The engineering principles of combining a transcriptional incoherent feedforward loop with negative feedback

A model of incoherent feedforward transcriptional regulation

Er zijn vier varianten van incoherente feedforward (FF) controle in een drie-knooppunt systeem . In dit artikel bestuderen we de incoherente feedforward loop Type 1 (I1-FFL) motief, waarin het ingangssignaal (X) activeert zowel de intermediaire (Y) en de uiteindelijke output (Z), terwijl Y onderdrukt Z (Fig. 1a) . Ons model is er een van transcriptionele regulatie, zodat X een input-transcriptiefactor voorstelt, die zich kan binden aan de cis-regulerende regio’s van Y en Z, met affiniteit K1 (Fig. 1b). Dit resulteert in de transcriptie en translatie van Y (dubbele pijlen in Fig. 1b), die ook een transcriptiefactor is die bindt aan de regulerende regio van Z met affiniteit K2. In ons model is de binding van X en Y coöperatief (stippellijn in Fig. 1b), zodat hun synergistische binding wordt beschreven door K12 = CK1K2. Coöperatieve binding kan ook plaatsvinden tussen andere componenten; andere coöperativiteit dan die tussen X en Y is echter niet vereist (zie Additional file 1 voor de analyse van coöperativiteit). Daarom behouden we slechts de ene noodzakelijke coöperatieve term om onze hypothesen te testen, en dus gaat onze hoofdanalyse ervan uit dat alle andere bindingsinteracties niet coöperatief zijn.

In procesbesturingstechniek wordt X gezien als een verstoring van het systeem; het doel van standaard FF-regeling (die gebruik maakt van een IFFL-motief) is om het effect dat X heeft op Z te verwerpen. Als de FF-regelaar goed is afgesteld, wordt de uitgangsvariabele op of in de buurt van zijn gewenste waarde gehouden (bijv, binnen 5%), zowel in de transiënte als in de uiteindelijke output (Fig. 1c). In biologische systemen daarentegen wordt X als een ingangssignaal beschouwd en wordt het I1-FFL-motief vaak zo ontworpen dat de niveaus van Z een transiënte respons vertonen en vervolgens (dicht) bij hun oorspronkelijke waarde terugkeren (Fig. 1d). De piekhoogte en het verschil tussen het begin- en eindniveau van Z vertegenwoordigen dus prestatiemetingen (Fig. 1d).

Hier modelleren we de I1-FFL als een stelsel vertragingsdifferentiaalvergelijkingen, die een uitbreiding zijn van het model uit (Eqs. 1-3 in Methods). Merk op dat X zowel Y als Z activeert, met bindende affiniteit K1, terwijl Y Z onderdrukt (zelfs als X ook gebonden is) met bindende affiniteit K2. De laatste term in de noemer van fz is de coöperativiteitsterm (xy/K12 = xy/(CK1K2)). Zie Methoden voor meer details over de afleiding van het model.

In dit artikel houden we x = x0 = 1 voor t < 0, wat resulteert in een aanvankelijke stationaire toestand van y0 en z0. Op het tijdstip t = 0 ondergaat x een stapsgewijze toename: x(t ≥ 0) = x1 > 1, hetgeen resulteert in een aanvankelijke toename van zowel y als z. Na enige tijd begint de toename van y echter ook z te onderdrukken. Voor de meeste waarden van de parameters resulteert dit in een piekwaarde van z (zpeak), gevolgd door een aanpassing terug naar een nieuwe steady state waarde, z1 (Fig. 1d). Hier hebben we het piekniveau en de aanpassingsmetriek genormaliseerd als respectievelijk P ≡ (zpeak – z0)/z0 en f = (z1 – z0)/z0 (zie Fig. 1d). Voor de rest van het artikel nemen we τy = τz = 1, en θy = θz = 0.5.

De incoherente feedforward lus van type I kan worden afgestemd voor perfecte aanpassing

Vorige analyse van het bovenstaande model (Eqs. 1-3) toonde aan dat I1-FFL transcriptionele regulatie kan, onder de juiste voorwaarden, fungeren als een fold-change detector (FCD) . Een van de noodzakelijke voorwaarden voor een model om op te treden als een FCD is bijna perfecte aanpassing (NPA), die optreedt wanneer de uiteindelijke toestand, z1, is binnen een paar procent van de begintoestand, z0 (bijvoorbeeld, |f| ≤ ε = 0,05). Terwijl in eerdere werkzaamheden het model (Eqs. 1-3) werd geanalyseerd vanuit het standpunt van FCD, kan het model (en I1-FFL’s in het algemeen) verschillende andere fenotypen produceren, waaronder de minder beperkende fenotypen van aanpassing en pulsgeneratie.

