Luciferase Assays

Inzicht krijgen in hoe een promotor of response-element de genexpressie kan controleren is gemakkelijker wanneer het bestudeerd wordt met een reporter-gen. Luciferase enzymen zijn bij uitstek geschikt voor reporter assays met eenvoudige licht-gebaseerde detectie en hoge gevoeligheid die zelfs kleine veranderingen in expressie kan kwantificeren. Terwijl reporter assays vaak worden gebruikt om veranderingen in promotoractiviteit te beoordelen, kunnen zij ook worden gebruikt om signaaltransductie, eiwitfunctie, miRNA-regulering en zelfs real-time meting van processen in levende organismen te onderzoeken.

De basis van een reporter assay is de vector, die het reportergen draagt, en de detectiereagentia die een substraat leveren om de activiteit van het luciferase-enzym in een lichtsignaal om te zetten. Dual-luciferase-detectiereagentia doven het eerste reporter-signaal alvorens het tweede te lezen, zodat twee reporters sequentieel van hetzelfde monster kunnen worden gemeten. De tweede reporter wordt vaak opgenomen als een interne controle voor meer nauwkeurige gegevens.

Zodra de reporter vector is geselecteerd en eventuele elementen gekloond in (indien nodig), wordt de vector geïntroduceerd in gekweekte cellen, meestal met behulp van transfectie-gebaseerde methoden, uitgedrukt en de activiteit gedetecteerd met lytische (end-point) reagentia of live-cel reagentia voor het meten van veranderingen in dezelfde cellen in de tijd. Luciferase reporter assays kunnen worden gemultiplexed met andere assays om apoptose, metabolisme en meer te beoordelen. Meting van luciferase-tests wordt meestal uitgevoerd met behulp van een plaat-gebaseerde luminometer.