O caminho da ubiquitina-proteaseasome: A complexidade e miríade de funções da morte das proteínas

A nossa percepção da degradação da proteína intracelular mudou drasticamente durante a última década. A partir de um processo de “ponto final” inespecífico, não regulado e não específico, tornou-se claro que a proteólise das proteínas celulares é um processo altamente complexo, temporalmente controlado e rigorosamente regulado, que desempenha papéis importantes em uma variedade de vias básicas durante a vida e morte celular. Duas grandes cascatas proteolíticas foram descritas. As caspases estão envolvidas na morte celular programada (apoptose), enquanto que a degradação da maioria das proteínas celulares regulatórias de curta duração é mediada pela via ubiquitina-proteasome. Entre estas estão reguladores do ciclo e divisão celular, como as ciclinas mitóticas e G1 e os inibidores da quinase dependente da ciclina, reguladores de crescimento como o c-Fos e o c-Jun, supressores tumorais como o p53, receptores de superfície como o receptor do hormônio de crescimento, e canais de íons, o regulador de condutância da fibrose cística transmembrana (CFTR), por exemplo. O sistema também está envolvido na proteólise seletiva de proteínas anormais/mutadas e no processamento de antígenos de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). A descoberta de que o sistema está envolvido na degradação da c-myc e na ativação proteolítica em duas etapas da NF-κB, por exemplo, sinalizou a “entrada” da degradação mediada pela ubiquitina na área de regulação transcripcional. Através da degradação das proteínas reguladoras chave e de curta duração, o sistema parece desempenhar papéis importantes em uma variedade de processos celulares básicos. Entre estes estão a regulação do ciclo e divisão celular, envolvimento na resposta celular ao estresse e aos moduladores extracelulares, morfogênese das redes neuronais, modulação dos receptores de superfície celular, canais iônicos e a via secretora, reparação do DNA, biogênese das organelas e regulação das respostas imunológicas e inflamatórias. Evidências recentes indicam que o sistema também está envolvido na apoptose. Com uma gama tão ampla de substratos e processos, não é surpreendente que aberrações no processo tenham sido recentemente implicadas na patogênese de várias doenças, tanto herdadas como adquiridas. Entre estas estão a degeneração muscular que segue a denervação ou imobilização prolongada, certas formas de doença de Alzheimer, esterilidade masculina e síndrome de Angelman (para revisões recentes do sistema da ubiquitina, ver ref. 1-4).