Onze modelanalyse toont aan dat het mogelijk is om de FFL zodanig af te stemmen dat perfecte aanpassing (PA) wordt bereikt. Met andere woorden, z1 = z0 (blauwe curve in Fig. 2a, b). Deze voorwaarde wordt bereikt wanneer, voor gegeven K1, K2, de waarde van C gelijk is aan CPA, die wordt gegeven door Eq. 5 (zie Methoden). Als de waarde van C enigszins afwijkt van CPA, gaat PA verloren, maar kan NPA behouden blijven. Hier definiëren we CNPA+ en CNPA- als de waarden van C waarbij f = + ε en -ε, respectievelijk (rode en gouden curven in Fig. 2a, b). Voor het grootste deel van dit werk hebben we ε = 0,05 ingesteld; onze resultaten worden echter niet wezenlijk beïnvloed door de precieze waarde van ε (zie Additional file 1).

Tuning van de I1-FFL voor een bijna perfecte aanpassing. a Dynamiek van de output, z(t), bij een stapsgewijze toename van x van 1 tot 10 op het tijdstip t = 0. Blauwe curve: perfecte aanpassing. Rode en gele krommen: bijna perfecte aanpassing, zodat |f| = 0,05. b Genormaliseerde output van z(t). Wanneer de curven worden genormaliseerd, is het duidelijk dat de rode en gele curven een bijna-perfecte aanpassing bereiken. c Heatmap van de waarde van C die nodig is voor perfecte aanpassing gegeven K1, K2, voor een stapsgewijze toename van x van 1 tot 10. De rode curven (hier en elders) vertegenwoordigen contouren waarvan de waarden direct op de plot zijn aangegeven. Merk op dat de asgrenzen voor K1 variëren van sterke (10- 2) tot zeer zwakke (106) affiniteit, terwijl die voor K2 variëren van zeer sterk (10- 6) tot zwak (102). d Heatmap van de piek-metriek, P. Als K1 te laag wordt, daalt deze metriek tot onaanvaardbaar lage waarden. e Absolute niveaus van de piek in de output. Oranje curven: P = 0,1 en CPA = 0,01. Deze curven begrenzen samen met de zpeak = 0,01-contour een biologisch realistisch gebied van de parameterruimte. f. Hittekaart van het genormaliseerde bereik van C-waarden waaronder NPA wordt bereikt. De zwarte curven begrenzen twee regio’s waarin NPA haalbaar is bij elke waarde van C. In regio I zijn Y en Z ontkoppeld en veranderen zij slechts in geringe mate bij toename van X. Regio II wordt beschreven als een FCD-regio, waarin NPA vereist is. In het biologisch realistische gebied van de parameterruimte variëren de waarden van C waaronder NPA kan worden bereikt van 13 tot 65% van CPA

Voor x1 = 10 is een heatmap van CPA-waarden, als functie van K1, K2, afgebeeld in fig. 2c. Merk op dat coöperativiteit vereist is om PA te bereiken: CPA < 1, hoewel het benadert 1 voor K1, K2 ≪ 1 (zie Additional file 1 en Fig. 2c). Aangezien C een vouwverandering coöperativiteit parameter vertegenwoordigt, waarden van C < 1 vertegenwoordigen positieve synergie: wanneer X is gebonden aan de regulerende regio van Z, het verhoogt het vermogen van Y te binden, en vice versa. Een ondergrens voor gerapporteerde waarden van C in andere systemen ligt in de orde van grootte van 0,01 . Aangezien modellen van biologische processen moeten worden beperkt tot biologisch realistische fenotypen, is het onwaarschijnlijk dat PA kan worden bereikt in het rechterbovengebied van de parameterruimte (Fig. 2c).

