Plasmid-Mediated AmpC β-Lactamase CITM and DHAM Genes Among Gram-Negative Clinical Isolates

Background

Drug resistentie onder sommige van de Gram-negatieve bacteriën (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii, en Pseudomonas aeruginosa) is opgedoken en wereldwijd verspreid. Onder de Enterobacterales-familie zijn Escherichia coli en Klebsiella spp. vaak geïsoleerde organismen die opmerkelijke geneesmiddelenresistentie-eigenschappen hebben. β-lactamines zijn de vaakst voorgeschreven geneesmiddelen tegen deze recalcitrante stammen, en alleen al vormen zij ongeveer twee derde van de recente klinische voorschriften.1 Deze groep omvat vier grote chemische klassen: penicillines, cefalosporines, carbapenems en monobactamines, waarbij carbapenems worden gebruikt als laatste redmiddel in de empirische therapie tegen pathogene stammen van Gram-positieve, Gram-negatieve en anaerobe bacteriën.2

Resistentie tegen β-lactamines is toe te schrijven aan de productie van β-lactamasen, de hydrolytische enzymen die de antibiotica kunnen inactiveren voordat zij de penicillinebindende eiwitten (PBP’s) op het cytoplasmamembraan bereiken.3 Tot de belangrijkste families van β-lactamasen behoren plasmide-gemedieerde extended-spectrum β-lactamasen (ESBL’s), AmpC, cefalosporinasen, en carbapenemasen. Alle klassen zijn wereldwijd gedetecteerd, met enkele concentraties in specifieke landen.1

De genen die coderen voor AmpC β-lactamase hebben zich op grote schaal verspreid en zijn op grote schaal gedetecteerd in bacteriële plasmiden. De eerste op een plasmide gecodeerde AmpC-variant werd voor het eerst geïdentificeerd in 1989 bij Klebsiella pneumoniae, geïsoleerd in Zuid-Korea. Het werd CMY-1 genoemd vanwege zijn fenotypische eigenschap geassocieerd met cephamycinase en was berucht om zijn resistentie tegen cefoxitine.4,5 In een korte tijdspanne werden vele families van plasmide-gemedieerde AmpC-varianten gedetecteerd, voornamelijk uit de isolaten van K. pneumoniae en E. coli. Bacteriën die plasmide-gemedieerde AmpC genotypes bezaten werden toegewezen op basis van homologie in nucleïnezuursequentie, waardoor een groter aantal bacteriegeslachten werd gevormd die als bron fungeerden van deze plasmiden en een aantal AmpC families.6 Tot op heden zijn wereldwijd de volgende AmpC-families gerapporteerd: twee families CMY β-lactamasen (CMY-1 en CMY-2) geïsoleerd uit respectievelijk Aeromonas hydrophila en Citrobacter freundii; enzymen van het FOX- en MOX-type geïsoleerd uit Aeromonas spp.de ACC-familie afkomstig van H. alvei; de LAT-familie van cefalosporinases geïsoleerd uit C. freundii; de MIR- en ACT-families afkomstig van Enterobacter spp.; en de DHA-familie geïsoleerd uit Morganella morganii.4,6,7 De meeste door plasmiden gecodeerde AmpC-genen worden aangetroffen in isolaten van E. coli en K. pneumoniae bij nosocomiale infecties, terwijl resistentie bij andere Gram-negatieve bacteriën zoals E. cloacae, C. freundii, S. marcescens en M. morganii wordt verleend door chromosoom-gemedieerde AmpC β-lactamasen, waardoor de resistentie tegen breedspectrum cefalosporinen wordt vergroot.8 De organismen die ESBL’s produceren, vaak gekenmerkt door co-expressie met AmpC β-lactamasen, vormen een ernstige bedreiging bij de diagnose en behandeling van de ziekteverwekkers.

