi rozpocząć się od innego procesu osłabiającego wiązanie CoC i przesuwającego równowagę w kierunku dysocjacji (patrz Rozdział 5.11.2). Wywołane naprężeniem rozszczepienie nie tylko spowoduje homolizę wiązania CoC, ale proces ten zwiększy również odległość separacji par rodnikowych, jeśli składowa odkształcenia wystąpi wzdłuż osi apikalnej kobaltu. To brutalne podejście do rozciągania wiązania CoC może być najbardziej efektywną metodą osiągnięcia zarówno homolizy, jak i zmniejszenia netto szybkości rekombinacji par rodnikowych.

Możliwe jest również, że enzym wzmacnia wiązanie CoC i nie sprzyja homolizie poprzez ściskanie apikalnego oddziaływania Co-α-N. Zbadano właściwości termodynamiczne analogów adenozylokobinamidu + i +.68 Silniejsze wiązanie CoC zaobserwowano w + z krótszą odległością wiązania CoN w porównaniu z pirydyną jako bazą α-aksjalną. Silniejsze wiązanie CoC prowadzi do znaczącego przesunięcia w kierunku heterolizy jako preferowanej ścieżki. W tym systemie modelowym badany enzym, mutaza metylomalonylo-CoA, musi albo zapobiegać heterolizie CoC, albo podążać ścieżką heterolityczną.68

W syntazie metioniny część kobalaminowa koryny jest umieszczona pomiędzy dwiema domenami fragmentu o masie 27 kDa, z ogonem nukleotydowym wnikającym do głębokiej kieszeni utworzonej przez reszty domeny C-końcowej.7,69,70 Sekwencja ta zawiera region o umiarkowanej hydrofobowości, który jest flankowany przez wydłużone segmenty hydrofilowe.71 Podobieństwa strukturalne są oczekiwane wśród domen, które łączą się z pierścieniem korryny. Domena α/β, która wiąże się z dolną połową pierścienia korrynowego i mieści przedłużony ogon nukleotydowy (cząsteczka fosfodiestrowa i grupa 5,6-dimetylobenzimidazolowa) w syntazie metioninowej i mutazie metylomalonylo-CoA jest również oczekiwana w mutazie glutaminianowej (vide infra).