Ribosome engineering onthult het belang van 5S rRNA autonomie voor ribosoom assemblage

Plasmiden constructie

Alle plasmiden werden geconstrueerd door Gibson assemblage50, met de plasmide backbones bereid door inverse PCR of restrictie nuclease digest en de inserts gegenereerd door PCR of chemisch gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies. De rRNA-coderende plasmiden werden aanvankelijk geëlektroporeerd in E. coli POP2136 cellen (genotypen van alle stammen gebruikt in deze studie zijn vermeld in de aanvullende tabel 1) en transformanten werden hersteld op LB-platen aangevuld met de juiste antibiotica; platen werden geïncubeerd bij 30 ° C om de expressie van de rRNA-genen gecontroleerd door de lambda PL promotor31 te voorkomen. Alle andere plasmiden werden getransformeerd en vermeerderd in de E. coli JM109 stam en gekweekt bij 37 ° C in LB-media aangevuld, indien nodig, met 100 ug / ml ampicilline (Amp), 50 ug / ml kanamycine (Kan) of 50 ug / ml spectinomycine (Spc).

Bouw van de ptRNA100 plasmide

De plasmide backbone met inbegrip van de pA15 oorsprong van replicatie en Spc resistentiegen, was PCR geamplificeerd van de ptRNA67 plasmide51 met behulp van de primers NA1 en NA2 (alle primers zijn vermeld in de aanvullende tabel 4). Het tRNA-gen cluster (coderend tRNAGlu, tRNAAla, tRNAIle, tRNATrp, en tRNAAsp), onder controle van de Ptac promoter en T1 terminator, werd gesynthetiseerd als een gBlock (Integrated DNA Technology). De pTRNA100 plasmide werd gegenereerd door Gibson assemblage. De structuur van het plasmide werd geverifieerd door restrictiedigestie en de aanwezigheid van de tRNA-cluster op het plasmide werd bevestigd door PCR-amplificatie met de primers NA3 en NA4 en door sequencing.

Bouw van de pDH42, pDH39, en pCH84 plasmiden

De constructen die hybride 23S-cp5S rRNA gen dragen werden gegenereerd op basis van het plasmide pAM55229, dat het E. coli rrnB rRNA operon bevat. Het 5S rRNA-gen werd verwijderd door inverse PCR met primers NA17 en NA18, die de Xho1-restrictieplaats herbergen, digestie van het PCR-product door Xho1, en DNA-ligatie. De Ery resistentie mutatie A2058G werd vervolgens geïntroduceerd in de 23S rRNA-gen door site-directed mutagenese met behulp van de QuikChange Lightning Multi Site-directed mutagenese kit (Agilent Technologies) met primer NA7. De resulterende plasmide, pAM552Δ5S werd gebruikt om de cp5S rRNA-genen met linkers op drie verschillende plaatsen binnen het 23S rRNA-gen te introduceren.

De voorbereiding van de cp5S rDNA-sequentie voor integratie in 23S rDNA werd uitgevoerd in één PCR-reactie waarbij primerparen NA8/NA9 (voor DH39- en DH42-constructen) of NA26 en NA27 (voor CH84-constructen) (elk 100 nM) die de cp5S rDNA-integrator bevatten, werden gecombineerd met primerparen (250 nM) die de cp5S rDNA-sequentie bevatten, werden gecombineerd met primerparen (250 nM elk) die willekeurige sequentie-linkers, in grootte variërend van 0 tot 3 nt, introduceerden op de “linker” en “rechter” 23S-cp5S-knooppunten, als volgt: NA10-NA13 en NA14-NA17 voor de DH39; NA18-NA21 en NA22-NA25 voor DH42; NA28-NA31 en NA32-NA35 voor CH84.

Voor het genereren van de DH39, DH42, en CH84 plasmide bibliotheken, werd de pAM552Δ5S plasmide geopend door inversed PCR met primerparen NA36/NA37, NA38/NA39, en NA40/NA41, respectievelijk. De cp5S rDNA inserts werden geïntroduceerd in de resulterende PCR-geamplificeerde plasmide backbones door Gibson assemblage reacties. De reactieproducten werden getransformeerd in E. coli POP2136 cellen door elektroporatie en de transformanten werden hersteld op LB / Amp agar platen gekweekt bij 30 ° C (omstandigheden die expressie van de plasmide-borne rRNA te voorkomen). Elke bibliotheek had ten minste 3-maal meer klonen dan de geschatte theoretische diversiteit van 7225 varianten. Kolonies werden gewassen van de LB-platen, plasmide bibliotheken werden geëxtraheerd en opgeslagen.

