Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Genomic structure, protein chemistry, and enzymology of alkaline phosphatase

ALP (orthophosphoric-monoester phosphohydrolase, alkaline optimum, EC 3.1.3.1) występuje w całej przyrodzie u roślin i zwierząt (McComb et al., 1979). U człowieka cztery izoenzymy ALP są kodowane przez cztery oddzielne geny (Millán, 1988, 2006; Harris, 1990; Moss, 1992). Trzy z izoenzymów wykazują zasadniczo tkankowo-specyficzną ekspresję i są określane jako ALP jelitowy, łożyskowy i zarodkowo-komórkowy (łożyskowy). Czwarty izoenzym ALP ulega ekspresji wszechobecnej i dlatego oznaczany jest jako TNSALP (Stigbrand i Fishman, 1984; Harris, 1990; Moss, 1992). Tkanka szkieletowa, wątrobowa i nerkowa są szczególnie bogate w TNSALP. Charakterystyczne właściwości fizykochemiczne (stabilność termiczna, ruchliwość elektroforetyczna, itp.) ALP oczyszczonych z ludzkich kości, wątroby i nerek są tracone pod wpływem glikozydaz (Moss i Whitaker, 1985), dlatego TNSALP stanowi rodzinę „wtórnych” izoenzymów (będę je nazywać „izoformami”). Są one kodowane przez ten sam gen, mają identyczną sekwencję polipeptydową i różnią się jedynie modyfikacjami potranslacyjnymi z udziałem węglowodanów (Harris, 1980).

Symbol mapowania genu dla TNSALP to ALPL („ALP-wątroba”), chociaż funkcja wątrobowej izoformy TNSALP nie jest znana (patrz dalej). ALPL znajduje się w pobliżu wierzchołka krótkiego ramienia chromosomu 1 (1p36.1-p34), podczas gdy geny dla jelitowych, łożyskowych i zarodkowych ALP znajdują się na wierzchołku długiego ramienia chromosomu 2 (2q34-q37) (Harris, 1990; Millán, 2006). ALPL wydaje się reprezentować gen ancestralny, podczas gdy tkankowo-specyficzne ALP powstały prawdopodobnie w wyniku duplikacji genów (Harris, 1990). ALPL jest nieco większy niż 50 kb i zawiera 12 eksonów, z których 11 jest translokowanych do postaci dojrzałego enzymu składającego się z 507 reszt aminokwasowych (Weiss i in., 1988b). Sekwencje TATA i Sp1 mogą być elementami regulatorowymi, ale podstawowa ekspresja wydaje się odzwierciedlać efekty promotora „pilnującego”, podczas gdy zróżnicowana ekspresja w różnych tkankach może być pośredniczona przez mechanizm posttranskrypcyjny (Kiledjian i Kadesch, 1990). ALPL ma dwa promotory i dwa odpowiadające im 5′ niekodujące eksony, 1a i 1b. W wyniku ich ekspresji powstają dwa różne mRNA z różniącymi się regionami 5′-nieulegającymi translacji (Nosjean i in., 1997). Transkrypcja zachodzi preferencyjnie z promotora upstream (1a) w osteoblastach i z promotora downstream (1b) w wątrobie i nerkach (Millán, 2006).

Tkankowo specyficzne geny ALP są mniejsze niż ALPL, głównie z powodu krótszych intronów. Sekwencje aminokwasów wydedukowane z ich cDNA sugerują 87% identyczność pozycyjną pomiędzy ALP łożyskową i jelitową, ale tylko 50%-60% identyczność pomiędzy tkankowo-specyficznymi ALP i TNSALP (Harris, 1990).

Sekwencja reszt aminokwasowych TNSALP wskazuje na pięć potencjalnych miejsc N-linkowanej glikozylacji (Weiss i in., 1988). N-glikozylacja jest niezbędna do aktywności katalitycznej. O-glikozylacja charakteryzuje izoformę kostną, ale nie wątrobową (Nosjean i in., 1997).

W 2000 r. struktura krystaliczna ludzkiej ALP łożyskowej została określona w rozdzielczości 1,8-Å (Le Due i in., 2000). Strona aktywna TNSALP wywodzi się z sekwencji nukleotydów zachowanej w ALP w całej przyrodzie (Henthorn i Whyte, 1992), odzwierciedla sześć eksonów i składa się z 15 reszt aminokwasowych (Zurutuza i in., 1999).