Meerder waarden van de parameterruimte komen overeen met biologisch realistische fenotypen

Gezien de ruwe ondergrens voor C, is het redelijk zich af te vragen welke andere beperkingen aan het model kunnen worden gesteld. We leggen twee bijkomende biologisch realistische beperkingen op aan het model. Ten eerste moet de relatieve piekgrootte, P = (zpeak – z0)/z0, groter zijn dan 0,1 om een signaalrespons van goede kwaliteit te garanderen. Een heatmap van P als functie van K1, K2 is afgebeeld in Fig. 2d. De P = 0.1 contour ligt bij ruwweg K1 = 0.25; dit impliceert dat, als X de regulerende regio van Z te strak bindt, een 10-voudige toename van x (van 1 tot 10) geen sterke piek oplevert, omdat de Z promotor al verzadigd is, zelfs bij lage waarden van x.

Ten tweede, de absolute piek in z moet groter zijn dan 0.01 (Fig. 2e). Aangezien ons model zodanig is geschaald dat de maximaal mogelijke waarde van z 1 is, komt dit overeen met 1% van de maximaal mogelijke concentratie van z, gegeven de sterkte van de promotor en de afbraaksnelheid. Wij nemen zpeak = 0,01 als minimumwaarde om een biologisch detecteerbaar signaal te verkrijgen; men kan deze minimumwaarde echter enigszins versoepelen, hetgeen onze resultaten niet significant zou beïnvloeden. Met deze drie beperkingen voor CPA, P en zpeak wordt een klein gebied van de K1, K2 parameterruimte als “biologisch realistisch” beschouwd. Voor de context zijn alle drie de contouren uitgezet in Fig. 2e. Nogmaals, dit gebied kan worden gewijzigd als andere waarden van de “biologisch realistische” beperkingen worden gekozen. Ook moet worden opgemerkt dat de biologisch realistische regio ook het gebied van de parameter ruimte waarin de I1-FFL kan fungeren als een puls generator of perfecte adapter afbakent (zie Additional file 1).

Gevoeligheid van NPA met betrekking tot I1-FFL parameters

Robuustheid is een extra doelstelling die vaak wordt opgelegd aan biologische systemen . Daarom hebben wij het bereik van waarden C over CPA geanalyseerd waarvoor NPA gehandhaafd blijft. We definiëren ΔCFF ≡ CNPA+ – CNPA-, en zetten een heatmap van ΔCFF/CPA uit in Fig. 2f (zie Additional file 1 voor de afleiding van CNPA+ en CNPA-). Er zijn twee regio’s van de K1, K2 parameterruimte waarin NPA wordt bereikt ongeacht de waarde van C (zie Additional file 1 en Fig. 2f), die zich geen van beide in de biologisch realistische regio van de parameterruimte bevinden (wit gestippeld gebied in Fig. 2f). In Regio I is de waarde van K1 zo laag dat, zelfs bij x0 = 1, de regulatorische regio’s van zowel Y als Z verzadigd zijn met X, en dus zijn Y en Z relatief ongevoelig voor X (zie Additional file 1). Bovendien is K2 in Regio I groot genoeg dat Y weinig invloed heeft op Z. Een toename van x verandert de waarde van z dus niet merkbaar, wat betekent dat terwijl z1 ≈ z0 (zodat |f| < ε), er geen piek is in de waarde van z (zie Additional file 1: figuur S1). Dit scenario kan niet echt als NPA worden beschreven. Inderdaad, de knooppunten van de IFFL zijn ontkoppeld in deze regio, zodat het biologische fenotype, of de functie, van de IFFL is niet te onderscheiden van twee knooppunten die onafhankelijk van elkaar.

Regio II is eerder gerapporteerd als niet alleen de regio waarin NPA gemakkelijk wordt bereikt, maar ook waar de I1-FFL kan fungeren als een fold-change detector (Additional file 1: figuur S2A) . In dit regime, waarin K1 ≫ 1, K2 ≪ 1, en K1K2 < 1, binding van X is in het lineaire regime, en z hangt af van de verhouding van x / y . Anderzijds is de absolute respons van Z beperkt tot 0,01% van zijn maximum (Additional file 1: figuur S2B).

