Voordat het begint: Regulating Translation at the 5′ UTR

Abstract

Translatieregulatie speelt een belangrijke rol in zowel normale fysiologische condities als in ziektetoestanden. Deze regulatie vereist cis-regulerende elementen die zich vooral in 5′ en 3′ UTRs bevinden en trans-regulerende factoren (b.v. RNA bindende proteïnen (RBPs)) die specifieke RNA-kenmerken herkennen en interageren met de translatiemachine om de activiteit ervan te moduleren. In dit artikel bespreken we belangrijke aspecten van 5′ UTR-gemedieerde regulatie door een overzicht te geven van de kenmerken en de functie van de belangrijkste elementen aanwezig in deze regio, zoals uORF (upstream open reading frame), secundaire structuren, en RBP’s bindende motieven en verschillende mechanismen van translatie regulatie en de impact die ze hebben op genexpressie en de menselijke gezondheid wanneer ze ontregeld zijn.

1. Vertaalregulatie

Genexpressie kan op meerdere niveaus gemoduleerd worden, van chromatine modificatie tot mRNA translatie. Ondanks het belang van transcriptionele regulatie is het op dit punt duidelijk dat mRNA-niveaus niet kunnen worden gebruikt als enige parameter om het eiwitgehalte van een cel te rechtvaardigen. In een recente studie van ons lab hebben wij vastgesteld dat er een directe correlatie bestaat tussen mRNA en eiwit voor minder dan een derde van de geanalyseerde genen in een menselijke cellijn. Bovendien suggereerde onze analyse dat translatieregulatie aanzienlijk bijdraagt tot de eiwitvariatie aangezien verschillende parameters gerelateerd aan translatie zoals 5′ UTR, 3′ UTR, lengte van de coderende sequentie, aanwezigheid van uORFs en aminozuursamenstelling, enzovoort, goede correlaties vertoonden met de bekomen mRNA/eiwit ratio’s. Regulatie van de translatie functioneert als een belangrijke schakelaar wanneer snelle veranderingen in genexpressie vereist zijn als reactie op interne en externe stimuli (PDGF2, VEGF, TGFβ zijn voorbeelden van genen die op een dergelijke manier gecontroleerd worden). Regulatie van de translatie speelt ook een belangrijke rol tijdens de ontwikkeling en de celdifferentiatie door het veranderen van de expressieniveaus van specifieke mRNA subsets gedurende een bepaald tijdsinterval, terwijl de meerderheid van de transcripten ongewijzigd blijven (besproken in ).

In dit artikel zullen we ons richten op het belang van 5′ UTR gemedieerde regulatie en de verschillende functionele elementen aanwezig in deze regio, met uitzondering van IRES, dat in een ander artikel van dit nummer wordt besproken. De belangrijkste regulerende elementen in 5′ UTR zijn secundaire structuren (met inbegrip van IRES), bindingsplaatsen voor RNA-bindende proteïnen, uAUGs en uORFs (figuur 1).

Figuur 1

Regulerende elementen aanwezig in 5′ UTR.

2. 5′ UTR

De gemiddelde lengte van 5′ UTRs is ~100 tot ~220 nucleotiden bij alle soorten. In gewervelde dieren, 5′ UTRs hebben de neiging om langer te zijn in transcripten coderend voor transcriptiefactoren, protooncogenen, groeifactoren en hun receptoren, en eiwitten die slecht worden vertaald onder normale omstandigheden . Een hoog GC-gehalte is ook een geconserveerd kenmerk, met waarden boven 60% in het geval van warmbloedige gewervelde dieren. In de context van haarspeld structuren, kan GC inhoud de proteïne vertalingsefficiëntie beïnvloeden onafhankelijk van haarspeld thermische stabiliteit en haarspeld positie. UTRs van eukaryote mRNAs vertonen ook een verscheidenheid van herhalingen die korte en lange afgewisselde elementen (SINEs en LINEs, resp.), eenvoudige sequentie herhalingen (SSRs), minisatellieten, en macrosatellieten omvatten.

