Regulering van de Cholesterolsynthese

00:00:08.12Mijn naam is Russell DeBose-Boyd,
00:00:10.03en ik ben van het Departement van Moleculaire Genetica
00:00:12.01 aan de University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas.
00:00:15.17In deze presentatie,
00:00:17.19 zal ik het hebben over de feedback regulatie van HMG CoA reductase,
00:00:20.27 dat het snelheidsbeperkende enzym is in de synthese van cholesterol.
00:00:25.06Dus, deze dia toont de structuur van cholesterol
00:00:27.06en enkele van de kenmerken van deze belangrijke molecule.
00:00:31.01Colesterol is een sterol,
00:00:33.10 die zich onderscheidt door deze vier-rings structuur.
00:00:36.00Deze vier-rings structuur geeft stijfheid aan dit molecuul,
00:00:39.Dat maakt het een ideale component van celmembranen.
00:00:43.18Nou, omdat cholesterol een groot aantal koolstof-koolstof en koolstof-hydrogeen bindingen heeft,
00:00:49.02is deze molecule vrijwel onoplosbaar in water.
00:00:52.07Dus, om deze reden,
00:00:54.13moeten de cellen in staat zijn om cholesterol in een smal bereik te houden,
00:00:58.03zodat er genoeg cholesterol wordt geproduceerd voor de cellulaire behoeften van het molecuul
00:01:02.13maar de giftige overaccumulatie van cholesterol wordt vermeden.
00:01:06.16Overaccumulatie van cholesterol kan op cellulair niveau giftig zijn.
00:01:12.11Nu, deze dia toont enkele van de essentiële functies van cholesterol.
00:01:15.10Cholesterol is absoluut noodzakelijk voor het leven.
00:01:17.26Zoals ik al eerder zei,
00:01:19.Een van de meest bekende rollen van cholesterol is zijn rol in celmembranen,
00:01:25.08waar het een optimale membraanvloeibaarheid handhaaft.
00:01:29.00Nou, cholesterol blijkt een belangrijke precursor te zijn
00:01:32.01 voor zeer belangrijke moleculen zoals steroïde hormonen,
00:01:34.25 die helpen onderscheid te maken tussen meisjes en jongens;
00:01:38.19bile zuren, die helpen bij de spijsvertering en voeding door het oplossen van voedingsvetten en vetoplosbare vitaminen;
00:01:47.10 en dan tenslotte, cholesterol is overvloedig aanwezig in de hersenen,
00:01:50.18waar het voorkomt in myelinescheden die axonen omgeven
00:01:53.17en helpen bij synap… synaptische transmissies.
00:01:58.18Nu, cellen in ons lichaam — zoog… zoogdiercellen —
00:02:02.01krijgen cholesterol via twee bronnen.
00:02:04.21Een van de bronnen wordt op deze dia geïllustreerd,
00:02:07.06 en dat is door de synthese van cholesterol
00:02:09.19uit de precursor acetyl CoA.
00:02:13.00Nou, de omzetting van acetyl CoA in cholesterol
00:02:15.21 gebeurt door de werking van meer dan 20 enzymen.
00:02:20.22Nou, zoals u zich kunt voorstellen,
00:02:22.21 de synthese van cholesterol impliceert de productie van verscheidene tussenproducten,
00:02:26.16 en deze tussenproducten zelf kunnen ook worden omgezet in zeer belangrijke eindproducten.
00:02:33.11 Bijvoorbeeld, deze verbinding, farnesyl pyrofosfaat,
00:02:36.29is een precursor voor een belangrijke verbinding genaamd dolichol,
00:02:40.25die betrokken is bij N-gekoppelde glycosylatie.
00:02:43.26Het is ook een precursor voor heem en ubiquinonen,
00:02:46.10die betrokken zijn bij de celademhaling;
00:02:49.26vitamine K, dat betrokken is bij de bloedstolling;
00:02:53.12en dan tenslotte worden dit farnesylpyrofosfaat en geranylgeranylpyrofosfaat
00:02:58.06vastgehecht aan vele signaaleiwitten,
00:03:01.16kleine GTP-eiwitten,
00:03:03.22die ze naar de membranen leiden,
00:03:06.12en deze modificatie is absoluut noodzakelijk voor een normale celfunctie.