Bovendien zijn AmpC β-lactamasegenen, met name MOXM, CITM, DHAM, EBCM, FOXM en ACCM verantwoordelijk voor de ontwikkeling van breedspectrumresistentie tegen de meeste β-lactamines (met uitzondering van cefepime en carbapenems). Bovendien kan de verwerving van deze genen in de bacteriën de resistentie verder vergroten omdat remmers van klasse-A-enzymen (waaronder clavulaanzuur, sulbactam en tazobactam) en p-chlooromercuribenzoaat niet werkzaam zijn tegen AmpC β-lactamasen, hoewel sommige daarvan wel door tazobactam of sulbactam kunnen worden geremd.6

Hoewel inspanningen worden gedaan om de groei en verspreiding van geneesmiddelresistente ziekteverwekkers te beteugelen, zijn de studies naar AmpC β-lactamases in resource-limited settings nog steeds ontoereikend. De belangrijkste stap om het hoofd te bieden aan de toenemende antimicrobiële resistentie (AMR) is de nauwkeurige opsporing van pathogene (en/of resistente) stammen in diagnostische laboratoria. Niettemin bieden de laboratoriumprotocollen voor routinerapportering in Nepal geen nauwkeurig resultaat omdat AmpC β-lactamases moeilijk te identificeren zijn met fenotypische tests alleen en in klinische laboratoria vaak ten onrechte als ESBL’s worden gedetecteerd. Enterobacterales-isolaten die positief zijn bij de screeningstest van het ESBL-fenotype maar negatief bij de bevestigingstest, worden gewoonlijk beschouwd als potentiële AmpC β-lactamase-producenten, hetzij door chromosoomdepressie, hetzij door plasmide-overdracht.9

Zelfs de deskundige klinische microbiologen slagen er niet in plasmide-gemedieerde AmpC β-lactamase te identificeren, wat wijst op een behoefte aan preciezere en specifiekere methoden voor de snelle detectie. Sommige van deze procedures zijn echter arbeidsintensief en vereisen vaak reagentia die niet gemakkelijk verkrijgbaar zijn.10 Om deze redenen worden AmpC β-lactamasen niet gedetecteerd in klinische specimens. Daarom is een betrouwbaarder en valide laboratoriumprotocol bestaande uit multiplex polymerase kettingreactie (PCR) ontwikkeld om de diagnose van plasmide-gecodeerde AmpC-genen die verantwoordelijk zijn voor AmpC β-lactamase-expressie in verschillende klinische infecties te vergemakkelijken.11

De meeste studies zijn gericht op de prevalentie van ESBL-enzymen in Gram-negatieve klinische isolaten in Nepal.12-16 Er is een beperkt aantal studies naar AmpC β-lactamases enzymen in Gram-negatieve bacteriën in Nepal. Een studie uitgevoerd in Kathmandu vallei rapporteerde 27,8% van Enterobacterales isolaten als AmpC β-lactamases producenten met behulp van fenotypische methode.17 Voor zover ons bekend, zijn er beperkte studies met betrekking tot detectie en karakterisering van AmpC β-lactamases enzymen in Gram-negatieve bacteriën met behulp van zowel fenotypische en genotypische methoden in Nepal. Het is essentieel om standaard fenotypische en genotypische methoden op te zetten voor antibiotica-gevoeligheidstesten om de drug-resistente ziekteverwekkers in ziekenhuizen te screenen. Deze studie werd ondernomen om de AmpC β-lactamasegenen (blaCITM en blaDHAM) in Gram-negatieve bacteriële isolaten te isoleren en te identificeren met behulp van zowel fenotypische screening als bevestigingsmethoden.

Methoden

Study Design

Dit is een ziekenhuisgebaseerde cross-sectionele studie uitgevoerd van juni 2017 tot januari 2018 in het Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences (ANIAS). Een totaal van 1151 niet-dubbele klinische monsters werden verzameld en verwerkt tijdens de studieperiode. De monsters omvatten urine (n=412), bloed (n=206), katheter tip (n=163), pus (n=132), ontlasting (n=89), CSF (n=53), wond swab (n=58), en vaginale swab (n=38). De specimens werden verkregen in een steriele, goed gelabelde en lekvrije container; en zo snel mogelijk verwerkt.18 Alle bezoekende patiënten die verdacht werden van bacteriële infecties en die hun toestemming gaven om betrokken te worden, werden in de studie opgenomen. Deelnemers aan de studie met onvoldoende demografische informatie werden uitgesloten.