Degradação de uma proteína através do caminho da ubiquitina prossegue em dois passos discretos e sucessivos: (i) ligação covalente de múltiplas moléculas de ubiquitina ao substrato proteico, e (ii) degradação da proteína alvo pelo complexo proteasome 26S com a liberação de ubiquitina livre e reutilizável. Para assegurar a remoção eficiente e específica de uma determinada proteína num determinado ponto de tempo, tanto a conjugação da ubiquitina como a degradação dos substratos marcados devem ser bem reguladas. Em um estudo publicado neste número do Proceedings (5), Zhang e colegas relatam a identificação de uma região de ativação na subunidade α do ativador proteasômico PA28 (REG). Para incorporar esta descoberta no contexto bioquímico e fisiológico apropriado, vamos rever brevemente o nosso entendimento actual do caminho proteolítico da ubiquitina. O sistema (representado na Fig. 1) é composto por vários componentes que agem em conjunto. Um deles, a ubiquitina, uma proteína evolutivamente conservada de 76 resíduos, é ativada em seu C-terminal Gly para um éster de tiol de alta energia intermediário, uma reação catalisada pela enzima ativadora da ubiquitina, E1. Após a ativação, uma das várias enzimas E2 (proteínas portadoras da ubiquitina ou enzimas conjugadoras da ubiquitina, UBCs) transfere o grupo da ubiquitina ativada de E1 para um membro da família da ligase ubiquitina-proteína, E3, à qual a proteína do substrato está especificamente ligada. O E3 catalisa a última etapa do processo de conjugação, a ligação covalente da ubiquitina ao substrato. A primeira parte da ubiquitina é transferida para o grupo ɛ-NH2 de um resíduo de Lys do substrato proteico para gerar uma ligação isopeptídica. Em reações sucessivas, uma cadeia de poliubiquitina é sintetizada pela transferência processiva de restos ativados adicionais para Lys48 da molécula de ubiquitina previamente conjugada. A cadeia serve, muito provavelmente, como um marcador de reconhecimento para o proteasoma (ver abaixo). A ubiquitina K48R ou ubiquitina metilada (na qual todos os grupos de amino livres foram quimicamente modificados) não pode gerar cadeias de poliubiquitina e servir como terminadores de cadeia. Consequentemente, quando superexpressas em células ou introduzidas em sistemas sem células, elas inibem a proteólise. A ligação do substrato ao E3 é específica e implica que os E3 desempenham um papel importante no reconhecimento e selecção de proteínas para conjugação e subsequente degradação. A estrutura do sistema parece ser hierárquica: um único E1 aparece para realizar a ativação da ubiquitina necessária para todas as modificações. Várias espécies principais de enzimas E2 foram caracterizadas em células de mamíferos. Parece que cada E2 pode agir com uma ou mais enzimas de E3. Embora apenas relativamente poucas enzimas E3 tenham sido descritas até agora, parece que as ligas da ubiquitina pertencem a uma grande família de enzimas, ainda em crescimento. Quanto ao modo de reconhecimento das ligas, excepto em alguns casos, é improvável que cada E3 tenha como alvo um único substrato. Ao contrário, é concebível que várias proteínas celulares diferentes sejam reconhecidas por uma única ligase através de um motivo estrutural semelhante, mas claramente não idêntico. Algumas proteínas podem ser reconhecidas através do seu resíduo N-terminal livre e “desestabilizante” (“regra N-end”; ref. 6). Entretanto, a grande maioria das proteínas celulares são acetiladas em seus N-terminais ou possuem amino-terminais “estabilizadores” e são direcionadas através de diferentes sinais. Algumas são reconhecidas através de sequências primárias que residem a jusante do resíduo N-terminal. Outros são visados através de modificações secundárias pós-traducionais, como a fosforilação, ou após associação com proteínas auxiliares, como oncoproteínas ou chaperones moleculares.

Após a conjugação, a meia proteica do adutor é degradada pelo complexo proteasoma, e a ubiquitina livre e reutilizável é liberada (para revisões recentes sobre proteasomas, ver refs. 7-10). Embora o consenso actual seja que o proteasoma 26S serve como o principal braço proteolítico do sistema da ubiquitina, o espectro do substrato da enzima pode ser mais amplo e também incluir proteínas não ubiquitiniladas. Um caso bem estudado é o da ornitina decarboxilase (ODC). A ODC é degradada após uma associação nãocovalente com uma enzima que pode funcionar no processo de reconhecimento como uma acompanhante específica da ubiquitina. Outros substratos, principalmente proteínas reticuladas endoplasmáticas (ER), também podem ser degradados pelo proteasoma sem ubiquitinilação prévia, embora isto não tenha sido firmemente estabelecido. Estes podem incluir, por exemplo, moléculas de cadeia pesada (HCs) de MHC desdobradas, a 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA (HMG-R) de mamíferos, e a variante Z da antitripsina α-1 (α1-ATZ) (revista na ref. 11). Além disso, é claro agora que nem todas as proteínas ubíquas são alvo de degradação pelo proteasoma. Isto é verdade principalmente para as proteínas de membrana madura da superfície celular, tais como o receptor da hormona de crescimento. Para estas proteínas, a modificação da ubiquitina ocorre após a ligação dos ligantes e é necessária para a sua endocitose e direccionada para o lisossoma (revista na ref. 12). A degradação das proteínas ancoradas na membrana pelo sistema da ubiquitina levanta problemas mecanicistas importantes, mas não resolvidos, que estão principalmente relacionados com a questão de como dois eventos topologicamente distintos, tais como a dobra errada no ER e a degradação no citosol, ou a ligação ligante no domínio extracelular e a ubiquitinilação numa cauda citosólica de um receptor se juntam. Para as proteínas da membrana superficial celular, um problema óbvio está relacionado com o papel da modificação da ubiquitina: ela é necessária para a endocitose da proteína marcada ou, numa fase posterior, para a sua orientação específica e absorção pelo lisossoma. Para as proteínas ER degradadas pelo proteasoma citosólico, questões importantes envolvem os mecanismos subjacentes à recuperação destas proteínas através da membrana de volta para o citosol. O domínio transmembrana das proteínas ancoradas na membrana é hidrofóbico e sua remoção da membrana provavelmente envolve um transporte especializado, dependente de energia e baseado em canais. Para as proteínas de ER lumenal a questão centra-se em como elas são transportadas de volta para o citosol.