00:03:13.04Nu, deze dia laat zien dat de synthese van cholesterol
00:03:16.02in verschillende weefsels in verschillende snelheden plaatsvindt.
00:03:19.29Nu, de lever en de bijnieren
00:03:23.14synthet meeste cholesterol in ons lichaam.
00:03:25.10En ik moet erop wijzen dat dit eigenlijk werd gedaan in muizen,
00:03:28.06maar soortgelijke effecten worden gezien in mensen
00:03:31.07en andere primaten.
00:03:33.19De lever… de lever synthetiseert grote hoeveelheden cholesterol
00:03:36.24voornamelijk de productie van lipoproteïnen
00:03:39.14en ook voor de galzuursynthese.
00:03:42.10De bijnieren produceren cholesterol
00:03:45.28voornamelijk voor de synthese van steroïde hormonen,
00:03:48.13 terwijl de darmen cholesterol aanmaken om…
00:03:51.27voor de celdeling.
00:03:54.12Een groot aantal cellen in de darmen wordt elke dag afgestoten
00:03:57.12en moeten worden vervangen door nieuwe cellen,
00:03:59.27waarvoor een aanzienlijke hoeveelheid cholesterolsynthese nodig is.
00:04:03.28Ik moet er ook op wijzen dat de darm ook een bron van lipoproteïneproductie is.
00:04:09.21Dus, nu de tweede bron van cholesterol
00:04:12.12is eigenlijk van de lipoproteïnen
00:04:15.16die worden geproduceerd door de lever en de darm.
00:04:18.06Dit is een model van de low-density lipoprotein.
00:04:23.02Dit is de belangrijkste cholesteroldrager in menselijk plasma.
00:04:28.02Dus, de low-density lipoprotein, of LDL,
00:04:31.14bestaat uit een kern die is samengesteld uit vrije cholesterol.
00:04:36.19Dus, de hydrofobe cholesterol vormt de kern van het LDL deeltje.
00:04:41.19Nu, deze hydrofobe cholesterol
00:04:44.01wordt omgeven door een omhulsel dat bestaat uit een fosfolipide
00:04:47.02met verschillende hoeveelheden veresterde cholesterol
00:04:51.13–dit is cholesterol waaraan een vetzuur is gehecht —
00:04:55.14e dat in het fosfolipide omhulsel is ingebed.
00:04:59.03Nu, dit hele LDL deeltje
00:05:02.18is omgeven door een eiwit genaamd apolipoproteïne B.
00:05:08.02Dus, deze dia laat eigenlijk zien
00:05:10.17hoe cellen cholesterol verkrijgen uit deze twee bronnen:
00:05:13.13endogene synthese en uit LDL.
00:05:18.19LDL-receptoren
00:05:21.09–zij bevinden zich op het oppervlak van cellen —
00:05:23.20binden zich aan LDL door interactie met dit apolipoproteïne B deeltje dat het lipoproteïne omhulsel omhult.
00:05:32.25Als het LDL deeltje zich eenmaal bindt aan de LDL receptor,
00:05:35.27 wordt het hele complex geïnternaliseerd in gecoate putjes.
00:05:40.06En deze gecoate putjes worden vervolgens naar lysosomen gebracht,
00:05:43.07waar het LDL deeltje wordt afgebroken en het cholesterol
00:05:47.15 – vrije cholesterol –
00:05:49.25 komt nu vrij en wordt aan de cel geleverd voor verschillende toepassingen.
00:05:54.18Dus, nogmaals, deze twee bronnen van cellulaire cholesterol
00:05:58.03 – hetzij van de receptor… LDL receptor-gemedieerde endocytose van LDL,
00:06:03.07of door endogene synthese —
00:06:06.02kunnen door elkaar worden gebruikt.
