Os princípios de engenharia da combinação de um laço de alimentação incoerente transcripcional com retroalimentação negativa

Um modelo de regulamentação transcripcional incoerente de alimentação incoerente

Existem quatro variedades de controle de alimentação incoerente (FF) em um sistema de três nós . Neste trabalho, estudamos o motivo do laço incoerente de alimentação Tipo 1 (I1-FFL), no qual o sinal de entrada (X) ativa tanto o intermediário (Y) quanto a saída final (Z), enquanto Y reprime Z (Fig. 1a) . O nosso modelo é de regulação transcripcional, pelo que X representa um factor de transcrição de entrada, que pode ligar-se às regiões cis-regulatórias de Y e Z, com afinidade K1 (Fig. 1b). Isto resulta na transcrição e tradução de Y (setas duplas na Fig. 1b), que também é um fator de transcrição que se liga à região reguladora de Z, com afinidade K2. Em nosso modelo, a ligação de X e Y é cooperativa (linha tracejada na Fig. 1b), de modo que sua ligação sinérgica é descrita por K12 = CK1K2. A ligação cooperativa também pode ocorrer entre outros componentes; no entanto, não é necessária uma cooperação diferente da existente entre X e Y (ver arquivo adicional 1 para análise da cooperatividade). Portanto, nós retemos apenas o termo cooperativo necessário para testar nossas hipóteses, e assim nossa análise principal assume que todas as outras interações de ligação são não-cooperativas.

Na engenharia de controle de processo, X é visto como um distúrbio ao sistema; o objetivo do controle FF padrão (que usa um motivo IFFL) é rejeitar o efeito que X tem sobre Z. Se o controlador FF for ajustado corretamente, a variável de saída é mantida no valor desejado ou próximo a ele (por exemplo dentro de 5%), tanto no transiente como na saída final (Fig. 1c). Em contraste, em sistemas biológicos, X é visto como um sinal de entrada, e o motivo I1-FFL é freqüentemente projetado para que os níveis de Z exibam uma resposta transitória, então retornem (perto de) seu valor original (Fig. 1d). Assim, a altura de pico e a diferença entre os níveis iniciais e finais de Z representam métricas de desempenho (Fig. 1d).

Aqui modelamos o I1-FFL como um sistema de equações diferenciais de atraso, que são uma extensão do modelo de (Eqs. 1-3 em Métodos). Note que X ativa tanto Y como Z, com afinidade de ligação K1, enquanto Y reprime Z (mesmo que X também esteja ligado) com afinidade de ligação K2. O termo final no denominador de fz é o termo cooperatividade (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Veja Métodos para mais detalhes sobre a derivação do modelo.

Neste trabalho, seguramos x = x0 = 1 para t < 0, o que resulta num estado inicial estável de y0 e z0. No momento t = 0, x experimenta um aumento de passos: x(t ≥ 0) = x1 > 1, o que resulta num aumento inicial tanto em y como em z. No entanto, após algum transitório inicial, o aumento em y também começa a reprimir z. Para a maioria dos valores dos parâmetros, isto resulta num valor de pico de z (zpeak), seguido de uma adaptação de volta para um novo valor em estado estacionário, z1 (Fig. 1d). Aqui, normalizamos o nível de pico e a métrica de adaptação como P ≡ (zpeak – z0)/z0 e f = (z1 – z0)/z0, respectivamente (ver Fig. 1d). Para o resto do trabalho, tomaremos τy = τz = 1, e θy = θz = 0.5.

O laço de alimentação incoerente tipo I pode ser ajustado para uma adaptação perfeita

Análise prévia do modelo acima (Eqs. 1-3) mostrou que a regulação transcripcional I1-FFL pode, sob as condições certas, agir como um detector de troca dobrável (FCD) . Uma das condições necessárias para um modelo atuar como FCD é a adaptação quase perfeita (NPA), que ocorre quando o estado final, z1, está dentro de alguns por cento do estado inicial, z0 (por exemplo, |f| ≤ ε = 0.05). Enquanto que trabalhos anteriores analisaram o modelo (Eqs. 1-3) do ponto de vista da FCD, o modelo (e I1-FFLs geralmente) pode produzir vários outros fenótipos, incluindo os fenótipos menos restritivos de adaptação e geração de pulsos.