Vervanging van ptRNA67 met ptRNA100

De E. coli SQ171 stam die chromosomale rRNA allelen mist en draagt de pCSacB plasmide als de bron van de rRNAs genen en ptRNA67 plasmide als de bron van de ontbrekende chromosomale tRNA genen32,52, werd gebruikt als de start-gastheer stam. Om de ptRNA67 plasmide vervangen door ptRNA100, werden SQ171 cellen eerst getransformeerd met ptRNA-Amp (verstrekt door Michael O’Connor, Universiteit van Missouri, Kansas City), die lijkt op ptRNA67 maar verleent Amp weerstand en bevat de pBR322 oorsprong van replicatie. De transformanten werden vervolgens genezen van de ptRNA67 plasmide door passaging in LB-medium aangevuld met Amp en Kan voor ~ 100 generaties. Het verlies van de ptRNA67 plasmide werd geverifieerd door de gevoeligheid van de klonen voor Spc op replica plating. De resulterende stam werd vervolgens getransformeerd met ptRNA100 en uitgezet op LB-agar aangevuld met Spc en Kan. Transformanten werden gepasseerd voor ~ 100 generaties in LB-media aangevuld met Spc en Kan. Het verlies van de ptRNA-Amp plasmide werd geverifieerd door de gevoeligheid van individuele klonen voor Amp, zoals blijkt uit replica uitplating. De aanwezigheid van ptRNA100 en het ontbreken van ptRNA67 werden bovendien geverifieerd door PCR en restrictiedigestie van de totale plasmiden bereid uit de resulterende kloon.

Inactivatie van het recA-gen in de SQ171/ptRNA100-cellen

Het recA-gen in de SQ171/ptRNA100-stam werd geïnactiveerd door P1-faagtransductie. De donorstam BW25113 recA::cat werd eerst bereid door de conventionele recombineerprocedure52 met chlooramfenicol (Chl)-resistentiecassette van het pKD3-plasmide52. De cassette werd PCR-geamplificeerd met de primers NA42 en NA43. Het PCR-fragment werd getransformeerd in de BW25113-stam die het rode recombinase-expressieve plasmide pDK46 draagt. Na controle van de integratie van de cat-cassette en uitharding van pKD46 werden de BW25113 recA::cat-cellen gebruikt als donors voor de faagtransductie. P1 fagen transductie werd uitgevoerd volgens het standaard protocol53 behalve dat het herstel incubatie werd verlengd van 1 tot 3 uur voor het uitplaten van de transductanten op LB / agar platen aangevuld met Kan, Spc en 15 ug / ml Chl. Voor de excisie van de kat cassette, de resulterende stam werd getransformeerd met pZFLP-TetR plasmide dat het flippase enzym codeert en de transformanten werden uitgeplat op de LB / agar plaat aangevuld met Kan, Spc en 2,5 ug / ml tetracycline (Tet). De eliminatie van het kat-gen werd bevestigd door PCR en door Chl-gevoeligheid van de klonen. Vervolgens werd de pZFLP-TetR plasmide uitgehard door de cellen gedurende ~100 generaties te passeren in LB-medium aangevuld met Kan, Spc, en de resulterende klonen werden getest op gevoeligheid voor Tet. De resulterende stam werd genoemd SQA18 (Supplementary Table 1).

Invoering van de 23S-cp5S bibliotheken in SQA18 cellen

De plasmide bibliotheken geëxtraheerd uit POP2136 cellen werden getransformeerd in SQA18 cellen door elektroporatie. Na 2 uur herstel bij 37 ° C, werden transformanten uitgezet op LB / Amp agar platen die vervolgens werden geïncubeerd overnacht bij 37 ° C. Kolonies werden gewassen uit de agar platen en 0,01 A600 (~106 cellen) werden geplaatst in een volume van 2 ml LB-medium aangevuld met 150 ug / ml Ery en 0,25% sucrose. Na groei gedurende 16 uur, werden de cellen uitgeplaat op agar platen met Amp, 1 mg / ml Ery, en 5% sacharose. De platen werden gedurende 48 uur bij 37 °C geïncubeerd. Er verschenen levensvatbare kolonies bij de DH42- en CH84-bibliotheken, maar niet bij de DH39-bibliotheek. Verschillende van de kolonies die op de platen verschenen werden getest door kolonie PCR voor de aanwezigheid van 23S-cp5S rDNA met behulp van de primerparen NA44/NA45 voor de DH42 construct en primers NA46/NA47 voor de CH84 construct. Afwezigheid van de wt 5S rRNA-gen werd geverifieerd door kolonie PCR met primers NA48 en NA49.