00:06:09.01Dus, bijvoorbeeld, als LDL limiterend wordt,
00:06:12.00 schakelt de cel over op endogene synthese voor zijn bronnen van cholesterol.
00:06:18.02En als de endogene synthese wordt geblokkeerd,
00:06:20.05dan kunnen de cellen nu exogeen LDL
00:06:23.01gebruiken voor hun bron van cholesterol.
00:06:27.00Dus, we hebben gesproken over de essentiële functie van cholesterol.
00:06:30.10Het is belangrijk in celmembranen.
00:06:32.11Het is een belangrijke voorloper van steroïde hormonen
00:06:34.28en galzuren.
00:06:36.16Echter, er is een slechte kant van cholesterol,
00:06:38.13en dat wordt geïllustreerd in deze dia.
00:06:41.00Er zijn al een aantal jaren verhoogde niveaus van LDL-cholesterol in het bloed
00:06:46.14geassocieerd met een risico op coronaire hartziekten
00:06:49.19en hartaanvallen.
00:06:51.16Dus, hier getoond kunt u zien dat
00:06:54.27het cholesterolgehalte in het bloed letterlijk correleert met het risico op coronaire hartziekten.
00:07:01.09En dit komt omdat verhoogd cholesterol
00:07:04.21zich kan afzetten in de slagaders die leiden naar het… naar het hart.
00:07:08.12En na verloop van tijd resulteert deze afzetting
00:07:11.15in een ziekte die atherosclerose wordt genoemd,
00:07:13.09waarin deze afzetting van cholesterol
00:07:15.04kan leiden tot de productie van plaques
00:07:17.12die uiteindelijk de bloedstroom naar het hart kunnen blokkeren,
00:07:19.18en zo een hartaanval kunnen veroorzaken.
00:07:23.06Nou, een van de meest voorgeschreven geneesmiddelen
00:07:28.16om LDL-cholesterol te verlagen
00:07:31.11is een groep geneesmiddelen genaamd statines.
00:07:33.03Hier ziet u de typische kernstructuur van de statines
00:07:37.26en enkele van de verschillende vormen van statines
00:07:41.29die in de kliniek zijn gebruikt.
00:07:44.22In de loop der jaren zijn de statines
00:07:47.12 uitgegroeid tot een van de meest… de meest verkochte medicatie…
00:07:49.10medicijnen in de Verenigde Staten
00:07:51.20omdat ze in staat zijn het LDL-cholesterolgehalte in het bloed te verlagen.
00:07:57.19Dus, getoond in dit experiment is een samenvatting van ten minste vier studies
00:08:02.23die aantonen dat statines inderdaad het LDL-cholesterol verlagen
00:08:06.06en dat die verlaging leidt tot een verminderde incidentie
00:08:10.04van coronaire hartziekten.
00:08:12.11Dus, hier weergegeven in de gesloten cirkels zijn klinische trials
00:08:15.11waarin patiënten ofwel werden behandeld met een statine, weergegeven in de… weergegeven in de gesloten cirkels,
00:08:20.22of een placebo.
00:08:22.11En in elk van deze studies leidde de statinebehandeling tot
00:08:25.17een daling van het LDL-cholesterolgehalte,
00:08:28.06en deze daling van het LDL-cholesterolgehalte
00:08:31.19leidde tot een vermindering van coronaire gebeurtenissen, d.w.z. hartaanvallen.
00:08:35.13Dus, dan wordt de vraag, je weet wel, hoe werken statines?
00:08:38.21En wat doen statines?
00:08:40.28Dus, wij hebben eerst geantwoord, wat doen statines?
00:08:43.16Dus, statines remmen het enzym HMG CoA reductase.
00:08:47.05HMG CoA reductase katalyseert
00:08:50.20de snellimiterende stap in de synthese van cholesterol.
00:08:53.28Het is eigenlijk de vierde stap in de cholesterol synthetische route.
00:08:58.06Dus, statines remmen HMG CoA reductase
00:09:01.20concurrerend door het product van de reductase reactie na te bootsen,
00:09:05.13mevalonate.