Kweek van de specimens en identificatie van de isolaten

Stalen werden verzameld volgens de standaard microbiologische richtlijnen voor het verzamelen van urine, ontlasting, pus, bloed, CSF en kathetertip. In aanmerking komende monsters werden verder geënt op bloedagar (BA) Chocolate agar (CA) en MacConkey agar (MA). Bovendien werden urinemonsters geënt op Chromogene UTI-agar. De isolaten werden geïdentificeerd aan de hand van standaard microbiologische parameters zoals morfologische verschijningen van de kolonies, kleurreacties en biochemische eigenschappen.19,20

Antibioticagevoeligheidsbepaling

Alle geïdentificeerde Gram-negatieve isolaten ondergingen verder een in vitro antimicrobiële gevoeligheidstest met behulp van de gemodificeerde Kirby-Bauer schijfdiffusiemethode.21 Eerst werden inoculums gemaakt door bacteriekolonies van nutriënt agar over te brengen in steriele normale zoutoplossing. De troebelheid van de inoculums werd gelijkgesteld aan 0,5 McFarland standaard zoals beschreven in de CLSI richtlijnen. De tapijtcultuur van de testinoculums werd ook bereid op Muller-Hinton agar (MHA). Antibioticaschijven (HiMedia India Pvt. Ltd, Bengaluru, India) werden gebruikt in de volgende verhoudingen amoxicilline (10 μg), azithromycine (10 μg), amikacine (30 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitine (30 μg), ceftazidime (30 μg), ciprofloxacine (5 μg), imipenem (10 μg), piperacilline/tazobactam (100/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), cotrimoxazol (25 μg), en cefepime (30 μg). De geïnoculeerde plaat werd tot 18 uur aeroob geïncubeerd bij 37°C. Na voldoende incubatie werden de remmingszones (ZOI) rond de schijven gemeten en werd het resultaat geclassificeerd als gevoelig, intermediair of resistent.21 Isolaten die resistentie vertoonden tegen drie of meer antibiotica van verschillende klassen werden geïnterpreteerd als multidrugresistent.22

Screening voor AmpC β-Lactamases

De isolaten werden eerst gescreend op mogelijke productie van AmpC β-lactamases volgens de CLSI-richtlijnen, 2019.23 Voor screening werden ceftazidime of cefotaxime of cefoxitine of ceftriaxone, elk van 30 µg, onderworpen aan AST-testen en organismen die resistent waren tegen die antibiotica (die een inhibitiezone van diameter ≤ 18mm vertoonden) werden gescreend als potentiële AmpC-producenten en ondergingen verdere bevestigingstesten.

Bevestiging voor AmpC β-Lactamases

Screening positieve AmpC β-lactamases producenten werden bevestigd door AmpC schijf test en inhibitor-gebaseerde bevestigingstest (boorzuur test).

In boorzuur test, werd de tapijt cultuur van het test organisme gemaakt op MHA plaat met 0,5 McFarland oplossingen. Twee cefoxitineschijfjes (30 µg), waaraan fenylboorzuur (400 µg) was toegevoegd, werden op de tapijtcultuur op de MHA-plaat gelegd en geïncubeerd, waarna de resultaten werden geïnterpreteerd. Als er een toename van de remmingszone met ≥5 mm was wanneer de gewenste antibioticaschijf (ceftazidime of cefotaxime) werd beoordeeld in combinatie met fenylboronzuur dan tijdens de test zonder de combinatie (antibioticaschijf alleen), werd het isolaat gemarkeerd als positief bevestigend.

In de schijfbenaderingstest, werden schijven over de tapijtcultuur van E. coli ATCC 25922 gelegd. 30μg ceftazidime schijf werd geplaatst in het midden van de plaat, gevolgd door 10μg imipenem, 30μg cefoxitin, en 20/10μg amoxicilline/clavulanaat schijven die op een afstand van 20mm van de ceftazidime schijf werden geplaatst. De kolonies van het testorganisme werden aan een schijfje toegevoegd, waarna het plaatje werd omgekeerd en gedurende 24 uur bij 37°C aëroob werd geïncubeerd. Elke indeuking of afplatting van de ZOI duidde op de productie van AmpC β-lactamase door isolaten.20,24

Bewaring van AmpC β-Lactamase Positieve Isolaten

Voor de bewaring werd gebruik gemaakt van de glycerol stock preparation methode. De organismen werden bewaard in Tryptic Soy Broth (TSB) met 40% glycerol en bewaard bij -20ºC.25

Bruwe Plasmide DNA Extractie

Een geïsoleerde kolonie van het testorganisme werd geënt in Luria Bertani (LB) bouillon. Het inoculum werd aëroob geïncubeerd met behulp van een waterbadschudder bij 37°C gedurende 18-24 uur. De aldus verkregen reincultuur werd onderworpen aan de alkalischelysemethode om het plasmide-DNA te extraheren. Het geëxtraheerde plasmide DNA werd vervolgens gesuspendeerd in TE buffer en bewaard bij -20°C tot verder onderzoek.26