In tegenstelling hiermee is in het biologisch realistische gebied van de parameterruimte, ΔCFF beperkt tot 13% — 65% van CPA (Fig. 2f). Bijvoorbeeld, voor K1 = 1, K2 = 0.1, kan het systeem, om de doelstelling van NPA te handhaven, slechts een ∼ 30% verstoring van de CPA verdragen. Met andere woorden, het I1-FFL-model is relatief gevoelig voor veranderingen in C als het om NPA gaat. Om de robuustheid van het systeem te vergroten, hebben wij een gecombineerd feedforward/feedback (FF/FB) systeem overwogen.

Transcriptionele negatieve terugkoppelingscycli

In de techniek kan de gevoeligheid van het feedforward regelalgoritme met betrekking tot modelparameters worden afgezwakt door de werking van een negatieve terugkoppelingslus (zie Eqs. 6-8 in Methods). Er is inderdaad aangetoond dat negatieve terugkoppeling robuustheid verleent aan I1-FFL prestatiedoelstellingen, zoals stijgtijd en vervaltijd, in een vereenvoudigd model van genregulatie. Echter, in tegenstelling tot de hoge frequentie van transcriptionele FFL motieven, is eerder gemeld dat er geen transcriptionele cycli (buiten autoregulatie) bestaan in het modelorganisme E. coli . Verdere studies suggereren dat transcriptionele negatieve terugkoppeling zeldzaam is, mogelijk als gevolg van de trage aard van dubbel-transcriptionele lussen, terwijl het wijdverbreide gebruik van gemengde negatieve terugkoppelingslussen wordt erkend, waarbij één tak transcriptioneel is en de andere tak gebaseerd is op eiwit-eiwit interacties . Om dit verder te onderzoeken, analyseerden we een recent bijgewerkte dataset van E. coli transcriptionele interacties, en vonden 17 gevallen van cycli van lengte 2, waarvan vijf positieve terugkoppeling, negen negatieve terugkoppeling, en drie gemengde. Van deze interacties was een van de negatieve feedback cycli ingebed in meerdere I1-FFL structuren (zie Additional file 2).

Een gecombineerd feedforward/feedback systeem is robuuster dan een met feedforward alleen

Gezien de voorspelling met betrekking tot de werkzaamheid van een FB-lus om de robuustheid van NPA in een IFFL motief uit te breiden, onderzochten we een gecombineerd FF/FB systeem. We voegden een vierde knooppunt toe, W, dat geactiveerd wordt door Z, en Z onderdrukt (Fig. 3a, b). Deze interacties introduceren meerdere nieuwe parameters in het model (zie Methoden), waaronder twee affiniteitsbindingsparameters (K3, K4) en een transcriptie/translatie vertraging in W (θw; zie Fig. 3b).

Gedrag van het gecombineerde FF/FB-systeem. a De toevoeging van W aan het netwerkmotief resulteert in een negatieve terugkoppellus waarbij Z en W betrokken zijn. b Illustratie van het mechanisme van negatieve terugkoppeling. Z activeert W en wordt onderdrukt door W. Illustratie van Y niet getoond (zie Fig. 1b). c Dynamiek van de output, z(t), bij een stapsgewijze toename van x van 1 tot 10 op tijdstip t = 0 voor het gecombineerde FF/FB systeem. Blauwe curve: perfecte aanpassing. Rode en gele krommen: bijna-perfecte aanpassing, zodat |f| = 0,05. d Genormaliseerde output van z(t). Wanneer de krommen worden genormaliseerd, is het duidelijk dat de rode en gele krommen zijn afgestemd voor een bijna perfecte aanpassing. De waarde van C die nodig is om NPA te bereiken is verder verwijderd van CPA dan voor het systeem met alleen FF. e Hittekaart van het genormaliseerde bereik van C-waarden waaronder NPA wordt bereikt. De zwarte curven die de regio’s I en II afbakenen zijn analoog aan die beschreven in Fig. 2. In het biologisch realistische gebied (gedefinieerd voor het FF/FB-systeem) varieert het bereik van C-waarden waaronder NPA kan worden bereikt van 25 tot 100% van CPA. f Heatmap van de verhouding van C-waarden waarvoor NPA wordt bereikt voor het FF/FB-systeem versus het FF-only systeem. De toevoeging van een FB-lus verhoogt het bereik van de waarden van C met 21–54%