00:09:07.20Dus, deze concurrerende remming van de reductase
00:09:10.19onderbouwt het vermogen van statines om
00:09:14.18LDL cholesterol in het bloed te verlagen.
00:09:18.07Dus, hoe werken statines?
00:09:20.17Dus, nogmaals, door concurrerend HMG CoA reductase te remmen,
00:09:24.01 leidt dit tot een daling van de hoeveelheden mevalonaat
00:09:27.09 en natuurlijk een daling van cholesterol.
00:09:30.18Deze cholesteroldepletie leidt tot een toename
00:09:33.12in de transcriptie van het gen
00:09:36.06die de LDL-receptor codeert.
00:09:37.25En als gevolg daarvan het aantal van de LDL-receptoren op het oppervlak…
00:09:41.14vooral van de levercellen,
00:09:43.15en deze toename van LDL-receptoren leidt
00:09:48.01tot een verhoogde of versterkte opname van bloed LDL.
00:09:52.25En die verlaging van bloed-LDL
00:09:55.26is verantwoordelijk voor de verlaging van coronaire hartziekten
00:09:58.20in statine-behandelde patiënten.
00:10:02.12De klinische effecten van statines
00:10:05.26worden echter feitelijk afgezwakt door
00:10:09.06de compenserende toename van HMG CoA reductase
00:10:11.10 die gepaard gaat met statine therapie.
00:10:13.19En dat wordt geïllustreerd in deze dia.
00:10:15.13Dit is een immunoblot van HMG CoA reductase eiwit
00:10:19.03in de levers van muizen die een statine toegediend hebben gekregen,
00:10:22.17of zelfs in gekweekte cellen
00:10:25.00die in vitro met statines zijn behandeld.
00:10:26.24En zoals u kunt zien,
00:10:28.20 veroorzaakt statinebehandeling een duidelijke accumulatie
00:10:31.09van HMG CoA reductase.
00:10:33.10En deze accumulatie, zoals ik al eerder zei,
00:10:35.24blunt de klinische effecten van statines.
00:10:38.12Dus, onze volgende vraag is, waarom veroorzaken statines HMG CoA reductase om te accumuleren tot zo’n hoog niveau?
00:10:44.14Dat is naar schatting minstens 200 keer zo hoog.
00:10:49.29Dus normaal gesproken is HMG CoA reductase
00:10:51.25onderhevig aan een enorme hoeveelheid feedback regulatie.
00:10:55.02En deze terugkoppelingsregulatie wordt gedeeltelijk
00:10:57.29gemedieerd door sterolen.
00:11:00.02Nou, statinebehandeling, zoals ik eerder noemde,
00:11:02.05blokkeert HMG CoA reductase activiteit,
00:11:04.12en het voorkomt de synthese van deze sterolmoleculen.
00:11:07.29En natuurlijk is die preventie van sterolsynthese
00:11:10.26 feitelijk verantwoordelijk voor de upregulatie van de LDL-receptoren
00:11:14.17en de daaropvolgende verlaging van LDL-cholesterol.
00:11:18.09Maar omdat de statines de synthese van sterolen blokkeren,
00:11:22.18verstoort het de feedbackregulatie van de reductase.
00:11:25.14En als gevolg daarvan gebeuren er drie gebeurtenissen.
00:11:27.28Eerst, vanwege deze reductie van cholesterol
00:11:31.09 en andere producten van de cholesterolsynthetische route,
00:11:35.08er is een verhoogde transcriptie van het reductase gen,
00:11:39.07er is een verhoogde translatie
00:11:41.28van het reductase mRNA,
00:11:43.17en ten slotte is er een verhoogde stabiliteit
00:11:45.24van het reductase-eiwit.
00:11:47.13Dus, deze drie gebeurtenissen zijn verantwoordelijk
00:11:49.19voor die duidelijke toename van het reductase-eiwit
00:11:52.03die ik u op de vorige dia heb laten zien.