Provas recentes sugerem que o princípio da modificação da ubiquitina não se limita a visar as proteínas para degradação. Parece que a ubiquitina é um membro de uma família maior, e várias proteínas semelhantes à ubiquitina também já foram descritas. Um caso interessante envolve a segmentação em estruturas complexas. Foi descoberto que a localização de RanGAP1, uma proteína Ran GTPase ativadora da proteína RanBP2 do complexo de poros nucleares, depende de uma única e estável modificação covalente por uma proteína tipo ubiquitina de 11,5-kDa, 101-resíduos, SUMO-1 (13). A reação de ativação é semelhante à da ubiquitina e envolve E1 e um E2 específico, UBC9. Assim, a modificação covalente pós-tradicional pela ubiquitina e moléculas semelhantes à ubiquitina serve a um amplo espectro de funções. Ela está envolvida no direcionamento de proteínas para degradação pelo proteasoma e lisossoma, mas também serve funções não-proteolíticas.

O complexo proteasoma mais bem estudado envolvido na degradação de proteínas marcadas pela ubiquitina é o complexo 26S do proteasoma. É uma estrutura simétrica “dumbshell-shaped” composta por uma unidade catalítica central, um complexo proteassoma 20S em forma de barril, que é flanqueado em ambos os lados por complexos proteassômicos 19S reguladores (19S-20S-19S). A estrutura cristalina do proteasoma 20S eucariótico (levedura) foi resolvida a 2,4 Å (14). O estudo corroborou previsões anteriores sobre a estrutura do complexo, mas também revelou algumas características inesperadas. O complexo de levedura é organizado como uma pilha de quatro anéis, cada um contendo sete subunidades distintas, α1-7β1-7β1-7α1-7. As diferentes subunidades α e β possuem massas moleculares na faixa de 25-30 kDa. Os sites ativos residem em três subunidades β, β1, β2 e β5, mas não nas subunidades α. A análise topológica da localização das diferentes subunidades revelou que para as três atividades proteolíticas distintas, as atividades tipo trypsin, as atividades tipo chymotrypsin e as atividades hidrolíticas tipo postglutamyl peptidyl, os sites ativos são gerados por pares adjacentes de subunidades idênticas do tipo β, residentes em diferentes anéis β. A análise dos resíduos do site ativo revela um novo tipo de mecanismo proteolítico. As três subunidades β são submetidas à autocatálise entre o último resíduo glicólico do propéptido e o Thr1 da subunidade madura que participa do processo autocatalítico e se torna uma parte essencial do site catalítico. A resolução da estrutura cristalina também permitiu uma melhor compreensão do modo de ação dos diferentes inibidores do proteasoma. Thr1 em β1, β2, e β5 liga o inibidor menos específico da calpaina-I Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal (ALLN). A lactacystin, um inibidor mais específico, pode ser ligada covalentemente a β5 onde pode gerar, além disso, uma série de ligações de hidrogênio com outras cadeias laterais adjacentes. A análise mutante revelou que as outras subunidades β, em particular β4 e β7 que residem adjacentes a β5 e β1, afetam a atividade dessas subunidades. β6 e β7 também são geradas a partir de pro-proteínas através de processamento específico. β3 e β4 não são processados. Devido ao seu possível papel no estabelecimento de contactos interunidades e estabilização da estrutura complexa, parece que os propeptídeos são essenciais para a biogénese e estabilização da estrutura proteasomal, e o processamento só ocorre após a montagem. A estrutura do cristal também mostrou que as cadeias α, embora catalíticamente inativas, desempenham um papel essencial na estabilização da estrutura de dois anéis das cadeias β. Elas também devem desempenhar um papel na ligação dos complexos de tampas 19S, mas a estrutura dos contatos e mecanismos de ligação só será elucidada quando a estrutura do cristal do complexo 26S for resolvida. A estrutura cristalina também revelou uma distância de 28 Å entre os resíduos de Thr1 das subunidades ativas adjacentes de β. Esta distância provavelmente determina o comprimento dos peptídeos gerados durante o processo proteolítico (≈8-aa resíduos) e explica o papel do proteasoma na geração dos peptídeos antigênicos apresentados nas moléculas de MHC classe I. A existência, contudo, de produtos intermediários de comprimento variável sugere um segundo local hidrolítico a jusante do Thr1 (ver abaixo).