Omplificatie van de AmpC β-Lactamase genen (blaCITM en blaDHAM) door PCR

De AmpC β-lactamase genen (blaCITM en blaDHAM) werden geamplificeerd door PCR met gebruik van plasmide DNA preparaat als template. De voor blaCITM-gen gebruikte primers waren CLR5-F (5ʹ TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA -3ʹ) en CLR5-R (5ʹ- TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC -3ʹ) als respectievelijk voorwaartse en achterwaartse primer, terwijl de primers voor het blaDHAM-gen de voorwaartse sequentie DHAM voor (5ʹ AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG -3ʹ) en de achterwaartse sequentie DHAM_rev (3ʹ CCG TAC GCA TGG CTT TGC -5ʹ) waren.11 Het reactievolume werd vastgesteld op 25µL door toevoeging van 12,5µL 1X master mix (5× HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load, Solis BioDyne, Estland), 0,5µL elk van de forward en reverse primers en 4µL DNA template en ddH2O 7,5µL. De geoptimaliseerde PCR amplificatie van beide genen was 94ºC gedurende 3 minuten voor initiële denaturatie; 35 cycli van denaturatie bij 94ºC gedurende 30 seconden; 25 cycli van annealing bij 62ºC gedurende 30 seconden; 35 cycli van extensie bij 72º gedurende 1 min; en laatste extensie bij 72ºC gedurende 7 min.11,27

Purificatie van DNA

Plasmide DNA werd gezuiverd door ethanol precipitatie methode. Bij deze methode werd de DNA-pellet gespoeld met ijskoude 70% ethanol en gedurende 10 minuten te drogen gelegd, wat de verdamping van de alcohol vergemakkelijkt. De DNA pellet werd gesuspendeerd in een bufferoplossing die Tris, EDTA en RNases bevat om de resterende onzuiverheden uit te wassen.

Detectie van PCR-producten door gelelektroforese

De geamplificeerde producten werden gevisualiseerd door gebruik te maken van gel-elektroforese in 1,5% agarose gel gekleurd met 0,1 µL ethidiumbromide. Na de gelbereiding werd 2 µl DNA-ladder van 100 bp als marker toegevoegd aan het eerste putje, 2 µl negatieve controle aan een ander putje, 2 µl positieve controle aan een ander putje en 2 µl PCR-producten aan de resterende putjes. Tenslotte werd de gel gevisualiseerd onder UV trans-illuminator.28

Quality Control

Een standaard aseptische procedure werd aangenomen voor de procedures in deze studie. Alle batches van de kweekmedia en chemische reagentia werden verwerkt met aseptische technieken volgens de CLSI-richtlijnen. Bij AST werd de kwaliteitscontrole gehandhaafd door gebruik te maken van de controlestammen van E. coli ATCC 25922. Bij PCR werd de kwaliteitscontrole gewaarborgd door het gebruik van Klebsiella-isolaten die beide betrokken genen dragen, terwijl blanco of negatieve controles werden bereid zonder de toepassing van nucleïnezuren. Al deze controles werden gebruikt in elke batch van de PCR assay.

Statistische analyse

De gegevens werden ingevoerd en geanalyseerd met behulp van SPSS software versie 24.0. De associaties werden onderzocht met behulp van Chi-kwadraat toetsen op 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) onder demografische variabelen zoals geslacht, en de leeftijd van de proefpersonen.

Resultaten

Demografische en klinische karakter van de ingeschreven patiënten

Onder de 1151 ingeschreven patiënten waren 54,2% (624/1151) mannen en 45,8% (527/1151) vrouwen. Van de 253 bacteriële groei, waren 47,8% (121/253) van mannen en 52,2% (132/253) van vrouwen. Van de in totaal (253) bacteriële groei was 26,1% (66/253) afkomstig van urinemonsters, gevolgd door katheterpunten (17,4%;44/253), bloed (16,2%; 41/253), pus (11,9%; 30/253) en woningswabs (10,7%; 27/253). Wat betreft de leeftijdsverdeling van de patiënten, werd de hoogste groei van bacteriële pathogenen gevonden in de leeftijdsgroep 16-45 jaar (39,5%; 100/253), gevolgd door 46-60 jaar (30,1%; 76/253), >60 jaar (24,1%; 61/253), en 0-15 jaar (6,3%; 16/253) respectievelijk (Tabel 1).