00:11:55.18Mijn laboratorium is dus in de loop der jaren geïnteresseerd geweest in het proberen te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verhoogde stabiliteit van het eiwit,
00:12:02.2209en dat zal het onderwerp zijn van de rest van deze presentatie.
00:12:09.16Dus, deze dia illustreert dat sterolen
00:12:13.08de afbraak versnellen
00:12:15.26van HMG CoA reductase.
00:12:17.14Dus, in dit experiment,
00:12:19.11we gebruikten klassieke pulse-chase analyse
00:12:20.29om de stabiliteit van reductase te controleren in cellen
00:12:23.16die zijn behandeld in de afwezigheid of aanwezigheid van sterolen.
00:12:26.00Dus, wat we hier doen is cellen labelen met radioactiviteit,
00:12:29.27 een kleine subset van HMG CoA reductase moleculen.
00:12:33.25We halen dan die radioactiviteit weg,
00:12:35.25 en volgen dan de pres…
00:12:37.25de stabiliteit van het reductase eiwit
00:12:39.26in de afwezigheid of aanwezigheid van sterolen.
00:12:44.10En zoals u hier kunt zien,
00:12:46.08wanneer de cellen worden gekweekt in media
00:12:49.07die geen radioactiviteit bevatten,
00:12:51.01in de afwezigheid van sterolen
00:12:52.28is de reductase redelijk stabiel in de tijd.
00:12:55.16Het toevoegen van sterolen in het chase-medium
00:12:57.21 zorgt er echter voor dat het reductase-niveau duidelijk afneemt.
00:13:02.20Wederom is dit indicatief voor de sterol-versnelde degradatie
00:13:06.04of HMG CoA reductase.
00:13:09.16Nu, om de moleculaire mechanismen te begrijpen
00:13:11.22voor deze sterol-geïnduceerde degradatie van de reductase,
00:13:14.15moeten we de structuur van het HMG CoA reductase eiwit begrijpen.
00:13:18.05En de domein structuur van de reductase
00:13:20.14is eigenlijk geïllustreerd in deze dia.
00:13:22.18Het HMG CoA reductase
00:13:24.16bestaat dus uit twee verschillende domeinen.
00:13:26.28Het heeft een N-terminaal domein
00:13:29.06dat het eiwit verankert in de membranen van het endoplasmatisch reticulum,
00:13:32.14of de ER.
00:13:35.00Nu, dit N-terminale domein,
00:13:36.29 waarnaar we verwijzen als het membraandomein,
00:13:39.04bevat acht membraan-overspannende gebieden.
00:13:42.05En het wordt gevolgd door het tweede domein van HMG CoA reductase,
00:13:45.07die wij het katalytische domein noemen.
00:13:47.24Dus, het katalytische domein steekt uit in het cytosol van cellen
00:13:51.24en bevat alle enzymatische activiteit van HMG CoA reductase.
00:13:56.03In feite, een afgeknotte versie van het reductase
00:13:59.29 die alleen het katalytische domein bevat
00:14:02.13kan de synthese van mevalonaat
00:14:06.28in cellen die HMG CoA reductase missen volledig redden.
00:14:10.13Dus, het katalytische domein is zowel noodzakelijk als voldoende
00:14:13.01voor de synthese van mevalonaat.
00:14:15.29Dat doet dan de vraag rijzen,
00:14:17.28waarom is dit eiwit membraan-gebonden?
00:14:19.26En het blijkt dat het reductase
00:14:22.02 eigenlijk al bij gist een membraangebonden eiwit is.
00:14:25.18Dus, de functie van het membraandomein van reductase
00:14:28.26werd geïllustreerd in dit vroege experiment
00:14:31.27 waarin de stabiliteit van het katalytische domein
00:14:35.08–dat, vergeet niet, alle enzymatische activiteit bevat —
00:14:37.26met het volledige enzym werd vergeleken.
00:14:40.20En opnieuw, een eenvoudige pulse-chase analyse
00:14:42.21werd gebruikt om de stabiliteit van deze twee eiwitten te controleren.