Om de twee systemen rechtstreeks te vergelijken, hebben wij de verhouding ΔCFFFB/ΔCFF uitgezet in Fig. 3f. Voor het bereik van biologisch realistische waarden is ΔCFFFB 21% – 54% groter dan ΔCFF (verhoudingen van 1,21 – 1,54). (Merk op dat het biologisch realistische gebied getoond in Fig. 3e, f voor het FF/FB systeem is; zie Additional file 1: Figuur S3.) Met uitzondering van een klein gebied van de K1, K2 parameterruimte (nabij Regio II), is het FF/FB systeem inderdaad altijd superieur aan het FF alleen systeem (verhouding groter dan één). Gezien het voordeel van het FF/FB systeem ten opzichte van de NPA doelstellingen, onderzochten we vervolgens of de dynamische eigenschappen van het FF/FB systeem ook voordelig waren.

Zoals eerder vermeld, probeerden we in onze analyse alleen de interacties te behouden die nodig waren om het NPA fenotype zijn robuustheid te verklaren. Als zodanig, alleen de interacties tussen X en Y opgenomen coöperativiteit. We kunnen ook coöperativiteit tussen X en W, of Y en W opnemen, wat geen kwalitatieve invloed heeft op ons resultaat dat het toevoegen van de FB-module aan de I1-FFL de robuustheid van het systeem verhoogt (Additional file 1: figuur S4). Bovendien, onze resultaten zijn niet afhankelijk van de exacte keuze van ε (Additional file 1: figuur S5).

Dynamische analyse blijkt het FF / FB-systeem is superieur aan die met FB alleen

Negatieve feedback lussen worden belaagd door meerdere nadelen . Ten eerste resulteert proportionele terugkoppeling (het meest voorkomende mechanisme dat van nature in biologische systemen voorkomt) altijd in offset (zie Fig. 4a). Met andere woorden, na een verstoring die het systeem verstoort, keert de output niet terug naar zijn oorspronkelijke waarde. Om dit te verzachten, kan men de sterkte van de negatieve terugkoppelingsreactie verhogen. Dit leidt echter vaak tot het tweede grote nadeel van negatieve terugkoppeling: dynamische instabiliteiten en/of ring-oscillaties kunnen het gevolg zijn van sterke negatieve terugkoppeling, vooral in systemen met aanzienlijke vertragingen (Fig. 4b) . Anderzijds, indien de primaire verstoring geheel of gedeeltelijk kan worden afgeweerd door een FFL, kunnen beide nadelen worden vermeden (Fig. 4a, b). Om deze principes in een genregulatiesysteem te onderzoeken, hebben wij het gedrag van een FB alleen model vergeleken met een gecombineerd FF/FB model. Om de dynamische instabiliteit te illustreren, hebben we de Hill coëfficiënt voor alle DNA-binding interacties op n = 2 gezet (zie Additional file 1).

Dynamica van de FB only en gecombineerde FF/FB systemen. a Een (proportionele) negatieve terugkoppeling alleen (blauwe curve) resulteert bij perturbatie altijd in verschuiving ten opzichte van de oorspronkelijke waarde. Een vergelijkbaar gecombineerd FF/FB-systeem kan ook offset vertonen; de I1-FFL in het FF/FB-systeem kan echter worden afgesteld voor een perfecte aanpassing. Het FF/FB-systeem kan ook sneller een stationaire toestand bereiken. b De toevoeging van een I1-FFL aan het FB-systeem kan resulteren in een stabielere dynamiek. Voor deze keuze van parameters is het FB-systeem onstabiel, terwijl het FF/FB-systeem stabiel is. c Heatmap van het reële deel van de belangrijkste eigenwaarde (α) voor het FB-systeem alleen. De zwarte curve is de contour waarvoor α = 0, hetgeen de stabiliteitslimiet van het FB-systeem aangeeft. Kleinere waarden van K4 resulteren in een onstabiel systeem (zie deel B). Hier en elders zijn de waarden van α voor andere contouren (rode curven) direct op de plot aangegeven. d Idem als C, maar dan voor het gecombineerde FF/FB-systeem. e Heatmap van Δα, het verschil tussen de reële delen van de belangrijkste eigenwaarden voor de twee systemen. Aan de rechterkant van de nulcontour zijn de waarden van Δα groter dan nul, hetgeen erop wijst dat het FF/FB-systeem de stationaire toestand sneller benadert. De zwarte en witte curven geven de stabiliteitsgrenzen aan voor respectievelijk het FB en FF/FB systeem (zie ook delen C, D)

