ISH: in situ hybridization protocol

Sample storage

RNA preservation
Het bewaren van RNA wordt bemoeilijkt door de aanwezigheid van RNase-enzym. Dit enzym wordt aangetroffen op glaswerk, in reagentia en op operators en hun kleding. RNase vernietigt snel elk RNA in de cel of de RNA probe zelf, zodat gebruikers ervoor moeten zorgen dat zij steriele technieken, handschoenen en oplossingen gebruiken om RNase verontreiniging van de probe of weefsel RNA.

Algemene monster opslag bij gebruik van bevroren secties
Voor de beste resultaten op oudere dia’s, niet dia’s droog opslaan bij kamertemperatuur. In plaats daarvan, bewaar ze in 100% ethanol bij -20°C, of in een plastic doos bedekt met folie bij -20°C of -80°C. Bij een dergelijke opslag blijven de glaasjes verscheidene jaren goed.

Keuze van de sonde

RNA-sondes

RNA-sondes moeten 250-1.500 bases lang zijn; sondes van ongeveer 800 bases lang vertonen de hoogste gevoeligheid en specificiteit. Transcriptiesjablonen moeten transcriptie van zowel probe (antisense streng) als negatieve controle (sense streng) RNA’s mogelijk maken. Om dit te bereiken moeten zij in een vector met tegengestelde promotors worden gekloond. Cirkelvormige templates moeten worden gelineariseerd alvorens een probe te maken, hoewel PCR-sjablonen ook kunnen worden gebruikt.

DNA-sondes

DNA-sondes bieden een hoge gevoeligheid voor in situ hybridisatie. Zij hybridiseren niet zo sterk aan doel-mRNA moleculen in vergelijking met RNA probes, zodat formaldehyde niet moet worden gebruikt in de post-hybridisatie wasbeurten.

Probe specificiteit is belangrijk. Indien de exacte nucleotidenvolgorde van het mRNA of DNA in de cel bekend is, kan een nauwkeurige complementaire probe worden ontworpen. Indien >5% van de basenparen niet complementair zijn, zal de probe slechts losjes hybridiseren met de doelsequentie. Dit betekent dat de kans groter is dat de probe tijdens de was- en detectiestappen wordt weggespoeld en mogelijk niet correct wordt gedetecteerd.

Digoxigenine (DIG)-gelabelde RNA probe in situ hybridisatie protocol

Dit protocol beschrijft het gebruik van DIG-gelabelde single-stranded RNA probes om expressie van het gen van belang in paraffine-embedded sections.

1) Deparaffinization

Voor bevroren secties, begin bij stap 2. Als u formaldehyde gefixeerde paraffine-ingebedde coupes gebruikt, ga dan verder met deze stap.

Voordat u verder gaat, moeten de objectglaasjes worden gedeparaffineerd en opnieuw gehydrateerd. Onvolledige verwijdering van paraffine kan leiden tot slechte kleuring van de sectie.

Plaats de objectglaasjes in een rek en voer de volgende wasbeurten uit:

• Xyleen: 2×3 min
• Xyleen 1:1 met 100% ethanol: 3 min
• 100% ethanol: 2×3 min
• 95% ethanol:
• 70% ethanol: 3 min
• 50% ethanol: 3 min
• Spoelen met koud leidingwater

Laat de draagglaasjes in het leidingwater staan tot het antigeen wordt opgehaald. Vanaf dit punt mogen de objectglaasjes niet drogen omdat dit niet-specifieke antilichaambinding en hoge achtergrondkleuring veroorzaakt.

2) Antigeen retrieval

Digest met 20 µg/mL proteinase K in voorverwarmde 50 mM Tris gedurende 10-20 min bij 37°C. Incubatietijd en proteinase K concentratie kunnen optimalisatie vereisen.

Wij raden aan een proteinase K titratie experiment uit te voeren om de optimale condities te bepalen. Onvoldoende digestie zal het hybridisatiesignaal verminderen en over-digestie zal resulteren in een slechte weefselmorfologie, waardoor lokalisatie van het hybridisatiesignaal zeer moeilijk wordt. Optimale proteinase K concentratie zal variëren afhankelijk van het weefseltype, lengte van fixatie en grootte van tissue.

3) Spoel dia’s 5x in gedestilleerd water.
4) Dompel dia’s in ijskoud 20% (v / v) azijnzuur gedurende 20 sec. Dit permeabiliseert de cellen om toegang te krijgen tot de probe en het antilichaam.
5) Dehydrateer de objectglaasjes door ze ongeveer 1 min per wasbeurt te wassen in 70% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol, en laat ze vervolgens aan de lucht drogen.
6) Voeg 100 µL hybridisatieoplossing toe aan elk objectglaasje.