00:14:47.13Zoals u kunt zien in het paneel aan de linkerkant,
00:14:49.03het afgeknotte katalytische domein produceert
00:14:53.14een zeer stabiel eiwit dat… belangrijk,
00:14:57.08 de afbraak ervan niet wordt beïnvloed door sterolen.
00:14:59.20In tegenstelling daarmee is het eiwit dat het volledige eiwit is — dat, nogmaals, het membraandomein bevat —
00:15:03.07 minder stabiel, zelfs in afwezigheid van sterolen.
00:15:06.13En je kunt zien dat sterolen de afbraak van HMG CoA reductase duidelijk versnellen,
00:15:12.09 wat aangeeft dat het membraandomein…
00:15:15.12de functie van het membraandomein
00:15:17.25is voor deze sterolversnelde of sterol-geïnduceerde degradatie.
00:15:22.08Dus, wat de vorige studies aangaven
00:15:25.12is dat het membraandomein van de reductase
00:15:28.03 noodzakelijk en voldoende is voor sterolversnelde afbraak,
00:15:30.25en zij suggereerden dat het membraandomein,
00:15:33.16hetzij direct of indirect,
00:15:35.16 intracellulaire niveaus van sterolen kan waarnemen.
00:15:38.00En de waarneming resulteert in, misschien,
00:15:41.02een conformatieverandering in het membraandomein van de reductase
00:15:43.29 waardoor het eiwit vatbaar wordt voor snelle degradatie.
00:15:48.14En natuurlijk, omdat statines de synthese van cholesterol blokkeren,
00:15:52.01 blokkeren statines inderdaad dit
00:15:54.22wat we noemen ER-geassocieerde degradatie — of ERAD —
00:15:57.08van HMG CoA reductase.
00:16:02.23Dus, een belangrijke doorbraak in ons begrip
00:16:04.23van de ERAD van HMG CoA reductase
00:16:06.15kwam met de ontdekking van een paar eiwitten
00:16:08.28–EER-membraaneiwitten–
00:16:10.23 genaamd Insig-1 en Insig-2.
00:16:14.15Deze Insig-eiwitten zijn, in het kader van deze lezing,
00:16:16.27 zeer redundant.
00:16:18.14Ze vervullen overbodige rollen in de degradatie, of ERAD,
00:16:22.06van HMG CoA reductase.
00:16:24.00Ze zijn identiek… ze zijn ongeveer 85% identiek,
00:16:26.23en het zijn zeer hydrofobe eiwitten.
00:16:29.24Nu, de rol van Insigs in de ERAD van HMG CoA reductase
00:16:34.28werd voor het eerst geïllustreerd in dit experiment.
00:16:37.19Dus, ook hier gebruikten we pulse-chase analyse
00:16:40.15om de sterolversnelde degradatie
00:16:43.29van de reductase te meten in cellen
00:16:47.02die ofwel waren getransfecteerd met controlemoleculen,
00:16:51.06zogeheten siRNA’s,
00:16:53.05of cellen die waren getransfecteerd met siRNA’s
00:16:55.26dat zou leiden tot de knockdown van expressie
00:16:58.13van zowel Insig-1 als Insig-2.
00:17:02.07En zoals u in het paneel links kunt zien,
00:17:04.13in de cellen getransfecteerd met de controle siRNAs,
00:17:08.04sterolen versnellen duidelijk de afbraak
00:17:12.07van HMG CoA reductase.
00:17:14.13Dus, open cirkels zijn experimenten uitgevoerd in afwezigheid,
00:17:17.09en de gesloten cirkels zijn experimenten uitgevoerd
00:17:20.15in aanwezigheid van sterolen.
00:17:22.12En wat duidelijk te zien is, is dat het uitschakelen van Insig-1 en Insig-2
00:17:26.23de sterolversnelde degradatie volledig elimineert,
00:17:30.02aangevend dat deze eiwitten
00:17:32.28een sleutelrol spelen in het proces.