A nossa análise do modelo mostra que é possível afinar a FFL de tal forma que a adaptação perfeita (PA) é alcançada. Em outras palavras, z1 = z0 (curva azul na Fig. 2a, b). Esta condição obtém-se quando, para dado K1, K2, o valor de C é igual a CPA, que é dado por Eq. 5 (ver Métodos). Se o valor de C se desviar ligeiramente de CPA, PA é perdido, mas NPA pode ser mantido. Aqui definimos CNPA+ e CNPA- como os valores de C em que f = + ε e -ε, respectivamente (curvas vermelha e dourada na Fig. 2a, b). Para a maioria deste trabalho, definimos ε = 0,05; entretanto, nossos resultados não são materialmente afetados pelo valor preciso de ε (ver arquivo adicional 1).

Ajuste do I1-FFL para uma adaptação quase perfeita. a Dinâmica da saída, z(t), sobre um incremento de passo em x de 1 a 10 no tempo t = 0. Curva azul: adaptação perfeita. Curvas vermelha e amarela: adaptação quase perfeita, tal que |f| = 0,05. b Saída normalizada de z(t). Quando as curvas são normalizadas, fica claro que as curvas vermelha e amarela atingem uma adaptação quase perfeita. c Mapa de calor do valor de C necessário para uma adaptação perfeita dado K1, K2, para um aumento de passo em x de 1 a 10. As curvas vermelhas (aqui e em outros lugares) representam contornos cujos valores são indicados diretamente na trama. Note que os limites dos eixos para K1 variam de forte (10- 2) a muito fraco (106) afinidade, enquanto aqueles para K2 variam de muito forte (10- 6) a fraco (102). d Mapa de calor do pico métrico, P. Como K1 se torna muito baixo, esta métrica cai para valores inaceitavelmente baixos. e Níveis absolutos do pico na produção. Curvas laranjas: P = 0,1 e CPA = 0,01. Estas curvas, juntamente com o contorno zpeak = 0,01, delimitam uma região biologicamente realista do espaço de parâmetros. f Mapa de calor da faixa normalizada de valores C sob a qual o NPA é alcançado. As curvas negras delimitam duas regiões nas quais a NPA é atingível com qualquer valor de C. Na Região I, Y e Z são desacopladas, e mudam apenas ligeiramente quando aumentam em X. A Região II é descrita como uma região FCD, que requer NPA. Na região biologicamente realista do espaço de parâmetros, os valores de C sob os quais NPA pode ser alcançado variam de 13 a 65% de CPA

Para x1 = 10, um mapa de calor dos valores de CPA, em função de K1, K2, é representado na Fig. 2c. Note que a cooperatividade é necessária para atingir PA: CPA < 1, embora se aproxime de 1 para K1, K2 ≪ 1 (ver arquivo adicional 1 e Fig. 2c). Como C representa um parâmetro de cooperatividade de troca dobrada, valores de C < 1 representam sinergia positiva: quando X está ligado à região reguladora de Z, ele aumenta a capacidade de ligação de Y, e vice-versa. Um limite inferior para valores reportados de C em outros sistemas é da ordem de 0,01 . Portanto, como os modelos de processos biológicos devem ser limitados a fenótipos biologicamente realistas, é improvável que PA possa ser alcançado na região superior direita do espaço de parâmetros (Fig. 2c).

Os valores moderados do espaço de parâmetros correspondem a fenótipos biologicamente realistas

Dado o limite inferior aproximado em C, é razoável perguntar que outras restrições podem ser colocadas no modelo. Nós impomos duas restrições biologicamente realistas adicionais ao modelo. Primeiro, o tamanho relativo do pico, P = (zpeak – z0)/z0, deve ser maior que 0,1 para garantir uma resposta de sinalização de qualidade. Um mapa de calor de P em função de K1, K2 é representado na Fig. 2d. O contorno de P = 0,1 reside aproximadamente em K1 = 0,25; isto implica que, se X liga a região reguladora de Z muito apertada, um aumento de 10 vezes em x (de 1 para 10) não produz um pico forte, uma vez que o promotor Z já está saturado, mesmo com valores baixos de x,

segundo, o pico absoluto em z deve ser maior que 0,01 (Fig. 2e). Como o nosso modelo é escalado de tal forma que o valor máximo possível de z é 1, isto corresponde a 1% da concentração máxima possível de z, dada a força do promotor e a taxa de degradação. Tomamos zpeak = 0,01 para ser o valor mínimo a fim de alcançar um sinal biologicamente detectável; no entanto, pode-se relaxar um pouco este valor mínimo, o que não afetaria significativamente nossos resultados. Tomando estas três restrições de CPA, P, e zpeak, uma pequena região do espaço de parâmetros K1, K2 é considerada “biologicamente realista”. Para o contexto, todos os três contornos são traçados na Fig. 2e. Novamente, esta região poderia ser modificada se outros valores das restrições “biologicamente realistas” fossem escolhidos. Deve-se também notar que a região biologicamente realista também delimita a região do espaço de parâmetros na qual o I1-FFL pode atuar como um gerador de pulsos ou adaptador perfeito (ver arquivo adicional 1).