Um problema importante, mas ainda não resolvido, envolve a entrada de substratos proteicos e a saída de produtos proteolíticos do proteasoma. O proteasoma arquebacteriano (Thermoplasma acidophilum) contém dois poros de entrada de ≈13 Å nas duas extremidades do cilindro, rodeado por segmentos definidos das sete cadeias α. Em contraste impressionante e bastante surpreendente, estas portas de entrada não existem no proteasoma eucariótico 20S, e a entrada para a câmara catalítica interβ não é possível a partir das extremidades do complexo. Os domínios N-terminais de α1, α2, α3, α6 e α7 sobressaem um para o outro e preenchem o espaço em várias camadas de cadeias laterais que interagem estreitamente. Assim, a entrada das extremidades só será possível após uma reorganização substancial que pode potencialmente ocorrer após a associação com o complexo 19S. Tal rearranjo também pode requerer energia metabólica que pode ser fornecida pela atividade ATPase de várias das subunidades do complexo 19S. O complexo de levedura exibe alguns orifícios laterais estreitos, particularmente na interface entre os anéis α e β. Essas aberturas levam diretamente aos sites ativos do Thr1. Eles são revestidos com resíduos polares que podem potencialmente se reorganizar para gerar ≈10 aberturas Å através das quais substratos proteicos desdobrados e estendidos podem entrar.