00:17:35.27Dus, onze volgende vraag is,
00:17:38.02wat is het mechanisme
00:17:39.26waarbij de Insigs de ERAD van HMG CoA reductase versnellen?
00:17:47.09Dus, dit experiment…
00:17:48.21deze dia laat zien dat remmers van het proteasoom, het 26S proteasoom,
00:17:53.21 de sterol-geïnduceerde afbraak van HMG CoA reductase blokkeren.
00:17:57.15Dus, zoals u in dit experiment kunt zien…
00:18:00.18in de eerste twee banen, veroorzaakten sterolen dat het reductase duidelijk werd afgebroken,
00:18:04.17en deze degradatie wordt volledig geblokkeerd
00:18:06.19wanneer deze cellen worden behandeld met de proteasoomremmer.
00:18:12.03Dus, met… dit stelt ons in staat om een ander model te creëren
00:18:15.27waarin, nogmaals, het membraandomein van het reductase direct of indirect niveaus van intracellulaire sterolen registreert,
00:18:18.2515e veroorzaakt dat de reductase zich bindt aan Insigs,
00:18:28.12 en dat binding aan Insig leidt tot reacties die ertoe leiden dat de reductase nu wordt afgebroken door het 26S proteasoom.
00:18:37.22Nou, het is bekend dat de meeste substraten van de proteasomen
00:18:41.00 hun voorafgaande ubiquitinatie vereisen.
00:18:44.05Ubiquitinatie is een proces waarbij
00:18:46.23het kleine eiwit ubiquitine covalent wordt vastgemaakt aan substraatmoleculen.
00:18:50.16En zodra een keten van ubiquitines
00:18:54.16is vastgemaakt aan substraten,
00:18:56.08 wordt het herkend door de proteasomen voor afbraak.
00:19:00.25Nu, dit wordt polyubiquitinatie genoemd,
00:19:02.25 en polyubiquitinatie van eiwitten
00:19:05.14is de werking van ten minste drie verschillende soorten enzymen nodig.
00:19:07.29Dat wordt op deze dia geïllustreerd.
00:19:11.09In de eerste stap wordt subiquitine geactiveerd
00:19:13.15.20op een ATP-afhankelijke manier door een enzym genaamd E1,
00:19:19.11of ubiquitin-activating protein.
00:19:22.15In de volgende stap wordt de ubiquitine overgebracht van E1 naar…
00:19:27.13naar een ander enzym, genaamd E2, of ubiquitine-conjugerend enzym.
00:19:32.16In de laatste stap combineert de E2 met een E3,
00:19:36.24of ubiquitine ligase,
00:19:39.08die op zijn beurt wordt geassocieerd met het substraat,
00:19:42.09hier in groen afgebeeld.
00:19:44.11Wat de E3 doet is het vergemakkelijken van de overdracht van ubiquitine
00:19:47.27van het ubiquitine-conjugerende enzym
00:19:50.00naar een lysineresidu in het substraateiwit,
00:19:53.08waaruit een ubiquitinatedubstraat ontstaat.
00:19:57.28Nu, dit proces vindt vele malen plaats,
00:20:00.totdat een ubiquitineketen is opgebouwd op het substraateiwit.
00:20:06.02Dat kan nu worden herkend door de proteasomen voor degradatie.
00:20:10.18Dus, gezien het feit dat deze Insig-eiwitten
00:20:12.26 nodig zijn voor de degradatie van het reductase,
00:20:15.08 en dat het reductase daadwerkelijk wordt afgebroken door proteasomen,
00:20:19.02 is onze volgende vraag, wordt het reductase geübiquitineerd?
00:20:23.20Die vraag werd beantwoord in dit experiment
00:20:26.11op deze dia.
00:20:28.21Dus, wat we in dit experiment hebben gedaan, is dat we cellen hebben behandeld
00:20:31.15 in de afwezigheid en aanwezigheid van sterolen
00:20:33.20 en de proteasoomremmer.