Selectie van de voorkeur 23S-cp5S rRNA linkers

De totale DH42 plasmide bibliotheek geïsoleerd uit de POP2136 cellen werd getransformeerd in SQA18 cellen en uitgezet op LB / Amp platen zoals hierboven beschreven. De kolonies (~ 50.000) werden gewassen van de plaat en de totale plasmide werd geëxtraheerd uit ~ 109 cellen en gebruikt als een pre-selectie library.

Approximately 109 cellen werden vervolgens onderworpen aan de plasmide uitwisselingsprocedure. Meer specifiek werden ze geplaatst in een volume van 20 ml LB-medium aangevuld met 150 ug / ml Ery en 0,25% sucrose. Na groei gedurende 4 uur, werden de cellen uitgeplaat op agar platen met Amp, 1 mg / ml Ery, en 5% sacharose. De platen werden gedurende 48 uur bij 37 °C geïncubeerd. Kolonies (~50.000) werden van de plaat gespoeld. De geëxtraheerde totale plasmide van deze cellen vertegenwoordigde de post-selectie bibliotheek.

De cp5S rDNA geflankeerd door 23S rDNA sequenties en linkers werd PCR geamplificeerd uit de pre-selectie en post-selectie bibliotheek plasmide preparaten met primers NA50 en NA51. De PCR-bibliotheken werden onderworpen aan de volgende generatie sequencing.

De vouw-verrijkingsfactor voor elke combinatie van linkers werd berekend met behulp van de volgende procedure. Na het trimmen van de adapter, werd de gehele sequentie van cp5S rRNA, met uitzondering van de terminale 4 nucleotiden aan elk uiteinde, geëlimineerd om het aantal valse sequentie varianten die als gevolg van sequencing fouten binnen de 5S-codering sequentie verscheen te verminderen. De resulterende sequentie motieven werden geteld in de pre- en post-selectie bibliotheken en de frequentie van de fractie van elke linker variant werd berekend.

Preparatie van totaal cellulair RNA

Overnacht culturen van de E. coli POP2136 of SQA18 stammen werden gekweekt bij 30 ° C of 37 ° C, respectievelijk, in LB / Amp medium. De culturen werden 1:100 verdund in 2 ml vers medium en bij 37 °C gekweekt tot A600 ~ 0,5. Cellen werden geoogst door centrifugatie (5000 × g, 1 min) en geresuspendeerd in 100 ul van lysisbuffer. Na toevoeging van 400 pi extractiebuffer (50 mM Bis-Tris pH 6,5, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA) en incubatie gedurende 5 min bij kamertemperatuur, werd totaal RNA geëxtraheerd door fenol/chloroformextractie. RNA werd ethanol-precipitated, het RNA pellet werd gewassen met 1 ml 70% ethanol, opgelost in RNase-vrij water, snap bevroren en opgeslagen bij -80 ° C.

Sucrose gradiënt analyse van de ribosomen en polysomen

Overnight E. coli culturen werden verdund in 50 ml LB / Amp medium en gekweekt tot A600 ~ 0,5. Chl werd toegevoegd aan een eindconcentratie van 125 ug / ml en na 5 min incubatie, werden de cellen geoogst door centrifugatie (5000 × g, 10 min, 4 ° C). De celpellets werden geresuspendeerd in ijskoude lysisbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml lysozym, 0,25% natriumdeoxycholaat en 2U RQ1 RNasevrije DNase I). De cellen werden gelyseerd door drie cycli van vriezen en dooien. De lysaten werden geklaard door centrifugeren (20.000 × g, 15 min, 4 °C) en 20 A260 eenheden lysaat werden geladen op 12 ml van 10-40% lineaire sucrose gradiënt in buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 2 mM β-mercaptoethanol. De gradiënten werden gecentrifugeerd (3 uur, 4 °C) bij 39.000 tpm in een SW41-rotor (Beckman). De gradiënten werden gefractioneerd met een fractionator (BioComp), waarbij de extinctie bij 254 nm werd geregistreerd. Fracties die overeenkomen met de 50S subeenheden, 70S ribosomen, en polysomen werden samengevoegd. RNA werd geïsoleerd door fenol / chloroform extractie en ethanol precipitation.