Regulação da atividade proteasoma 20S ocorre em vários níveis. Após a estimulação das células com interferão γ, três subunidades constituintes β, 1, 2 e 5, são substituídas por novas e distintas subunidades β, β1i (LMP2), β2i (MECL1), e β5i (LMP7). As novas subunidades são relativamente mais eficientes na geração de peptídeos antigênicos reconhecidos pelas moléculas MHC classe I e as células T citotóxicas apropriadas através dos receptores de células T. Um tipo diferente de regulação envolve a formação complexa com complexos regulatórios. O proteasoma 26S é gerado após a associação dependente de ATP do complexo 20S com dois complexos 19S. Os complexos 19S são compostos de pelo menos 18 proteínas distintas com uma faixa de massa molecular de 25-110 kDa. Este complexo serve como porta de entrada no núcleo catalítico e fornece as diferentes funções reguladoras que são necessárias para garantir a degradação seletiva dos substratos marcados com ubiquitina. Estes incluem, por exemplo, um local de ligação para cadeias de ubiquitina, atividade de reciclagem da ubiquitina e várias ATPases, bem como a capacidade de estimular as diferentes atividades da peptidase do complexo 20S. De facto, foram identificadas subunidades que realizam tais actividades. De particular interesse é a subunidade de ligação em cadeia da ubiquitina que tem sido descrita tanto em mamíferos (S5a) como em plantas (MBP1). Estas subunidades ligam os monômeros da ubiquitina; no entanto, as cadeias de poliubiquitina, e em particular aquelas que contêm mais de quatro mooieties, ligam-se a uma afinidade mais alta. Recentemente, o gene da levedura que codifica a cadeia homóloga, Mcb1, foi clonado. Surpreendentemente, Δmcb1 mutantes de deleção não apresentam nenhum defeito de crescimento e degradam proteínas normalmente ubiquitinylated, exceto para a proteína do modelo de fusão linear ubiquitin-Pro-β-Gal. Eles apresentam, no entanto, uma leve sensibilidade ao estresse, como a exposição a análogos de aminoácidos (15). Uma possível explicação para estes resultados inesperados é que as proteínas ubiquitiniladas são reconhecidas por uma subunidade proteasomal adicional, porém indefinida. Uma dessas candidatas é a enzima deubiquitinilating Doa4 que funciona para remover a ubiquitina moieties de substratos proteolíticos. Uma possibilidade remota é que o proteasoma não reconheça as moléculas ubiquitínicas, mas, semelhante aos chaperones moleculares, associa-se a motivos mal definidos e desdobrados no substrato proteico. Estes motivos são gerados após a “desnaturação” da proteína através da marcação da ubiquitina. A identificação da especificidade do reconhecimento do proteasoma e o papel da ubiquitina neste processo são essenciais para a compreensão dos mecanismos de acção da protease em particular e do sistema da ubiquitina em geral. Outra função reguladora do proteasoma 19S envolve a edição da cadeia de poli-ubiquitina. O complexo contém uma isopeptidase de 37kDa que remove moieties únicos de ubiquitina da extremidade distal de cadeias curtas de poli-ubiquitina (16). Supõe-se que esta isopeptidase esteja envolvida na edição e resgate de proteínas mal ubiquitinizadas ou lentamente degradadas da degradação. A este respeito é diferente de Doa4 e de uma isopeptidase dependente de ATP que está associada ao proteasoma. As duas enzimas estão envolvidas na reciclagem da ubiquitina e manutenção do nível de ubiquitina livre na célula.

Outro complexo que se associa com o proteasoma 20S e aumenta drasticamente sua atividade é o PA28 (REG ou o regulador 11S; ref. 17 e 18). Ao contrário da associação com o 19S, a formação complexa com PA28 é independente de ATP. Após a associação, PA28 aumenta o Vmax e diminui o Km do complexo 20S em direção a toda uma série de diferentes peptídeos. O complexo PA28-20S-PA28 é inativo, entretanto, em direção a proteínas nativas ou conjugadas à ubiquitina intactas. O ativador puro é um complexo de duas subunidades ≈28-kDa, PA28α e PA28β, que são ≈50% idênticas. Imunoprecipitação com anticorpos específicos das subunidades e experimentos de reticulação química revelaram que PA28 é um hexamer em forma de anel que é composto de subunidades alternadas de α e β com uma estequiometria de (αβ)3 (19). Curiosamente, estas subunidades são também 30-40% idênticas a uma proteína nuclear de função até agora desconhecida, o antigénio Ki, que reage com soros de doentes com a doença auto-imune lúpus eritematoso sistémico. O complexo hexamericano tem uma estrutura em forma de anel (Fig. 1) e encerra o complexo proteassoma 20S em uma ou ambas as placas terminais. A estrutura da tampa é atravessada por um canal central com uma abertura de 20 Å na extremidade extrema e uma abertura de 30 Å na superfície de ligação do proteasoma (20, 21). As aberturas e o canal servem, muito provavelmente, como parte da maquinaria de translocação de substratos peptídeos a caminho da câmara catalítica do complexo 20S. PA28α pode gerar hexa- ou hepta-homultimizadores que se associam com o complexo 20S e o ativam, embora, de forma menos eficiente que o heteromultimer (αβ)3. Em contraste, PA28β não se associa com o complexo 20S e não possui nenhuma atividade estimulante. O papel das subunidades β provavelmente é modular a atividade da atividade PA28 influenciando indiretamente a atividade das subunidades α ou modificando a afinidade da partícula PA28 com o proteasoma 20S.