00:20:37.05Na deze behandelingen,
00:20:39.11we immunoprecipiteren het reductase
00:20:41.21 en onderzoeken die immunoprecipitaten op totaal reductase,
00:20:43.20op het onderste paneel,
00:20:45.18of geübiquitineerd reductase.
00:20:49.07Dus, zoals u kunt zien in de eerste baan,
00:20:51.01ook al wordt reductase in deze experimenten naar beneden getrokken,
00:20:55.11we zien geen reactiviteit met ubiquitinatie.
00:20:58.14De sterolen veroorzaken echter dat het reductase wordt geübiquitineerd.
00:21:03.09En deze ubiquitinatie wordt duidelijk verhoogd
00:21:07.22als we ook proteasoomremmers toevoegen.
00:21:09.27Dit duidt er dus op dat sterolen
00:21:12.16 inderdaad veroorzaken dat het reductase wordt geübiquitineerd,
00:21:14.20en dit geübiquitineerde eiwit wordt nu afgebroken door proteasomen,
00:21:17.18zoals blijkt uit de stabiliteit van het geübiquitineerde reductase
00:21:21.21door deze proteasoomremmers.
00:21:24.27Onze volgende vraag is,
00:21:27.07zijn Insigs nodig voor deze sterol-geïnduceerde ubiquitinatie van het reductase?
00:21:32.16En opnieuw wenden we ons tot siRNAs.
00:21:35.08Cellen werden getransfecteerd met ofwel de controle siRNA
00:21:38.18of siRNA’s tegen Insig-1 en -2.
00:21:41.03We behandelen deze cellen vervolgens in de afwezigheid of aanwezigheid van sterolen,
00:21:43.20en sonderen vervolgens op geübiquitineerd reductase.
00:21:47.16 En zoals u in de eerste twee banen kunt zien, wordt
00:21:49.10het reductase mooi geübiquitineerd in de aanwezigheid van sterolen,
00:21:52.08 en de knockdown van Insig-1 en Insig-2
00:21:56.02volledig elimineert deze ubiquitinatie.
00:22:01.01Dus, dat stelt ons nu in staat om meer gaten te vullen in ons model
00:22:04.07voor de Insig-gemedieerde ERAD van HMG CoA reductase.
00:22:09.14Nu blijkt dat een subset van Insig moleculen
00:22:12.00 daadwerkelijk associeert met een E3/E2 ubiquitin ligase complex.
00:22:16.27Nogmaals, in de aanwezigheid van sterolen,
00:22:20.15 het membraandomein van het reductase
00:22:23.03 het sterol,
00:22:24.25 en deze detectie zorgt ervoor dat het reductase zich bindt aan Insigs,
00:22:27.28 en natuurlijk slaan deze Insigs
00:22:31.13 slaan een brug tussen het reductase en het E3/E2 ubiquitine ligase complex.
00:22:36.26Deze brug resulteert vervolgens in de ubiquitinatie van reductase
00:22:40.00 op twee lysine residuen in het membraandomein.
00:22:43.17En deze ubiquitinatie zorgt er vervolgens voor dat het reductase
00:22:46.17wordt verwijderd van het ER-membraan
00:22:50.09en vervolgens wordt afgebroken door proteasomen,
00:22:52.22 door een proces dat we niet volledig…
00:22:55.07door een proces dat we niet volledig begrijpen.
00:23:00.20Dus, samenvattend, ik heb u vandaag verteld
00:23:03.16that HMG CoA reductase is the rate-limiting enzyme
00:23:06.07in the cholesterol synthetic pathway,
00:23:08.01 and it’s a target of these cholesterolverlagende statine drugs.
00:23:11.26De reductase wordt gecontroleerd door een zeer complex
00:23:15.16feedback-regulerend systeem
00:23:18.01dat wordt bemiddeld door cholesterol en andere soorten sterolen.
00:23:20.En dat statines dit feedback regulerende systeem verstoren, gedeeltelijk door het blokkeren van deze Insig-gemedieerde ubiquitinatie
00:23:27.10 en ERAD van HMG CoA reductase.