Tabel 1 Demografische en klinische kenmerken van de patiënten van het Annapurna Neurological Institute and Allied Sciences

Distributie van bacteriële isolaten in klinische monsters

Van de in totaal 1151 klinische monsters, 22% (253/1151) vertoonde groei op kweekmedia. Van de 253 bacteriële isolaten waren de meeste (89,3%; 226/253) Gram-negatieve bacteriën. Onder de bacteriële groei was E. coli (28,5%; 72/253) het overheersende organisme, gevolgd door Pseudomonas aeruginosa (16,2%; 41/253), Acinetobacter baumannii (15,8%; 40/253), Gram-positieve bacteriën (10,7%; 27/253), Klebsiella pneumoniae (9,9%; 25/253), en Klebsiella oxytoca (4.7%; 12/253) (Figuur 1)

Figuur 1 Verdeling van bacteriële geslachten in kweek-positieve klinische specimens (n=253).

Antibiotica-gevoeligheidspatroon van geïsoleerde Gram-negatieve bacteriën

Van de 226 Gram-negatieve bacteriële isolaten werd 66.8% (151/226) resistent tegen cefoxitine, gevolgd door ceftazidime (58,4%; 132/226), ciprofloxacin (53,5%; 121/226), en cefepime (51.8%; 117/226), terwijl de isolaten het meest gevoelig waren voor meropenem (69%; 156/226), ertapenem (68,6%; 155/226), imipenem (66,8%; 151/226), amikacine (61,1%; 138/226), piperacilline/tazobactam (56,6%; 128/226) en azithromycine (53.1%; 120/226) (tabel 2).

Tabel 2 Antibiotica-gevoeligheidspatroon van Gram-Negatieve Bacteriële Isolaten (n=226)

Multidrug Resistentie (MDR) Patroon in de Isolaten

Van de 226 isolaten, 46.9% (106/226) van de isolaten MDR. Het hoogste percentage MDR werd gevonden bij E. coli (31,1%; 33/106), gevolgd door respectievelijk P. aeruginosa (20,8%; 22/106), A. baumannii (18,9%; 20/106), K. pneumoniae (9,4%; 10/106) en K. oxytoca (4,7%; 5/106) (figuur 2). Bij individuele soorten werd het hoogste percentage multidrugresistentie gevonden bij C. freundii (100%; 8/8), gevolgd door P. aeruginosa (53,6% 22/41), C. koseri (50%; 2/4), A. baumannii (50%; 20/40) en E. coli (45,8% 33/72), respectievelijk (figuur 2).

Figuur 2 Verdeling van MDR-bacteriën en algemeen MDR % en MDR binnen elke soort.

AmpC-detectie door verschillende tests

Van de 226 Gram-negatieve isolaten vertoonde 50% (113/226) resistentie tegen cefoxitine. AmpC β-lactamase producerende isolaten werden bevestigd met twee verschillende bevestigingstests, Schijf-tests en Boronzuur-tests. Van de 91,2% (83/91) isolaten waren beide testen positief en 8,8% (8/91) isolaten waren alleen positief in de boorzuurtest, bevestigd door ten minste één test en werden beschouwd als AmpC β-lactamase producenten.

Prevalentie van blaCITM en blaDHAM genen in AmpC β-Lactamase producerende Gram-Negatieve isolaten

In PCR assay, werden 90.1% (82/91) en 87.91% (80/91) van de isolaten positief getest voor blaCITM en blaDHAM. Respectievelijk werden de geamplificeerde blaCITM- en blaDHAM-genen met hun amplicongrootte van 465 bp en 405 bp gedetecteerd (Figuren 3 en 4).

Figuur 3 Agarosegelelektroforese (1,5%) gebruikt voor de scheiding van PCR-producten. Rij 2, positieve controle; rij 3, 5 en 7 zijn CITM-positief; rij 4 en 6, CITM-negatief; en rij 8. negatieve controle.

Figuur 4 Agarosegelelektroforese (1,5%), gebruikt voor de scheiding van PCR-producten. Rij 2, positieve controle; rij 3, 4, 6 en 7 zijn Dham-positief; rij 5, Dham-negatief; en rij 8, negatieve controle.