PA28α contém em sua parte central uma seqüência única, o motivo KEKE que é um domínio hidrofílico composto de resíduos de Lis com carga positiva alternada e resíduos de Glu com carga negativa. Foi postulado que este motivo, que não existe em PA28β, promove a interação proteína-proteína entre as subunidades α da partícula PA28 e as subunidades α do proteasoma 20S (22). A análise mutante revelou, entretanto, que ΔKEKE PA28α mantém sua atividade estimulante (23). A ligação ao proteasoma 20S, entretanto, requer um terminal C intacto do proteasoma PA28α e pode envolver a subunidade C2 α do proteasoma 20S (8). Foi sugerido que a fosforilação ativa a atividade estimulante do PA28α, entretanto, este modo de regulação não foi firmemente estabelecido.

Análise mutante do PA28α por Zhang e colegas (5) revelou várias mutações inativadoras em um loop definido na base da molécula. Algumas das proteínas mutantes se ligam firmemente ao complexo 20S, mas não podem ativá-lo (5). Assim, a ligação ao proteasoma pode ser claramente separada da atividade estimulante da PA28. Curiosamente, existe uma grande lacuna na distribuição das mutações inativadoras que abrangem os resíduos de aminoácidos 51-122. Esta zona livre de mutações representa uma região única para cada subunidade do complexo PA28. Ela provavelmente não está envolvida na interação do PA28 com o complexo 20S ou na estimulação de sua atividade proteolítica. Ao contrário, ela pode desempenhar um papel na função da partícula na célula intacta, como em sua localização intracelular ou associação com outros componentes que determinam sua atividade e interações específicas.

Um problema importante envolve os papéis fisiológicos da PA28. Ambas as subunidades são marcadamente induzidas por interferon γ, sugerindo um papel para a partícula na função de processamento de antígenos do proteasoma. A superexpressão de PA28α em uma linha de fibroblastos de camundongo que expressa a proteína do citomegalovírus pp89 resulta em um marcante aumento do reconhecimento pelas células T citotóxicas específicas da pp89. Da mesma forma, a apresentação de uma nucleoproteína da gripe também foi melhorada (24). Estudos em um sistema livre de células revelaram que usando um mecanismo coordenado de dupla retirada, o complexo PA28-20S-PA28, pode cortar com eficiência grandes peptídeos (que têm seqüências de flanco tanto no terminal N quanto no terminal C) para os epitopes antigênicos precisos reconhecidos pelo complexo MHC e a célula T citotóxica apropriada (25). Assim, parece que o PA28 desempenha um papel importante no processamento de antígenos para apresentação em moléculas de MHC classe I. Como o proteasoma PA28-20S-PA28 não consegue digerir proteínas nativas ou ubiquitiniladas intactas, ele deve atuar abaixo do proteasoma 19S-20S-19S que degrada as proteínas marcadas com ubiquitina ou grandes peptídeos. Também é possível, embora não tenha sido demonstrado, que um único proteasoma 19S-20S-PA28 assimétrico exista que possa realizar este processo proteolítico de duas etapas, proteólise inicial a grandes peptídeos, e corte final. O proteasoma assimétrico simétrico ou putativo PA28 contendo proteasomas também pode estar envolvido na degradação terminal dos peptídeos para aminoácidos livres, uma atividade que não pode ser catalisada pelo proteasoma 19S-20S-19S (Fig. 1). Assim, parece que a elucidação dos papéis celulares do complexo PA28 terá que esperar por mais experimentos.