Zoutoplossing (20x)

• 4 M NaCl
• 100 mM EDTA
• 200 mM Tris-HCl pH 7.5
• 100 mM NaH2PO4.2H2O

Denhardt’s solution (100x)

• 10 g Ficoll
• 10 g PVP (polyvinylpyrrolidine)
• 10 g boviene serumalbumine (BSA)
• 500 ml steriele dH2O

7) Incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur in een bevochtigde hybridisatiekamer bij de gewenste hybridisatietemperatuur. Typische hybridisatietemperaturen liggen tussen 55-62°C.
8) Verdun de sondes in hybridisatieoplossing in PCR-buisjes. Verwarm gedurende 2 minuten bij 95°C in een PCR-blok om de RNA- of DNA-sonde te denatureren. Koel onmiddellijk af op ijs om reannealing te voorkomen.
9) Giet de hybridisatieoplossing af. Voeg 50-100 ul van verdunde probe per sectie, die het gehele monster te dekken. Incubeer in de bevochtigde hybridisatiekamer bij 65 ° C gedurende de nacht. Bedek het monster met een dekglaasje om verdamping te voorkomen.

Tijdens deze stap zal de RNA-sonde hybridiseren aan het overeenkomstige mRNA, of de DNA-sonde zal hybridiseren aan het overeenkomstige cellulaire DNA. Optimaliseer de hybridisatietemperatuur afhankelijk van de sequentie van de gebruikte probe, alsmede het cel- of weefseltype. Deze temperatuur moet voor elk geanalyseerd weefseltype worden geoptimaliseerd.

De optimale hybridisatietemperatuur voor probes hangt af van het percentage basen dat in de doelsequentie aanwezig is. De concentratie van cytosine en guanine in de sequentie zijn belangrijke factoren.

10) Stringency wast

Oplossingsparameters zoals temperatuur, zout en detergent concentratie kan worden gemanipuleerd om niet-specifieke interacties te verwijderen.

Om 1 L van 20x zout natriumcitraat (SSC)

• 175,3 g NaCl (3 M)
• 88 te bereiden.2 g natriumcitraat
• 800 mL steriele dH2O
• Op pH 5 brengen met citroenzuur, vullen tot 1 L en autoclaveren

Was 1

• 50% formamide in 2x SSC
• 3×5 min, 37-45°C

Was overtollige probe en hybridisatiebuffer weg bij hogere temperaturen (tot 65°C) gedurende korte perioden. Indien te lang kan dit wegspoelen te veel van de gehybridiseerde probe RNA / DNA.

Was 2

• 0.1-2x SSC
• 3×5 min, 25-75 ° C

Deze stap verwijdert niet-specifieke en / of repetitieve DNA / RNA hybridisatie.

Volg deze richtlijnen om de temperatuur en zoutconcentratie te optimaliseren voor strikte wasbeurten:

• Voor zeer korte DNA/RNA-sondes (0.5-3 kb) of zeer complexe probes, moet de wastemperatuur lager zijn (tot 45 ° C) en de strengheid lager (1-2x SSC).
• Voor single-locus of grote probes, moet de temperatuur rond de 65 ° C en de strengheid hoog (onder 0.
• De temperatuur en de strengheid moeten het hoogst zijn voor repetitieve probes (zoals alfa-satellietherhalingen).

11) Was tweemaal in MABT (maleïnezuur-buffer met Tween 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. MABT is zachter dan PBS en is meer geschikt voor nucleïnezuur detectie.

Voor te bereiden 5x MABT stock

• 58 g maleïnezuur
• 43,5 g NaCl
• 55 g Tween-20
• 900 ml water

Breng de pH tot 7,5 door toevoeging van Tris base. Er zal ongeveer 100 g nodig zijn. Breng het eindvolume op 1 L.

12) Droog de objectglaasjes.
13) Breng over in een vochtige kamer en voeg 200 µL blokkeerbuffer toe aan elke sectie (MABT + 2% BSA, melk of serum). Blokkeer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
14) Laat de blokkeerbuffer weglopen. Voeg het anti-label antilichaam in de vereiste verdunning toe in de blokkeerbuffer. Raadpleeg het gegevensblad van het antilichaam voor een aanbevolen concentratie/verdunning. Incubeer 1-2 uur bij kamertemperatuur.
15) Was de objectglaasjes 5×10 min met MABT bij kamertemperatuur.
16) Was de objectglaasjes telkens 2×10 min bij kamertemperatuur met voorkleuringbuffer (100 mM Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2).
17) Ga voor fluorescentiedetectie verder met stap 18. Voor andere vormen van detectie brengt u de glaasjes terug naar de bevochtigde kamer en volgt u de instructies van de fabrikant voor kleurontwikkeling.

18) Spoel de glaasjes in gedestilleerd water.
19) Droog de draagglaasjes gedurende 30 minuten aan de lucht. Was ze in 100% ethanol en laat ze grondig drogen aan de lucht.
20) Monteer ze met DePeX inbedvloeistof.