Osolatie van 70S ribosomen en ribosomale subeenheden

Voor de isolatie van tight-couple ribosomen54, werden ’s nachts E. coli culturen verdund in 1 L van LB / Amp medium en gekweekt tot A600 ~ 0,5. Cellen werden geoogst door centrifugatie (5.000 g, 15 min, 4 ° C), geresuspendeerd in buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0, 6 mM β-mercaptoethanol, 10 U / ml RQ1 RNase-vrij DNase I), en gelyseerd met behulp van Franse pers bij 10.000 psi. De lysaten werden geklaard door centrifugeren in de JA25-50 rotor (Beckman) bij 13.000 rpm gedurende 30 min bij 4 °C en de supernatanten werden geladen op 10 ml 1,1 M sucrose kussen bereid in een buffer met 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, pH 8,0 en 6 mM β-mercaptoethanol, in 35 ml Quick-Seal centrifugeerbuisjes (Beckman). Ribosomen werden gepelleteerd door centrifugatie gedurende 16 uur bij 36.000 rpm (4 °C) in een Ti70-rotor (Beckman). De ribosomenpellet werd geresuspendeerd in buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl en 6 mM β-mercaptoethanol) en 100 A260 eenheden werden geladen op 10-40% sucrosegradiënt bereid in buffer B in de buisjes van een SW27 rotor (Beckman). De gradiënten werden gedurende 21 uur bij 20.000 rpm (4 °C) gecentrifugeerd in een SW27-rotor, gefractioneerd met behulp van gradiëntfractionator (BioComp) en de fracties die 70S-ribosomen en 50S-ribosomale subeenheden bevatten, werden afzonderlijk gepoold. Materiaal werd geconcentreerd met behulp van 2 ml Vivaspin concentrators (Sartorius) met cellulose triacetaat membraan en teruggewonnen in ribosoom opslag buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoethanol). Aliquots van ribosomen en ribosomale subeenheden werden flash-bevroren en bewaard bij -80 ° C. Indien nodig, werd rRNA geïsoleerd door fenol / chloroform extractie en ethanol precipitatie.

Voor de isolatie van de 50S subeenheden van de 70S ribosomen, 130 pmol ribosomen, bereid als hierboven beschreven, maar geconcentreerd door pelleteren en opgeslagen in de ribosoom buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM β-mercaptoethanol) werden verdund in buffer D (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NH4Cl, 0,5 mM EDTA, 6 mM β-mercaptoethanol) tot een 1,5 mM eindconcentratie van MgCl2 te bereiken. Ribosomale subeenheden werden gescheiden door centrifugatie in 10-40% sucrose gradiënten bereid in buffer D dat 1,5 mM MgCl2 bevatte. Gradiënten werden gecentrifugeerd gedurende 16 uur bij 27.000 rpm (4 ° C) in een SW27 rotor (Beckman), gefractioneerd, geconcentreerd, en teruggewonnen in de ribosoom opslag buffer, zoals hierboven beschreven. Aliquots werden flash-bevroren en bewaard bij -80 ° C.

LC-MS/MS analyse van ribosomale eiwitten

Eiwitsamenstelling van wt en mutant tight-couple 70S ribosomen en 50S ribosomale subeenheden, bereid zoals hierboven beschreven, werd bepaald met behulp van kwantitatieve massa-spectrometrie55. Ribosomale preparaten werden gemengd in een 1:1 molaire verhouding met SILAC-gelabelde wt ribosomen die massa gelabeld arginine (Arg6: 6HN4O2 en lysine (Lys4: C6H104N2O2) (Silantes GmbH, Duitsland). Ribosomale eiwitten werden gedigesteerd met trypsine (Sigma) of Lys-C protease (Wako, USA). De resulterende peptiden werden gefractioneerd en geanalyseerd via LC-MS/MS met behulp van LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific). Eiwitidentificatie en kwantificeringsanalyse werden uitgevoerd met Maxquant v1.5.6.056 en Perseus v1.6.2.357. Maxquant zoeken werd gedaan met behulp van E. coli MG1655 eiwit sequentie database van UniProtKB (24.04.2019). Eiwit abundantie werd genormaliseerd voor grote en kleine subeenheid eiwitten afzonderlijk door het verschuiven van de gemiddelde L / M-verhouding tot 1.