Translatie-initiatie in eukaryoten vereist de rekrutering van ribosomale subeenheden bij ofwel de 5′ m7G cap structuur. Het initiatiecodon bevindt zich meestal ver stroomafwaarts, waardoor ribosomale beweging naar deze plaats nodig is. Deze beweging lijkt niet-lineair te zijn voor sommige mRNAs (d.w.z. ribosomale subeenheden lijken segmenten van het 5′ UTR te omzeilen (shunten) als ze in de richting van de AUG bewegen). Door shunting zouden mRNA’s die uAUGs of haarspeldstructuren bevatten efficiënt vertaald kunnen worden. Belangrijke voorbeelden hiervan zijn de mRNA’s van het bloemkoolmozaïekvirus en het adenovirus. Het mechanisme van ribosomale shunting is vrij complex en vereist mRNA-rRNA basenparing.

Genen die verschillen vertonen in de 5′ UTR van hun transcripten komen relatief vaak voor. 10-18% van de genen tot expressie alternatieve 5′ UTR door het gebruik van meerdere promotors, terwijl alternatieve splicing binnen UTRs wordt geschat op 13% van de genen in de zoogdieren transcriptoom beïnvloeden . Deze variaties in 5′ UTR kunnen fungeren als belangrijke schakelaars om genexpressie te reguleren. Twee belangrijke voorbeelden zijn de kanker-gerelateerde genen BRCA1 (borstkanker 1) en TGF-β (transformerende groeifactor β). BRCA1 is een tumorsuppressor die vaak gemuteerd is bij borstkanker en functies heeft in de celcyclus, apoptose en herstel van DNA-schade. BRAC1 produceert twee verschillende transcripten die afkomstig zijn van twee verschillende promotors en daarom verschillen vertonen in hun 5′ UTR. Een korter transcript komt tot expressie in zowel kanker- als niet-kankerachtig borstweefsel en wordt efficiënt vertaald, terwijl een langer transcript voornamelijk tot expressie komt in borstkankers. De aanwezigheid van meerdere uAUGs en een complexere structuur hebben een dramatisch effect op de vertaling van dit langere transcript. Dit veroorzaakt een algemene daling van de BRAC1 niveaus in tumorcellen, wat leidt tot een vermindering van de groeiremming . TGF-β is betrokken bij een groot aantal processen, waaronder celproliferatie, migratie, wondreparatie, ontwikkeling, tumorigenese en immunosuppressie. Er zijn drie isovormen bekend: β1, β2, en β3. TGF-β3 produceert twee alternatieve transcripten: een 3,5 kb transcript met een zeer lang 5′ UTR (1,1 kb) en een 2,6 kb transcript met een korter 5′ UTR (0,23 kb). De aanwezigheid van 11 uORFs in het langere transcript remt dramatisch de vertaling terwijl het kortere transcript efficiënt wordt vertaald.

3. Regulering door Secundaire Structuur

Secondaire structuren kunnen fungeren als belangrijke regulerende hulpmiddelen in 5′ UTRs. Een correlatie met genfunctie is gesuggereerd; secundaire structuren zijn vastgesteld om bijzonder prevalent te zijn bij mRNAs die coderen voor transcriptiefactoren, protooncogenen, groeifactoren, en hun receptoren en proteïnen die slecht vertaald worden onder normale omstandigheden. >90% van de transcripten in deze klassen hebben 5′ UTRs die stabiele secundaire structuren bevatten met gemiddelde vrije energieën van minder dan -50 kcal/mol. 60% van deze stabiele secundaire structuren zijn zeer dicht bij de cap-structuur gepositioneerd. Deze structuren zijn zeer effectief in het remmen van translatie. In feite zou een haarspeld dicht bij de cap met een vrije energie van -30 kcal/mol voldoende zijn om de toegang van het pre-initiatie complex tot het mRNA te blokkeren. Wanneer de hairpins zich verder van de 5′ UTR bevinden, moeten ze een vrije energie van meer dan -50 kcal/mol hebben om de translatie te kunnen blokkeren. Stabiele secundaire structuur kan de afwikkelingsactiviteit van het helicase elF4A weerstaan. Dit effect kan gedeeltelijk verholpen worden door de overexpressie van elF4A in samenwerking met elF4B . mRNAs met een sterk gestructureerde 5′ UTR zoals proto-oncogenen en andere groeifactoren maken gebruik van cap-afhankelijke translatie initiatie. Het is niet verrassend dat de overexpressie van componenten van de translatie-initiatie-machine, waaronder elf4E, in verband is gebracht met tumorigenese (besproken in ).