Distributie van AmpC β-Lactamase, blaCITM en blaDHAM genen onder Gram-Negatieve isolaten en hun relatie tot geslacht, leeftijd, klinische specimens en klinische isolaten

Van de 91 AmpC-producenten waren 50,6% (46/91) van de isolaten afkomstig van vrouwelijke en 49,4% (45/91) van mannelijke patiënten. Evenzo werden gelijke percentages (50%; 41/82) van blaCITM genen verkregen uit specimens van beide geslachten, terwijl 51,3% (41/80) en 48,7% (39/80) van blaDHAM genen werden gedetecteerd in de specimens verkregen van respectievelijk mannelijke en vrouwelijke patiënten. Er was geen significant verband tussen het geslacht van de patiënt en de productie van AmpC-enzymen en AmpC-genen (Tabel 3).

Tabel 3 Distributie van AmpC β-Lactamase, CITM en DHAM genen onder Gram-Negatieve Bacteriële Isolaten en hun relatie tot Geslacht, Leeftijd en Klinische Specimens

Hoogste aantal AmpC β-lactamase producenten (40.7%; 37/91) en prevalentie van isolaten die blaCITM (40,2%; 33/82) en blaDHAM (41,2%; 33/80) produceren, werden verkregen in de leeftijdsgroep (46-60) jaar, gevolgd door (16-45) jaar (respectievelijk 30,8%; 28/91), (29,3%;24/82) en 31,3%; 25/80). Er was een significant verband tussen AmpC β-lactamase enzymproductie en leeftijdsgroep (p=0,01) terwijl andere factoren waaronder de verwerving van blaCITM en blaDHAM genen geen significant verband hadden met de leeftijd van de patiënt (Tabel 3).

Onder de klinische specimens werd het hoogste aantal AmpC β-lactamase-producerende isolaten (20,9%; 19/91) gedetecteerd uit bloed en katheteruiteinden, gevolgd door urine (18,7%; 17/91), pus (13,3%; 12/91) en wondswabs (9,9%; 9/91). Evenzo werd het hoogste aantal blaCITM en blaDHAM producerende isolaten gedetecteerd uit catheter tips (21,9%; 18/82); (22,5%; 18/80), gevolgd door bloed (19,5%; 16/82); (21,3%; 17/80) urine (17,0%; 14/82); (17,5%; 14/80) en pus (13,4%; 11/82); (8,8%; 7/80), respectievelijk. Er was geen significant verband tussen klinische specimens, AmpC β-lactamase productie, en genen: blaCITM en blaDHAM (Tabel 3).

Distributie van AmpC β-Lactamases en verwerving van blaCITM en blaDHAM genen in verschillende Gram-Negatieve Bacteriën

De hoogste prevalentie van AmpC β-lactamase enzymen werd gevonden in E. coli (28,6%; 26/91), gevolgd door P. aeruginosa (26,4%; 24/91), A. baumannii (13,2%; 12/91) en K. pneumoniae (10,9%; 10/91). Hoogste prevalentie van blaCITM en blaDHAM genen werden gedetecteerd in E. coli (30,6%; 25/82) (31,3%; 25/80), gevolgd door P. aeruginosa (25,7%; 21/82), (22,5%; 18/80) A. baumannii (12,2%; 10/82), (12,4%; 10/80) en K. pneumoniae (10,9%; 9/82), (12,4%; 10/80), respectievelijk (Tabel 3).

Discussie

De toenemende incidentie van antimicrobiële resistentie blijft een van de belangrijkste problemen voor de volksgezondheid in ontwikkelingslanden zoals Nepal29 , wat heeft geleid tot een langere ziekenhuisopname, hogere behandelingskosten, beperking van therapeutische opties en een hogere morbiditeit en mortaliteit.29,30 De productie van β-lactamases is het belangrijkste verdedigingsmechanisme tegen β-lactam antibiotica. Deze studie werd uitgevoerd om de aanwezigheid van Amber klasse C β-lactamases (AmpC) te onderzoeken in Gram-negatieve organismen afkomstig van klinische monsters verkregen in het ANIAS, Kathmandu, Nepal. Deze studie evalueerde verder de prevalentie van AmpC β-lactamase genen (blaCITM en blaDHAM) door middel van PCR assay. We vonden een hoge prevalentie van deze enzymen en genen, hoewel de prevalentie van dergelijke enzymen varieerde van de ene geografische regio tot de andere, binnen en tussen de landen.