Chemische sondering van rRNA structuur

rRNA structuur werd gesondeerd in de 70S ribosomen geïsoleerd uit wt of mutant cellen. De ribosomen (10 pmol) werden geplaatst in 50 pi modificatiebuffer en geactiveerd door incubatie gedurende 5 min bij 42 ° C. De modificatiereactie werd gestart door toevoeging van 2 pi dimethylsulfaat (Sigma) verdund 1:10 in ethanol. De monsters werden gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De modificatiereacties werden gestopt door toevoeging van 50 μl vers bereide stopoplossing (600 mM NaOAc, 1 M β-mercaptoethanol) en 300 μl ethanol. De monsters werden geprecipiteerd, geresuspendeerd in buffer (300 mM natriumacetaat, 5 mM EDTA, pH 8,0, 0,5% SDS) en het RNA werd geïsoleerd door fenol/chloroformextractie en ethanol-precipitatie. Primer extensies werden uitgevoerd met primers NA56-NA57.

Analyse van de mutant rRNA inhoud

Voor de analyse van de aanwezigheid van de gemanipuleerde 23S-cp5S rRNA, totaal RNA werd geïsoleerd uit de sucrose gradiënt fracties zoals hierboven beschreven. De mutant 23S-cp5S rRNA inhoud werd beoordeeld door primer extensie met behulp van NA58 of NA59 primers. Specifiek 5′-gelabelde primer (0,5 pmol) werd geanneerd tot 1 ug totaal RNA in hybridisatiebuffer (50 mM K-HEPES, pH 7,0, 100 mM KCl) door incubatie bij 90 ° C gedurende 1 min en vervolgens afkoelen over 15 min tot 42 ° C, en uitgebreid met 2 U van AMV reverse transcriptase (Roche) gedurende 20 min bij 42 ° C in een uiteindelijke reactie volume van 8 µl. Voor de NA58 primer bevatte de reactie 0,25 mM ddATP en 0,2 mM dCTP, dGTP, dTTP. Voor de NA59 primer bevatte de reactie 0,25 mM ddCTP en 0,2 mM dATP, dGTP, dTTP. Reacties werden beëindigd door toevoeging van 120 pl stopbuffer (84 mM NaOAc, 0,8 mM EDTA, pH 8,0, 70% EtOH), koeling bij -80 ° C gedurende 15 min, en pelleteren nucleïnezuren door centrifugatie bij 15.000 × g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Het supernatants werd verwijderd, de pellets werden gedroogd en opgelost in formamide laadkleurstof. De cDNA-producten werden opgelost in een 12% denaturerende polyacrylamidegel en gevisualiseerd door fosforimaging.

In vitro translatie

In vitro translatiereacties werden uitgevoerd in het Δribosome PURExpress celvrij translatiesysteem (New England Biolabs). De DNA-sjablonen die de T7 RNA polymerase promoter, ribosoom bindingsplaats, en het eiwit-coderende sequentie bevatten werden bereid door PCR. De ermBL sjabloon werd bereid met primers NA52-NA55. De GFP-template werd gegenereerd uit het sf-gfp-gen van plasmide pY71-sfGFP58 met behulp van de primers NA31 en NA32. Dihydrofolate reductase (DHFR) werd tot expressie gebracht uit het plasmidesjabloon dat bij de PURExpress-kit werd geleverd.

De translatiereactie voor de expressie van GFP werd geassembleerd in een totaal volume van 10 μl en bevatte 2 μl van de PURExpress-kit oplossing A, 1.2 pi factor mengsel, 1 pi aminozuur mengsel (3 mM elk), 1 pi tRNA (20 ug / ml), 16 U van RiboLock RNase inhibitor (ThermoFisher), 10 ng GFP sjabloon en 12 pmol van wt of mutant ribosomen. De monsters werden in wells van een 384-well weefselkweekplaat met zwarte wand/heldere vlakke bodem (BD Biosciences) geplaatst en afgedekt met het deksel. De reacties werden geïncubeerd bij 37 °C in een microplatelezer (Tecan) waarbij de GFP-fluorescentie om de 10 min werd geregistreerd bij λexc = 488 nm en λem = 520 nm over een periode van 4 uur.