Het gen TGF-β1 biedt een goed voorbeeld van translatieremming gemedieerd door secundaire structuur . Een evolutionair geconserveerd motief in het 5′ UTR vormt een stabiele stamlus. Deze structuur op zichzelf is echter niet voldoende om translatie te blokkeren. De translatie-onderdrukking van TGF-β1 is afhankelijk van een verhoogde binding van het RNA bindend eiwit YB-1 aan het TGF-β1 transcript. Vervolgens werd voorgesteld dat YB-1 de 5′ UTR van TGF-β1 bindt met hoge affiniteit dankzij zijn GC-gehalte en samenwerkt met de stamlus om de TGF-β1 translatie te remmen door duplexvorming te vergemakkelijken.

4. Regulering door RNA Bindende Eiwitten

Van het menselijk genoom wordt voorspeld dat het codeert voor ongeveer 1000 RNA bindende eiwitten (RBP’s), waarvan een groot percentage betrokken is bij translatie. Zij kunnen in twee hoofdgroepen worden ingedeeld: RBP’s die deel uitmaken van de basis translatie machinerie en vereist zijn voor de translatie van alle tot expressie gebrachte mRNA’s (voorbeelden: PABPI, elf4E) en RBP’s die op een meer selectieve manier functioneren door de translatieniveaus van specifieke doel-mRNA’s positief of negatief te controleren (voorbeelden: HuR, Musashi1). Wat deze laatste groep betreft, is waargenomen dat RBP’s verschillende mechanismen kunnen gebruiken om de translatie te verhogen of te remmen. Hoewel verscheidene uitzonderingen bekend zijn, kan worden gesteld dat RBP’s vaak specifieke motieven in UTR’s herkennen en met de vertaalmachine interageren om de expressie te controleren. Interferentie met translatie vindt normaliter plaats tijdens de initiatiestap (besproken in ).

Het best gekarakteriseerde voorbeeld van RBP-gemedieerde regulatie waarbij 5′ UTRs betrokken zijn, wordt geleverd door de ijzerregulerende eiwitten (IRP 1 en 2). Deze eiwitten herkennen een sterk geconserveerde stengellusstructuur met circa 30 nucleotiden, bekend als het ijzerresponselement (IRE). De belangrijkste kenmerken zijn een hexanucleotide lus met de sequentie CAGYCX (Y = U of A; X = U, C of A) en een bovenste stam van 5 bp die door een ongepaarde cytosine wordt gescheiden van een onderste stam van variabele lengte. Deze regulatie is van cruciaal belang voor het handhaven van de cellulaire ijzerhomeostase, aangezien de expressie van een groot aantal mRNA’s die verband houden met ijzeropslag en -metabolisme, waaronder ferritine, mitochondriale aconitase, succinaatdehydrogenase-ijzereiwit, erytroïde 5-aminolevulinaat synthetase (eALAS), en een ijzerexportmolecuul genaamd ferroportine (FPN1), door dit systeem wordt gemoduleerd. Wanneer het ijzergehalte in de cel laag is, binden IRP1 en IRP2 aan het IRE en blokkeren zij de translatie van de ORF stroomafwaarts. Wanneer de intracellulaire ijzergehalten hoog zijn, is de RNA-bindende activiteit van beide IRP’s verminderd (figuur 2(a)). IRE’s hebben de neiging zich dicht bij de cap te bevinden, wat een sterische remming van de binding van 40S ribosomale subeenheden aan het transcript veroorzaakt. Wanneer het IRE-IRP-complex zich verder van de cap bevindt, heeft het geen invloed op de binding van 40S ribosomale subeenheden, maar blokkeert het ribosomale scanning (besproken in ). Een interessante omzeiling van het IRE/IRP-mechanisme kan worden waargenomen in ijzer-gestarde duodenale en erythroïde voorlopercellen. Een stroomopwaartse promotor wordt gebruikt om FPN1 pre-mRNAs te genereren die nog een exon bevatten dat door alternatieve splicing verbonden is met een splice acceptor in het 3′ van het IRE. Een rijp FPN1-transcript met hetzelfde open leeskader wordt gegenereerd; de 5′ UTR bevat echter niet het IRE . Daarom brengen deze cellen de alternatieve FPN1 isovorm tot expressie op een ijzer-onafhankelijke manier. Mutaties die IRE’s beïnvloeden kunnen tot ziekten leiden. Dit is het geval bij het erfelijk hyperferritinemie-cataract syndroom (HHCS), een genetische autosomaal dominante aandoening waarbij aggregatie en kristallisatie van ferritine in de lens leidt tot bilateraal cataract .