Sensibilidade da NPA em relação aos parâmetros I1-FFL

Robustness é um objetivo adicional que é frequentemente imposto aos sistemas biológicos . Portanto, analisamos a faixa de valores C sobre CPA para a qual o NPA é mantido. Definimos ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, e traçamos um mapa de calor de ΔCFF/CPA na Fig. 2f (ver arquivo adicional 1 para derivação de CNPA+ e CNPA-). Existem duas regiões do espaço de parâmetros K1, K2 em que a NPA é alcançada independentemente do valor de C (ver arquivo adicional 1 e Fig. 2f), nenhuma das quais reside na região biologicamente realista do espaço de parâmetros (região branca tracejada na Fig. 2f). Na Região I, o valor de K1 é suficientemente baixo para que, mesmo em x0 = 1, as regiões reguladoras de ambos Y e Z estejam saturadas com X, e assim, Y e Z são relativamente insensíveis a X (ver arquivo adicional 1). Além disso, na Região I, K2 é suficientemente grande para que Y tenha pouca influência sobre Z. Assim, um aumento em x não altera sensivelmente o valor de z, o que significa que enquanto z1 ≈ z0 (de modo que |f| < ε), não há nenhum pico no valor de z (ver Ficheiro Adicional 1: Figura S1). Este cenário não pode ser verdadeiramente descrito como NPA. De fato, os nós da IFFL são desacoplados nesta região, de modo que o fenótipo biológico, ou função, da IFFL é indistinto de dois nós agindo independentemente um do outro.

Região II foi previamente relatado como não apenas a região na qual a NPA é facilmente alcançada, mas também onde a I1-FFL pode agir como um detector de troca dobrável (Arquivo Adicional 1: Figura S2A) . Neste regime, no qual K1 ≫ 1, K2 ≪ 1, e K1K2 < 1, a ligação de X está no regime linear, e z depende da razão de x/y . Por outro lado, a resposta absoluta de Z é limitada a 0,01% do seu máximo (arquivo adicional 1: Figura S2B).

Em contraste, na região biologicamente realista do espaço de parâmetros, ΔCFF é limitada a 13% — 65% do CPA (Fig. 2f). Por exemplo, para K1 = 1, K2 = 0,1, para manter o objetivo do NPA, o sistema pode tolerar apenas um ∼ 30% de perturbação ao CPA. Em outras palavras, o modelo I1-FFL é relativamente sensível a mudanças no C quando se trata de NPA. Para aumentar a robustez do sistema, consideramos um sistema combinado de feedforward/feedback (FF/FB).

Ciclos de feedback negativo transcricional

Em engenharia, a sensibilidade do algoritmo do controlador feedforward em relação aos parâmetros do modelo pode ser mitigada pela ação de um loop de feedback negativo (ver Eqs. 6-8 em Métodos). Na verdade, o feedback negativo tem demonstrado conferir robustez aos objetivos de desempenho I1-FFL, tais como tempo de subida e tempo de decaimento, em um modelo simplificado de regulação gênica . Entretanto, em contraste com a alta freqüência de motivos transcripcionais FFL, foi previamente relatado que não existem ciclos transcripcionais (além da auto-regulação) no organismo modelo E. coli . Outros estudos sugerem que o feedback negativo transcripcional é raro, possivelmente devido à natureza lenta dos loops transcripcionais duplos, ao mesmo tempo em que se reconhece o uso generalizado de loops negativos mistos nos quais um ramo é transcripcional e o outro ramo é baseado nas interações proteína-proteína . Para investigar mais, analisamos um conjunto de dados recentemente atualizado de interações transcripcionais de E. coli, e encontramos 17 instâncias de ciclos de duração 2, cinco das quais são de feedback positivo, nove das quais são de feedback negativo, e três delas são mistas . Destas interações, um dos ciclos de retroalimentação negativa foi incorporado dentro de múltiplas estruturas I1-FFL (ver arquivo adicional 2).

Um sistema combinado de feedforward/feedback é mais robusto do que um com feedforward sozinho

Dando a previsão sobre a eficácia de um loop FB para estender a robustez do NPA em um motivo IFFL, investigamos um sistema FF/FB combinado. Adicionamos um quarto nó, W, que é ativado por Z, e reprime Z (Fig. 3a, b). Estas interações introduzem múltiplos novos parâmetros ao modelo (ver Métodos), incluindo dois parâmetros de ligação de afinidade (K3, K4) e um atraso de transcrição/tradução em W (θw; ver Fig. 3b).