Expressie van DHFR werd gevolgd door incorporatie van -L-methionine in het full-size eiwit. Vertaling werd uitgevoerd in 10 pi reacties samengesteld als hierboven beschreven, maar aangevuld met 5 μCi -L-methionine (1175 Ci/mmol), met 50 ng van het DNA-sjabloon en 6 pmol van wt of mutant ribosomen. De reacties werden geïncubeerd bij 37 °C. Elke 12 min, 1 pl aliquots werden teruggetrokken, gemengd met 3 pl van SDS-bevattende gel laadkleurstof en opgeslagen op ijs tot het reactieverloop werd voltooid. De eiwitproducten werden geanalyseerd door SDS-gelelektroforese in 16,5% Bis-Tris gels (Biorad) met NuPAGE MES/SDS running buffer (Invitrogen). De gels werden gekleurd, gedroogd en ’s nachts aan een fosforimager-scherm blootgesteld. Radioactieve banden werden gevisualiseerd door fosforimaging.

Cryo-EM analyse van de 70S ribosomen en 50S subeenheden

Cryo-EM roosters werden als volgt bereid. 400 M koperen roosters bedekt met kantige koolstof en een 2 nm dunne laag koolstof (Ted Pella Inc) werden gloei-ontladen met 20 mA stroom met negatieve polariteit voor 60S in een PELCO easiGlow gloei-ontlading eenheid. Een Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) werd vooraf gekalibreerd op 4 ° C en 95% relatieve vochtigheid. Een aliquot van eerder flash-bevroren ribosomen werd ontdooid en wanneer opalescentie werd waargenomen, werd de oplossing geklaard in een microcentrifuge (10 minuten bij 16.000 × g bij 4 ° C). De concentratie van het gewiste supernatant werd afgeleid uit A260 gemeten met een Nanodrop (ThermoFisher) en de ribosomen werden verdund tot 200 nM in LPP-buffer. Drie µl van 200 nM ribosoom oplossing werden toegepast op raster, na een 10S vertraging van het raster werd geblot voor 4S en vervolgens ondergedompeld in vloeibare stikstof gekoeld ethaan.

Data werden verzameld op een Talos elektronenmicroscoop (ThermoFisher) die werkt bij 200 KV en uitgerust met een K3 directe elektronen detector (Gatan Inc) gericht op 0,5-1,8 urn onderfocus. Het verzamelen van gegevens was geautomatiseerd met SerialEM59 met behulp van bundel kantelen om meerdere films (bijvoorbeeld een schot op het midden, 6 met verschuiving) te verzamelen op elk podium positie60. Super-resolutie films had een totaal van 19 frames met 1,5 e- / A 2 per frame voor een totale dosis van 30 e- / A 2 op het monster. Een totaal van 5222 films werden verzameld over 22 uur. Films werden uitgelijnd op de vlieg tijdens het verzamelen van gegevens met behulp van IMOD 61 tot frames decomprimeren, de gain referentie toe te passen, bin de super-resolutie data om fysieke pixel van 0,87 Å op monster, en corrigeren voor beeld drift.

Eerste stappen van 3D-kaart generatie van CTF bepaling, referentie-vrij deeltje plukken (489.732 deeltjes), en stapel creatie werden uitgevoerd in cisTEM. Deeltjes uitlijning en verfijning werden uitgevoerd in Frealign 9.11 en cisTEM62,63. Om de verwerking te versnellen, werden 2×-, 4×-, en 8×-bined beeldstapels voorbereid met behulp van resample.exe, dat deel uitmaakt van de FREALIGN distributie64. Het oorspronkelijke model voor deeltjes uitlijning van 70S kaarten was EMD-100365, die werd gedownsampled tot 8 × gebunkt beeld stack met EMAN266 overeenkomen. Twee zoekrondes van modus 3 met een hoge-resolutie cutoff van 30 Å en vervolgens 20 Å werden uitgevoerd met behulp van de 8× gekwantificeerde stack. Vervolgens werden 7 verfijningsrondes van modus 1 uitgevoerd met de 4×, uiteindelijk ongebunkerde stack terwijl geleidelijk resolutieschelpen werden toegevoegd (limiet van 5 Å) en de resolutie 2,94 Å bereikte.