(a)

(b)

(a)
(b)

RBP-gemedieerde regulatie kan zeer uitgebreid zijn en meerdere stappen omvatten. Een goed voorbeeld van de wisselwerking tussen factoren en verschillende reguleringsprocessen is het gen voor mannelijk-specifiek-letaal 2 (msl-2) in Drosophila, een belangrijke speler in doseringscompensatie. Het vrouwspecifieke RNA bindende eiwit sex lethal (SXL) participeert in meerdere aspecten van msl-2 regulatie waarbij msl-2 expressie moet worden voorkomen (figuur 2(b)). De regulatie begint op het splicing-niveau; SXL bindt zich aan twee polyU stroken die zich bevinden in een intron dat deel uitmaakt van het 5′ UTR. Dit proces veroorzaakt intron-retentie en bewaart kritische sequenties die later zullen worden gebruikt in translatieregulatie. In het cytoplasma zal hetzelfde SXL-eiwit functioneren als een translatie-onderdrukker van msl-2 in twee verschillende mechanismen die plaatsvinden in het 3′ en het 5′ UTR . SXL bindt U-rijke sequenties in het 3′ UTR en rekruteert het corepressor-eiwit UNR (upstream van N-ras) en PABP, waardoor de rekrutering van het pre-initiatie complex aan het 5′ einde van het mRNA wordt geblokkeerd. Om ervoor te zorgen dat msl-2 volledig wordt onderdrukt, vindt een tweede regulerende stap plaats aan het 5′ UTR, eveneens gemedieerd door SXL. Bij deze repressie is een nieuw reguleringsmechanisme betrokken waarbij crosstalk tussen SXL en een uORF plaatsvindt om de translatie efficiënt te represseren. De 5′ UTR van msl-2 bevat 3 uORFs maar alleen de derde is betrokken bij de repressie. Interessant is dat deze repressie zeer zwak is in afwezigheid van SXL (~ 2-voudig), maar wanneer SXL aanwezig is, bindt het een poly U-stretch op een paar nucleotiden afstand van de uAUG en verhoogt deze repressie tot meer dan 14-voudig. SXL werkt door het stimuleren van translatie-initiatie bij de uAUG en niet door een eenvoudige sterische blokkade van scannende ribosomen. Dit effect kan plaatsvinden via een interactie tussen SXL en translatie-initiatiefactoren; mogelijk leden van de elF3-component zoals blijkt uit een two-hybrid screening. Dit mechanisme kan van invloed zijn op een groot aantal mRNA’s; van 268 transcripten in Drosophila werd vastgesteld dat zij SXL-bindende motieven bevatten die geassocieerd zijn met uAUG, op een passende afstand van elkaar. Bijvoorbeeld, een reporter construct dat de 5′UTR van het gen Irr47 bevatte werd ~4-voudig onderdrukt door SXL proteïne.

RBPs kunnen antagonistische functies hebben bij het reguleren van translatie. Een interessant voorbeeld is de regulatie van p21 in de context van replicatieve senescentie, een cellulaire toestand waarin cellen in een onomkeerbare groeistilstand terechtkomen. Inductie van p21 is nodig om het proces in gang te zetten, en om cdk2-cycline E complexen te remmen. Het 5′ UTR van p21 bevat een GC-rijke sequentie die een stamlus vormt. Dit element wordt herkend door twee RBPs met verschillende eigenschappen: CUGBP1 en calreticulin (CRT). De competitie tussen de twee eiwitten bepaalt het uiteindelijke expressieniveau van p21 en bepaalt of cellen zullen prolifereren of groeistilstand en senescentie zullen ondergaan. Binding van CUGBP1 aan p21 mRNA is dramatisch verhoogd in senescentie vergeleken met jonge fibroblastcellen. De eiwitniveaus veranderen niet tijdens het proces en deze toename van de activiteit is te wijten aan fosforylering. Anderzijds vertoonden CRT IPs een vier- tot vijfvoudige vermindering van de activiteit in senescentiecellen als gevolg van een afname van de expressie. Beide eiwitten bleken invloed te hebben op de translatie van p21. Terwijl CUGBP1 echter als activator fungeert, fungeert CRT als repressor. Aangezien de twee eiwitten in senescente cellen een tegengestelde activiteit hebben, werd onderzocht of zij concurreren om interactie met p21 mRNA en om de translatie ervan te controleren. Toenemende hoeveelheden van het ene eiwit waren in staat de binding van het andere eiwit aan p21 mRNA en het effect daarvan op de translatie om te keren; de affiniteit met de bindingsplaats is nogal verschillend, aangezien CUGBP1 in de bindingsreacties aanwezig moest zijn met een vier- tot achtvoudig molair overschot ten opzichte van CRT om de binding aan p21 mRNA tegen te gaan en de translatie ervan te beïnvloeden .