ALP są metaloenzymami Zn++ (McComb i in., 1979). Aktywność katalityczna wymaga konfiguracji multimerycznej identycznych podjednostek, przy czym każdy monomer ma jedno miejsce aktywne i dwa atomy Zn++, które stabilizują strukturę trzeciorzędową (Kim i Wycoff, 1991).

ALP są ogólnie uważane za homodimeryczne w krążeniu (McComb i in., 1979). TNSALP, w swojej symetrycznej formie dimerycznej, ma topologię αβ dla każdej podjednostki, w tym dziesięcioniciowy arkusz β w jego centrum (Hoylaerts i Millán, 1991). Jednakże w tkankach ALP są przywiązane (patrz dalej) do powierzchni komórek, być może jako homotetramery (Fedde i in., 1988).

In vitro, ALP mają szeroką specyficzność substratową i optymalne pH, które zależy od rodzaju i stężenia fosfokomponentu poddawanego katalizie (McComb i in., 1979). Aktywność katalityczna wymaga Mg++ jako kofaktora (McComb i in., 1979). Zarówno PPi, jak i fosfoestry mogą być hydrolizowane (Xu i in., 1991). Reakcja polega na fosforylacji-defosforylacji reszty serynowej. Dysocjacja kowalencyjnie związanego Pi wydaje się być etapem ograniczającym szybkość reakcji. W rzeczywistości Pi jest silnym kompetycyjnym inhibitorem ALP (McComb i in., 1979; Kim i Wyckoff, 1991; Coburn i in., 1998). Jednakże, może być również tak, że Pi stabilizuje enzym (Farley, 1991).

Nie ma pewności co do biosyntezy ALP w organizmach wyższych. Sekwencje genów ludzkich izoenzymów ALP wskazują, że powstające polipeptydy mają krótką sekwencję sygnałową składającą się z 17-21 reszt aminokwasowych (Harris, 1990) i hydrofobową domenę na ich karboksylowym końcu (Weiss i in., 1988b). Wewnątrzkomórkowa degradacja ALP może zachodzić przy udziale proteasomów (Cai i in., 1998). Niemniej jednak, te ALP łączą się z zewnętrzną powierzchnią błon plazmatycznych przywiązane do polarnej grupy czołowej cząsteczki fosfatydyloinozytolu-glikanu (Whyte i in., 1988; Whyte, 1994) i mogą być uwolnione przez fosfatydyloinozytolospecyficzną fosfolipazę (Fedde i in., 1988). Jednak ich dokładna interakcja z fosfatydyloinozytolem może różnić się w zależności od izoenzymów ALP (Seetharam i in., 1987).

Nie zawierająca lipidów ALP jest cząsteczką normalnie występującą w krążeniu. Jednak mechanizmy uwalniania ALP z powierzchni komórek nie są znane. W procesie tym może uczestniczyć fosfatydaza typu C lub D, działanie detergentów, proteoliza, frakcjonowanie błony lub lipoliza (Alpers i in., 1990).

W zdrowych mężczyznach i kobietach prawie cała aktywność ALP w surowicy lub osoczu pochodzi z w przybliżeniu równych ilości izoform kostnych i wątrobowych TNSALP (Millán i in., 1980). Niemowlęta i dzieci, szczególnie noworodki i nastolatki, mają wyższe poziomy izoformy kostnej w krwiobiegu (McComb i in., 1979). Niektóre osoby z grupami krwi B i O, które są „sekretarzami”, zwiększają niewielką ilość jelitowej ALP w krążeniu po spożyciu tłustego posiłku (Langman i in., 1966; McComb i in., 1979). Zazwyczaj jednak jelitowa ALP stanowi zaledwie kilka procent całkowitej aktywności ALP w surowicy (maksymalnie 20%) (McComb i in., 1979; Mulivor i in., 1985). Łożyskowa ALP jest zwykle wyrażana i krąży tylko podczas ostatniego trymestru ciąży (Birkett i in., 1966). Różne nowotwory uwalniają jednak do krwiobiegu ALP pochodzenia łożyskowego lub zarodkowego („placentalopodobne”) (Millán, 1988). Usuwanie krążącej ALP, podobnie jak wielu innych glikoprotein, prawdopodobnie obejmuje wychwyt i degradację przez wątrobę (Young i in., 1984).

.