Uit 1151 klinische monsters vertoonden slechts 253 (21,9%) een significante groei van organismen. Van de in totaal (253) gegroeide bacteriën waren meer dan negentig procent Gram-negatieve bacteriën, waarvan E. coli de meest overheersende isolaten waren. Onze bevindingen komen overeen met eerdere studies uit Everest Hospital, Baneshwor,14 Alka Hospital, Jawlakhel,31 National Public Health Laboratory, Teku,32 Universal College of Medical Sciences, Bhairahawa,33 B.P Koirala Institute of Health Sciences, Dharan,34 Nobel Medical College, Biratnagar,35 New Delhi, India,36 Al-Najaf City, Irak,37 Shashemene Referral Hospital, Ethiopië,38 en Mexico City, Mexico.39 Iets meer Gram-negatieve bacteriële infecties werden waargenomen bij vrouwelijke patiënten en zouden te wijten kunnen zijn aan de hogere prevalentie van urineweginfecties bij vrouwen. Dit komt overeen met eerdere studies van het Model Hospital, Kathmandu,17 en Andra-Pradesh, India.40 In overeenstemming met deze studie werd een hoger percentage pusinfecties bij postoperatieve gevallen gerapporteerd bij vrouwen (63,33%) dan bij mannen (43,75%) in een studie uitgevoerd in de deelstaat Uttar Pradesh in India.41

In deze studie vertoonden Gram-negatieve bacteriële isolaten een hogere resistentie tegen de volgende antibiotica: cefoxitine, ceftazidime, ciprofloxacine en cefepime, gevolgd door cotrimoxazol, terwijl meropenem, imipenem, piperacilline-tazobactam en azithromycine werden gerapporteerd als de meest gevoelige antibiotica. Een vergelijkbaar patroon werd waargenomen in sommige van de eerdere bevindingen van Chitwan Medical College, Chitwan,42 Padma Hospital, Pokhara.43 Cefoxitine en ceftazidime met lage gevoeligheid zijn de eerstelijns geneesmiddelen die gemakkelijk gehydrolyseerd worden door de bacteriële enzymen en zijn minder nuttig bij de behandeling van infecties veroorzaakt door Gram-negatieve pathogenen. Net als in onze studie werden imipenem/meropenem de gevoeligste geneesmiddelen bevonden in eerdere studies van het Model Hospital, Kathmandu,17 Madrid, Spanje,44 en Wisconsin, VS.45

Antimicrobiële resistentie (AMR) met een toenemende verspreiding van MDR is een wereldwijd probleem, en de gevolgen zijn groter in de lage- en midden-inkomenslanden waar de last van infectieziekten hoog is.30 De behandeling van MDR-microben is duur en moeilijk en wordt nog verergerd door de hoge prevalentie van nosocomiale infecties.46 In deze studie bleek bijna de helft van de geïsoleerde Gram-negatieve isolaten (46,9%; 106/226) MDR te zijn. Hogere prevalentie van MDR-bacteriën is gerapporteerd in enkele andere studies uitgevoerd in Kathmandu46-49 en andere districten van Nepal.15,50,51 Productie van ESBL, metallo β-lactamase (MBL) of AmpC β-lactamase zou de reden kunnen zijn achter de verminderde gevoeligheid voor nieuwere generatie antibiotica.52 Bovendien treedt multidrug resistentie op door de aggregatie en expressie van verschillende genen op resistente (R) plasmiden of genen die coderen voor multidrug efflux pompen.53 Bovendien worden de genen die verantwoordelijk zijn voor de expressie van β-lactamase enzymen voortdurend geassocieerd met de niet-β-lactam antibiotica zoals aminoglycosiden en fluoroquinolonen.

In deze studie werd de AmpC productie hoger gevonden bij mannelijke patiënten (41,67%) dan bij vrouwen (38,98%). De bevindingen van deze studie komen overeen met enkele andere studies uit Kano, Noord-West Nigeria.54 Onze bevindingen verschilden echter met studies gerapporteerd uit Benin, Nigeria.55 Hogere prevalentie van UTI met multidrug resistentie bij vrouwen is gerapporteerd door vele studies, dit kan te wijten zijn aan een hogere prevalentie van AmpC-producerende pathogenen bij vrouwen omdat zij meer vatbaar zijn voor UTI dan mannen.

Het gebruik van cefoxitine-resistentie in diagnostische laboratoria dient als een betrouwbare screeningsmiddel/marker om AmpC-productie te detecteren. Bovendien biedt deze marker een goede negatief voorspellende waarde.