Comportamento do sistema combinado FF/FB. a A adição de W ao motivo de rede resulta num loop de feedback negativo envolvendo Z e W. b Ilustração do mecanismo de feedback negativo. Z ativa W e é reprimido por W. Ilustração de Y não mostrada (ver Fig. 1b). c Dinâmica da saída, z(t), sobre um incremento de passo em x de 1 a 10 no tempo t = 0 para o sistema FF/FB combinado. Curva azul: adaptação perfeita. Curvas vermelha e amarela: adaptação quase perfeita, tal que |f| = 0,05. d Saída normalizada de z(t). Quando as curvas são normalizadas, fica claro que as curvas vermelha e amarela estão sintonizadas para uma adaptação quase perfeita. O valor de C necessário para atingir NPA é mais distante de CPA do que para o sistema apenas FF. e Mapa de calor da faixa normalizada de valores de C sob a qual NPA é atingido. As curvas negras que delimitam as Regiões I e II são análogas àquelas descritas na Fig. 2. Na região biologicamente realista (definida para o sistema FF/FB), a faixa de valores C sob a qual NPA pode ser alcançada varia de 25 a 100% da CPA. f Mapa de Calor da razão da faixa de valores C para a qual NPA é alcançada para o sistema FF/FB versus o sistema somente FF. A adição de um loop FB aumenta a faixa de valores de C em 21–54%

Para comparar diretamente os dois sistemas, plotamos a proporção ΔCFF/ΔCFF na Fig. 3f. Para a faixa de valores biologicamente realistas, ΔCFFFB é 21% — 54% maior que ΔCFF (proporções de 1,21 — 1,54). (Note que a região biologicamente realista mostrada na Figs. 3e, f é para o sistema FF/FB; veja o arquivo adicional 1: Figura S3.). De fato, com exceção de uma pequena região de K1, espaço de parâmetros K2 (próximo à Região II), o sistema FF/FB é sempre superior ao sistema apenas FF (razão maior que uma). Dada a vantagem do sistema FF/FB em relação aos objetivos do NPA, investigamos em seguida se as propriedades dinâmicas do sistema FF/FB também eram vantajosas.

Como mencionado anteriormente, em nossa análise, tentamos reter apenas as interações necessárias para explicar o fenótipo do NPA sua robustez. Como tal, apenas as interacções entre X e Y incluíam a cooperatividade. Podemos também incorporar a cooperação entre X e W, ou Y e W, o que não afeta qualitativamente o nosso resultado que a adição do módulo FB ao I1-FFL aumenta a robustez do sistema (Arquivo adicional 1: Figura S4). Além disso, nossos resultados não dependem da escolha exata de ε (Arquivo adicional 1: Figura S5).

Análise dinâmica revela que o sistema FF/FB é superior àquele com FB sozinho

Laçadas de feedback negativas são prejudicadas por múltiplos inconvenientes . Primeiro, a realimentação proporcional (que é o mecanismo mais comum que ocorre naturalmente nos sistemas biológicos) resulta sempre em compensação (ver Fig. 4a). Em outras palavras, após um distúrbio perturbar o sistema, a saída não retorna ao seu valor original. Para mitigar isso, pode-se aumentar a força da resposta negativa de feedback. No entanto, isto resulta frequentemente no segundo maior inconveniente da retroalimentação negativa: instabilidades dinâmicas e/ou oscilações do anel podem resultar de uma retroalimentação negativa forte, especialmente em sistemas com atrasos substanciais (Fig. 4b) . Por outro lado, se o distúrbio primário puder ser parcial ou totalmente rejeitado por uma FFL, ambos os inconvenientes podem ser evitados (Fig. 4a, b). Para investigar esses princípios em um sistema de regulação gênica, comparamos o comportamento de um modelo FB apenas com um modelo FF/FB combinado. Para ilustrar a instabilidade dinâmica, fixamos o coeficiente de Hill para todas as interações de ligação de DNA em n = 2 (ver arquivo adicional 1).