5. Regulering door uORFs en Upstream AUGs

uORFs en uAUGs zijn belangrijke regulerende elementen in 5′ UTRs. Zoals hun namen suggereren, zijn uORFs sequenties gedefinieerd door een start- en stopcodon stroomopwaarts van het coderende hoofdgebied, terwijl uAUGs startcodons zijn zonder een in-frame stroomafwaarts stopcodon stroomopwaarts van het coderende hoofdgebied. Een groot percentage van het humane transcriptoom bevat uORF’s en/of uAUG’s, met waarden die variëren tussen 44 en 49% . Vergelijkbare aantallen worden gevonden in het transcriptoom van de muis. Hoewel deze aantallen hoog klinken, komen zowel uORF’s als uAUG’s minder vaak voor dan op grond van het toeval wordt verwacht, hetgeen suggereert dat zij onder selectieve druk staan. uORF’s en uAUG’s zijn oververtegenwoordigd in bepaalde subgroepen zoals transcriptiefactoren, groeifactoren en hun receptoren en proto-oncogenen. Zowel uORFs als uAUGs zijn uiterst divers, variërend in positie ten opzichte van de cap en de belangrijkste AUG, aantal per transcript en lengte (in het geval van uORFs). Aanvullende tabel 1 (in het aanvullend materiaal dat online beschikbaar is op http://dx.doi.org/10.1155/2012/475731) bevat een uitgebreide lijst van uORF’s en uAUG’s die in het humane transcriptoom voorkomen. uORF’s en uAUG’s zijn niet uitgebreid geanalyseerd in termen van conservering. Uit een proefstudie met een subset van menselijke, muizen- en rattentranscripten is gebleken dat beide elementen matig geconserveerd zijn, aangezien 38% van de uORF’s en 24% van de uAUG’s tussen de drie soorten geconserveerd bleken te zijn. De bescheiden conservering van uORF’s in combinatie met het feit dat hun gemiddelde lengte (20 nucleotiden) door toeval wordt verwacht en uAUG’s een sterkere onderdrukking bieden in vergelijking met uORF’s suggereert dat veel uAUG’s in het evolutieproces zijn geneutraliseerd door de overname van een downstream-stopcodon. Er is dan ook voorgesteld dat slechts enkele uORF’s, zeer waarschijnlijk de geconserveerde, zijn aangewend voor expressieregulatie. In gist is aangetoond dat uORFs statistisch ondervertegenwoordigd zijn in 5′ UTRs en door selectieve druk zijn verwijderd, hetgeen er eveneens op wijst dat de resterende uORFs betrokken kunnen zijn bij translatieregulatie.