Om de stabiliteit van zowel het FB als het gecombineerde FF/FB systeem te bepalen, berekenden wij α, het reële deel van de belangrijkste eigenwaarde (zie Additional file 1), voor variërende waarden van K3, K4 (voor het FF/FB systeem stellen wij K1 = 1, K2 = 0,1; Fig. 4c, d). Geen van beide systemen is duidelijk superieur aan het andere, maar voor een matige activering van W door Z (K4 ≈ 0,1 of meer) neigt een sterke negatieve terugkoppeling (K3 < 0,1) tot een instabiel FB-only systeem, terwijl het FF/FB-systeem altijd stabiel is. Inderdaad, αFB – αFFFB > 0 voor dit gebied van matige activering van W (Fig. 4e). Zelfs wanneer beide systemen stabiel zijn, impliceert αFFFB < αFB dat het FF/FB-systeem sneller een stationaire toestand bereikt (zie bijvoorbeeld fig. 4a). Het toevoegen van een tweede controlelaag kan echter vaak resulteren in compromissen, waarbij een voordeel op één gebied resulteert in een nadeel op een ander gebied. Daarom zullen we de prestaties van het FB only en het gecombineerde FF/FB model vergelijken met betrekking tot twee andere doelstellingen: genormaliseerde piek, P, en absolute piek, zpeak.

Een gecombineerd FF/FB systeem bereikt een compromis over meerdere doelstellingen

Om de prestaties van het FF/FB systeem te vergelijken met die van het FB only systeem, berekenden we de piekwaarde van z in beide systemen terwijl we K3, K4 varieerden van 0,01 tot 1. Eerst vonden we dat de genormaliseerde piek, P, van het FB alleen systeem varieerde van ruwweg 0.7 tot 1 (Fig. 5a). Anderzijds is de genormaliseerde piek voor het FF/FB-systeem bijna onafhankelijk van de K3-, K4-waarden en bedraagt ruwweg 1,256 (zie Additional file 1: figuur S6). Daarom presteert het FF/FB-systeem ook op deze metriek beter dan het FB only-systeem: het FF/FB-systeem is een verbetering van 30-80% ten opzichte van het FB only-systeem (Fig. 5b).

Vergelijking van prestatiecijfers van het FB-only systeem met het gecombineerde FF/FB-systeem. a Heatmap van de genormaliseerde piek, P, voor het FB-only systeem. Deze parameter (en andere in deze figuur gedefinieerde parameters) is niet gedefinieerd voor onstabiele systemen. b Verhouding van P voor het FF/FB-systeem tot die voor alleen FB. Volgens deze metriek presteert het FF/FB-systeem altijd beter dan het systeem met alleen FB. De metriek PFFFB is echter ruwweg constant op 0,46, ongeacht de waarden van K3, K4 (zie Additional file 1). c Heatmap van de absolute piek, Zpeak, voor het FF/FB-systeem en variërende waarden van K3, K4. Merk op dat de absolute piekwaarde in het beste geval 0,06 is. Hoewel dit laag is, is het voldoende. d Verhouding van de absolute piek voor het FF/FB-systeem tot die voor alleen FB. Volgens deze metriek presteert het systeem met alleen FB altijd beter dan het FF/FB-systeem (verhouding kleiner dan één). Gezien de andere prestatiedoelstellingen waarvoor het FF/FB-systeem superieur is, is dit echter een aanvaardbare afweging

Een groot nadeel van het gecombineerde systeem is dat, met twee onderdrukkers van de output (Y en W), de niveaus van de output (in verhouding tot de maximaal mogelijke niveaus) laag zijn. Voor de gekozen parameterwaarden (K1 = 1, K2 = 0,1) blijft zpeak boven de ondergrens van 0,01 (zie Fig. 2e). Dit is echter aanzienlijk lager dan de waarde van zpeak in het systeem met alleen FB (Fig. 5d). Al met al is het gecombineerde FF/FB-systeem superieur in zijn dynamiek en genormaliseerde piekwaarde, terwijl het afbreuk doet aan de absolute piekwaarde.