Ondanks hun brede bereik hebben sommige van de studies het gebruik van cefoxitine als een slecht screeningsmiddel voor AmpC-productie benadrukt. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het bestaan van andere alternatieve mechanismen dan AmpC (één ervan is porin kanaal mutatie) die tot vals positieve interpretatie (als cefoxitine resistentie) kan leiden.52 Onze studie toonde aan dat een derde van de Gram-negatieve isolaten (>40%) verantwoordelijk waren voor AmpC productie. De bevindingen van deze studie stonden in contrast met de studie van het Model Hospital, Kathmandu.17 Het verschil kan te wijten zijn aan de fenotypische detectiemethode die in deze studie werd gebruikt, waarbij cefoxitine resistiviteitstest en AmpC disk testmethode met cefoxitine (30µg) werden gebruikt. De gebruikte bevestigingstest was de fenylboronzuurtest met cefoxitine 30µg/400µg fenylboronzuur. Boorzuurderivaten werden bewezen als omkeerbare inhibitoren van AmpC β-lactamase enzymen.56

In deze studie werd AmpC productie waargenomen in 91 (80.53%) van de 113 isolaten. Het percentage AmpC-productie in onze studie is iets hoger dan andere studies gerapporteerd uit Model Hospital, Kathmandu,17 Chitwan Medical College,57 Bharatpur, Chitwan,58 en India.59

Om de beperkingen als gevolg van een van de methoden te compenseren, kan integratie van beide technieken in de routinediagnose de gevoeligheid en specificiteit van de tests in de klinische omgeving verhogen.

Een totaal van 73 Gram-negatieve isolaten toonde de aanwezigheid van zowel blaCITM als blaDHAM genen. Deze bevindingen komen overeen met een eerdere studie uit Ilam, Iran.27 In een soortgelijke studie uit India bleek dat blaCITM-genen vaker voorkwamen in E. coli.60 In onze studie werd de prevalentie van AmpC-geassocieerde genen (blaCITM en blaDHAM) onderzocht door middel van fenotypische en genotypische methoden. Deze studie geeft een brede analyse van de Gram-negatieve bacteriën geassocieerd met AmpC β-lactamase productie en hun antibiotica gevoeligheidspatronen onder klinische isolaten. De bevindingen van deze studie zijn van belang voor de informatie over de resistentiepatronen van verschillende organismen tegen cefalosporines. Surveillance van de multidrug resistentie met β-lactamase inclusief ESBL, MBL, en AmpC productie zijn nodig voor een routine klinische praktijk om de behandeling te optimaliseren en verdere resistentie tegen β-lactam antibiotica te voorkomen.13,61,62

Sterkten en beperkingen

Dit is de eerste studie die AmpC β-lactamase genen (blaCITM en blaDHAM) onderzoekt met behulp van zowel fenotypische als moleculaire test bij patiënten die een tertiair gezondheidszorgcentrum van Nepal bezoeken. De bevindingen van deze studie kunnen het antimicrobiële beleid voor tertiaire gezondheidscentra informeren, met inbegrip van de voorbereiding van het beheer van ziekenhuisinfecties, het behandelingsprotocol en de diagnostische procedure. Er zijn enkele beperkingen aan deze studie, waaronder het onderzoek van een beperkt aantal AmpC β-lactamases, de korte duur van de studie en de uitvoering in één enkel tertiair zorgcentrum. Toekomstige studies kunnen hierop voortbouwen om een longitudinale studie uit te voeren in meerdere tertiaire zorgcentra met onderzoek van alle β-lactamasen zoals ESBL, MBL, KPC en de belangrijkste genen die verantwoordelijk zijn voor resistentie. Niettemin, als een eerste studie van zijn soort die de fenotypische en moleculaire methoden trianguleert, zal deze studie een waardevolle referentie zijn voor toekomstige studies naar AmpC β-lactamases en prevalentie van blaCITM en blaDHAM genen in andere settings/ziekenhuizen van Nepal.

Conclusie

Onze bevindingen tonen aan dat verminderde gevoeligheid voor cefoxitine in Gram-negatieve isolaten verband houdt met de aanwezigheid van plasmide-gemedieerde AmpC genen. Aangezien er niet één definitieve methode bestaat, wordt voorgesteld om verschillende fenotypische detectiemethoden tegelijk te gebruiken voor de nauwkeurige detectie van AmpC β-lactamase producerende bacteriën. In deze studie detecteerde PCR bijna 90% van de AmpC β-lactamase genen (blaCITM en blaDHAM) onder de fenotypisch bevestigde isolaten. De hoge prevalentie van resistente genen en MDR onder Gram-negatieve isolaten is een alarmerend teken, dat vraagt om dringende interventiemaatregelen om de groei en verspreiding van deze isolaten tegen te gaan.