Hoewel over het geheel genomen is gesuggereerd dat uORFs negatief gecorreleerd zijn met eiwitproductie tot nu toe, is functionele activiteit aangetoond voor slechts een beperkt aantal uORFs en uAUGs. In figuur 3 laten wij voorbeelden zien van de invloed die uAUGs op de translatie-efficiëntie kunnen hebben. Tot de meest relevante kenmerken die tot de functionaliteit kunnen bijdragen, behoren de lange 5′ cap-to-uORF-afstand, sequentiebehoud, de context waarin de AUG zich bevindt, de sterkte van de initiatieplaats voor de ORF, de lengte van de uORF, en het aantal AUG’s in het 5′ UTR . Verschillende uitkomsten zijn waargenomen wanneer een ribosoom een uAUG of uORF tegenkomt . Omdat het aantal gekarakteriseerde gebeurtenissen nog klein is, is het moeilijk om algemene mechanismen te definiëren; we beschrijven dan een paar goed gekarakteriseerde en relevante gebeurtenissen. Leaky scanning wordt gedefinieerd wanneer een deel van de scanning complexen de uAUG of uORF omzeilt en verder gaat met scannen naar de volgende AUG. In dit geval fungeert de upstream AUG als een “decoy” van de ORF AUG, die functioneert als een negatieve regulator van de translatie, althans voor een fractie van de ribosomen. De productie van cis-werkende peptiden door uORF’s kan de initiatie van translatie van de downstream ORF verminderen door het ribosoom aan het eind van de uORF af te remmen. Een klassiek voorbeeld is het evolutionair geconserveerde eukaryotische arginine attenuator peptide (AAP), dat de translatie van eiwitten die betrokken zijn bij de de novo fungale arginine biosynthese in hoge arginineconcentratie negatief controleert . In dit scenario verandert arginine de conformatie van AAP en/of de omgeving van de P-site, waardoor ribosomale stagnatie optreedt bij het terminatiecodon van AAP uORF . AAP vermindert ook translatie elongatie door ribosoom stalling wanneer de uORF wordt ingevoegd in een coderende sequentie . Een ander klassiek voorbeeld van uORF-gemedieerde regulering is afkomstig van gist. Vier uORFs zijn aanwezig in de 5′ UTR van de transcriptiefactor GCN4. De eerste van de vier uORFs wordt altijd efficiënt vertaald, ongeacht de voedingsomstandigheden. In ongestoorde cellen maken een snelle herlading van ribosomen en initiatiecofactoren de vertaling van de uORFs 2-4 mogelijk, terwijl de vertaling van de belangrijkste ORF wordt geremd. In situaties van aminozuurhonger zijn initiatie-factoren schaars, wat resulteert in een vertraagde herladen van ribosomen en scanning over de sequenties die de uORFs bevatten. Een functioneel initiatiecomplex wordt alleen bij de hoofdcoderende sequentie opnieuw geassembleerd en GCN4 tot expressie gebracht. Dit mechanisme maakt een snelle reactie op voedingsstress mogelijk. Een ander soortgelijk voorbeeld van gereguleerde expressie via uORF’s is het gen voor carnitinepalmitoyltransferase 1C (CPT1C). CPT1C reguleert het metabolisme in de hersenen in situaties van energieoverschot. De aanwezigheid van de uORF in de 5′ UTR onderdrukt de expressie van de ORF. Deze repressie wordt echter opgeheven in reactie op specifieke stressstimuli zoals glucose depravatie en palmitaat-BSA behandeling. Er is gesuggereerd dat uORFs ook mRNA-degradatie kunnen induceren. Een reeks 5′ UTR constructen met als reporter het cat-gen van het bacteriële transposon Tn9 werd in gist getest. Een enkele nucleotide vervanging werd gebruikt om een 7-codon ORF te creëren stroomopwaarts van het cat-gen. De uORF werd efficiënt vertaald en veroorzaakte translatieremming van de cat ORF en destabilisatie van het cat mRNA. Een verband tussen uORFs en mRNA verval werd ook gesuggereerd op basis van een vergelijking tussen de gemiddelde expressieniveaus van uORF-bevattende en niet-uORF-bevattende transcripten .

(a)

(b)

(a)
(b)

Er zijn verschillende mutaties die uORF’s elimineren of creëren die uiteindelijk de eiwitniveaus wijzigen, in verband gebracht met ziekten bij de mens. Hun relevantie werd onlangs besproken. Predispositie voor melanoom kan worden veroorzaakt door een mutatie die een uORF introduceert in de 5′ UTR van het gen cycline-afhankelijke kinase inhibitor proteïne (CDKN2A) . Hereditaire trombocythemie wordt veroorzaakt door een mutatie die een splicingvariant creëert die een uORF elimineert, wat leidt tot een toename van de eiwitproductie van het gen trombopoëtine . Marie Unna hereditaire hypotrichose is het gevolg van een mutatie die een uORF in de 5′ UTR van het gen hairless homolog verstoort, waardoor de expressie ervan toeneemt. Een overgang van G naar A in een van de uORFs aanwezig in het 5′ UTR van het TGF-β3 transcript werd geassocieerd met aritmogene rechterventrikel cardiomyopathie/dysplasie (ARVC) . Een andere groep van vijf uORFs die geassocieerd zijn met ziekten zijn onlangs getest met behulp van reporter assays; zij omvatten gonadale dysgenese (SRY) , Van der Woude-syndroom (IRF6) , Carney Complex Type 1 (PRKAR1A) , erfelijke pancreatitis (SPINK1) , en Thalassaemia-β (HBB) . Deze lijst zal zeker uitbreiden aangezien meer dan 500 single-nucleotide polymorfismen (SNPs) die uORFs creëren of verwijderen zijn gerapporteerd.