Dinâmica apenas dos sistemas FB e FF/FB combinados. a A (proporcional) feedback negativo apenas (curva azul), após perturbação, resulta sempre em offset em relação ao valor original. Um sistema FF/FB combinado comparável também pode exibir offset; entretanto, o I1-FFL no sistema FF/FB pode ser ajustado para uma adaptação perfeita. O sistema FF/FB também pode ter uma abordagem mais rápida ao estado estável. b A adição de um I1-FFL ao sistema FB pode resultar em uma dinâmica mais estável. Para esta escolha de parâmetros, o sistema FB apenas é instável, enquanto o sistema FF/FB é estável. c Mapa térmico da parte real do valor próprio principal (α) para o sistema FB apenas. A curva preta é o contorno para o qual α = 0, que indica o limite de estabilidade do sistema apenas FB. Valores mais pequenos de K4 resultam num sistema instável (ver parte B). Aqui e em outros lugares, os valores de α para outros contornos (curvas vermelhas) são indicados diretamente no gráfico. d O mesmo que C, mas para o sistema combinado FF/FB. e Heatmap de Δα, a diferença entre as partes reais dos valores próprios principais para os dois sistemas. No lado direito do contorno zero, os valores de Δα são maiores que zero, indicando que o sistema FF/FB tem uma aproximação mais rápida ao estado estacionário. As curvas preta e branca indicam os limites de estabilidade apenas para os sistemas FB e FF/FB, respectivamente (ver também as partes C, D)

Para determinar a estabilidade tanto dos sistemas FB apenas como dos sistemas FF/FB combinados, calculamos α, a parte real do autovalor principal (ver arquivo adicional 1), para valores variáveis de K3, K4 (para o sistema FF/FB, definimos K1 = 1, K2 = 0,1; Fig. 4c, d). Enquanto nenhum dos sistemas é claramente superior ao outro, para ativação moderada de W por Z (K4 ≈ 0.1 ou maior), feedback fortemente negativo (K3 < 0.1) tende a resultar em um sistema instável apenas FB, enquanto o sistema FF/FB é sempre estável. De facto, αFB – αFFFB > 0 para esta região de activação moderada de W (Fig. 4e). Mesmo quando ambos os sistemas são estáveis, αFFFB < αFB implica que o sistema FF/FB atinge o estado estável mais rapidamente (ver, por exemplo, Fig. 4a). Entretanto, a adição de uma segunda camada de controle pode muitas vezes resultar em trade-offs, onde uma vantagem obtida em uma área resulta em uma desvantagem em outra. Portanto, vamos comparar a performance dos modelos FF/FB apenas e combinados com relação a dois outros objetivos: pico normalizado, P, e pico absoluto, zpeak.

Um sistema FF/FB combinado atinge comprometimento em múltiplos objetivos

Para comparar a performance do sistema FF/FB com a do sistema apenas FB, calculamos o valor de pico de z em ambos os sistemas enquanto variamos K3, K4 de 0.01 para 1. Primeiro, encontramos o pico normalizado, P, do sistema apenas FB variou de aproximadamente 0,7 a 1 (Fig. 5a). Por outro lado, o pico normalizado para o sistema FF/FB é quase independente dos valores de K3, K4 e é aproximadamente 1,256 (ver arquivo adicional 1: Figura S6). Portanto, o sistema FF/FB também supera o sistema FB apenas nesta métrica: o sistema FF/FB é uma melhoria de 30-80% sobre o sistema FB apenas (Fig. 5b).

Comparação das métricas de desempenho do sistema apenas FB com o sistema combinado FF/FB. a Heatmap of the normalized peak, P, for the FB only system. Este parâmetro (e outros definidos nesta figura) é indefinido para sistemas instáveis. b Razão de P para o sistema FF/FB para o sistema FB apenas. De acordo com esta métrica, o sistema FF/FB tem sempre um desempenho superior ao do sistema apenas FB. Entretanto, a métrica PFFFB é aproximadamente constante em 0,46, independentemente dos valores de K3, K4 (ver arquivo adicional 1). c Mapa de calor do pico absoluto, Zpeak, para o sistema FF/FB e valores variáveis de K3, K4. Note que o valor do pico absoluto é, na melhor das hipóteses, 0,06. Enquanto isto é baixo, é adequado. d Relação entre o pico absoluto para o sistema FF/FB e o de FB apenas. De acordo com esta métrica, o sistema apenas FB sempre supera o sistema FF/FB (relação inferior a um). Entretanto, dados os outros objetivos de desempenho para os quais o sistema FF/FB é superior, este é um trade-off aceitável

Uma grande desvantagem do sistema combinado é que, com dois repressores de saída (Y e W), os níveis de saída (em relação aos seus níveis máximos possíveis) são baixos. Para os valores dos parâmetros escolhidos (K1 = 1, K2 = 0,1), o zpeak permanece acima do limite inferior de 0,01 (ver Fig. 2e). No entanto, isto é significativamente inferior ao valor de zpeak visto apenas no sistema FB (Fig. 5d). No total, o sistema combinado FF/FB é superior em sua dinâmica e valor de pico normalizado, comprometendo o valor de pico absoluto.