Twintig ronden van 3D maximale waarschijnlijkheid classificatie zonder maskering en tot 14 Å resolutie werd gebruikt om snel te scheiden 8x gepoolde deeltjes in 12 klassen van verschillende samenstellingen onthullen 50S subeenheden, 70S ribosomen zonder tRNA, of 70S ribosomen met tRNA’s en de 30S in een geroteerde of niet-geroteerde conformatie (Supplementary Fig. 3a). 50S deeltje (133.490), lege 70S deeltjes (120.428), of tRNA-gebonden, niet-geroteerde toestand 70S deeltje (55.677) substacks werden gecreëerd met behulp van de 1x gekuild stack met behulp van merge_classes.exe, onderdeel van de Frealign pakket, waarbij deeltje scores van 0 en een minimum van 50% bezetting. De substacks werden vervolgens weer verdund tot 4x met behulp van resample.exe om verdere classificatie stappen te versnellen.

De 50S deeltjes substack werd gescheiden in 6 klassen met een 55-Å radius focus masker rond de 5S rRNA gedeelte van de 23S-cp5S hybride rRNA. Klassen met zwak of afwezig uL16 en/of bL33 en klassen die verschilden in 5S rRNA-positie werden gescheiden. De klassen werden gereconstrueerd met de oorspronkelijke uitlijning en beam tilt parameters bij 1x binning en een van deze klassen werd gebruikt voor structurele modellering zoals in de volgende paragraaf wordt beschreven.

De 70S deeltjes werden ook onderzocht. De lege (geen tRNA) 70S deeltjes subpack werd gescheiden in 12 klassen met behulp van dezelfde 55-Å focus masker. De klassen vertoonden verschillen in uL16 en/of bL33 bezetting en 5S rRNA positie, vergelijkbaar met de 50S klassen hierboven beschreven. Echter, in tegenstelling tot de 50S deeltjes, 3 van de 12 lege 70S klassen onthuld een normaal gevouwen PTC.

Classificatie van de klassieke-staat tRNA-gebonden 70S deeltjes substack in 12 klassen met hetzelfde masker onthuld bijna stoichiometrische bezetting van 16 uL, en alle deeltjes hadden een normaal gevouwen PTC en sterke P-tRNA dichtheid. In tegenstelling, de tRNA bezetting van de A site was zwak in sommige klassen met zwakkere L33 dichtheid. Classificatie van de 70S deeltjes met een geroteerde 30S en hybride-staat P/E-tRNA in 12 klassen onthulde ook variërende bezettingen van uL16 en bL33, en zeven klassen hadden een afwijkende PTC.

De 3.2Å cryo-EM structuur van het 70S ribosoom gebonden met de A en P tRNAs67 werd gebruikt als startmodel voor structuur verfijningen. De ribosoom componenten/domeinen werden in kaart gebracht met Chimera68. Hierbij werden de 50S, L1 steel, L11 steel, 30S lichaam en kop, en tRNAs onafhankelijk van elkaar gefit. Modellering van 5S rRNA, en aanpassingen aan de PTC en decodering centrum werden gemaakt met behulp van PyMOL69. De structurele modellen werden verfijnd met behulp van real-space gesimuleerde-annealing verfijning met behulp van RS Ref 70,71 tegen overeenkomstige kaarten. Verfijningsparameters, zoals de relatieve weging van stereochemische beperkingen en experimentele energieterm, werden geoptimaliseerd om de optimale structuur stereochemie, real-space correlatiecoëfficiënt, en R-factor, die rapporteert over de pasvorm van het model aan de kaart72 te produceren. Secundaire structuurrestricties, bestaande uit waterstofbrugrestricties voor ribosomale eiwitten en basis-paringrestricties voor RNA-moleculen, werden gebruikt zoals beschreven73. De structuren werden vervolgens verfijnd met phenix.real_space_refine74 gevolgd door een verfijningsronde in RSRef waarbij harmonische restricties werden toegepast om de geometrie van de eiwitten te behouden70,71. Phenix werd gebruikt om B-factoren van de modellen te verfijnen tegen hun respectievelijke kaarten zonder B-factor filtering74. De resulterende structuurmodellen hebben goede stereochemische parameters, gekenmerkt door een geringe afwijking van ideale bindingslengtes en -hoeken en komen goed overeen met de overeenkomstige kaarten, zoals aangegeven door hoge correlatiecoëfficiënten en lage real-space R-factoren (supplementaire tabel 2). Figuren werden voorbereid in PyMOL69.

Rapportage samenvatting

Meer informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.