6. Zoeken naar nieuwe regulerende elementen in de 5′ UTR

Nauwelijks een fractie van de posttranscriptionele regulerende elementen die zich in menselijke 5′ UTRs bevinden zijn gekarakteriseerd. Deze geïdentificeerde UTR elementen zijn gecatalogiseerd in een web-bron onderhouden door Graziano Pesole’s groep genaamd UTRdb (http://utrdb.ba.itb.cnr.it/) . In vivo methoden voor de identificatie van posttranscriptionele regulerende elementen in UTR’s, vooral die welke geassocieerd zijn met RBP’s, zijn de laatste vijf jaar sterk vooruitgegaan dankzij de deep sequencing technologie. CLIP en RIP-Seq zijn methoden die gebaseerd zijn op de isolatie van RNA-eiwitmoleculen (RNP’s) via immunoprecipitatie, gevolgd door RNase-digestie en nauwkeurige identificatie van RBP-bindingsplaatsen met deep sequencing . Hoewel het aantal RBP’s dat tot nu toe met deze methoden is geanalyseerd zeer klein is (besproken in ), kan men, naarmate de deep sequencing technologie toegankelijker wordt en de methoden vereenvoudigd worden, verwachten dat zeer binnenkort een groot deel van de menselijke RBP-bindingsplaatsen in UTR’s in kaart zal worden gebracht.

Een andere keuze om UTR-elementen die de translatie reguleren in kaart te brengen is het gebruik van zuiver computationele methoden die gebaseerd zijn op de analyse van de UTR-sequenties. Deze methoden zijn gebaseerd op de identificatie van ontaarde ribonucleotidepatronen die de verwachte eigenschappen van RBP-bindingsplaatsen hebben. Soortgelijke methoden worden al bijna 30 jaar toegepast om transcriptieregulatoren in promotorsequenties te identificeren. Deze methoden zijn nu tot volle wasdom gekomen, worden op grote schaal gebruikt en hebben in hoge mate bijgedragen tot de samenstelling van databanken over transcriptieregulatie (b.v. TRANSFAC). Hoewel veel van het werk gericht op het ontwerpen en verfijnen van algoritmen voor sequentieanalyse in de context van transcriptieregulatie kan worden aangepast aan overeenkomstige analyseproblemen in de context van post-transcriptionele regulatorische elementen, zijn er extra complicaties verbonden aan RBP-bindingsplaatsen. De meest voor de hand liggende onder deze is dat RBP’s zullen secundaire structurele voorkeuren, en weinig bestaande analyse-instrumenten kunnen informatie over RNA vouwen op te nemen. Evenzo, als gevolg van RNA vouwen regulerende elementen kunnen gemakkelijker synergetisch functioneren of vertonen gecoördineerde binding aan sequentie-elementen die zijn distale in de primaire sequentie, maar zeer dicht in de gevouwen molecuul. Een andere moeilijkheid is het ontbreken van voorbeeld translationele regulerende elementen voor het trainen van de analyse. Op basis van een handvol goed bestudeerde voorbeelden bestaat vaak de indruk dat RBP-bindingsplaatsen gemiddeld korter zijn dan bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren (TF’s), maar deze indruk kan te wijten zijn aan een vertekening van de set RBP’s waarop het meeste onderzoek is verricht. Een van de meest krachtige methoden voor het identificeren van regulerende elementen is fylogenetische foot-printing, die gebruik maakt van lokaal verhoogde evolutionaire conservatie om functionele elementen te onthullen. Deze logica werkt even goed voor post-transcriptionele regulerende elementen. Jammer genoeg zijn TF bindingsplaatsen ook een belangrijke hinderpaal voor de directe toepassing van computationele sequentieanalyse voor het identificeren van 5′ UTR elementen die betrokken zijn bij translatie. Elementen die betrokken zijn bij transcriptionele regulatie bevinden zich zowel up- als downstream van transcriptie startplaatsen, en wanneer 5′ UTRs voldoende kort zijn post-transcriptionele regulerende elementen zijn waarschijnlijk interleaved met TF bindingsplaatsen.

Ultimately de beste methoden voor het identificeren van post-transcriptionele regulerende elementen zal voortkomen uit complementaire toepassing van experimentele en computationele technieken.

Acknowledgments

Onderzoek in Penalva’s lab wordt ondersteund door de Voelcker Foundation, Children’s Brain Tumor foundation, en 5R21HG004664-02 en 1R01HG006015-01A1.

Aanvullende materialen