Genetica van Myasthenia Gravis: Een Case-Control Associatie Studie in de Helleense Populatie

Abstract

Myasthenia gravis (MG) is een heterogene auto-immuunziekte die gekenmerkt wordt door de productie van auto-antilichamen tegen eiwitten van het postsynaptische membraan, in de neuromusculaire junctie. De bijdrage van genetische factoren aan de gevoeligheid voor MG is geëvalueerd door middel van familie- en tweelingstudies, maar de precieze genetische achtergrond van de ziekte blijft onopgehelderd. Wij hebben een case-control associatiestudie uitgevoerd bij 101 niet-verwante MG patiënten van Griekse origine en 101 gezonde vrijwilligers om de betrokkenheid van gemeenschappelijke genetische varianten bij de gevoeligheid voor MG te onderzoeken. Wij richtten ons op drie kandidaat-genen die duidelijk in verband zijn gebracht met verschillende auto-immuunziekten, met als doel hun mogelijke betrokkenheid bij de pathogenese van MG te onderzoeken. Dit zijn interferon regulerende factor 5 (IRF-5), TNFα-geïnduceerd eiwit 3 (TNFAIP3), ook bekend als A20, en interleukine-10 (IL-10), sleutelmoleculen in de regulatie van de immuunfunctie. Een statistische trend van associatie () tussen IL-10 promotor single nucleotide polymorfismen (SNPs) en de subgroepen van vroeg en laat ontstane MG patiënten werd onthuld. Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen in de rest van de onderzochte varianten. Voor zover wij weten, is dit de eerste wereldwijde poging om de mogelijke associatie tussen gemeenschappelijke genetische varianten van IRF-5 en TNFAIP3 en de genetische basis van MG te onderzoeken.

1. Inleiding

Myasthenia gravis (MG) is een orgaanspecifieke auto-immuunziekte die wordt veroorzaakt door auto-antilichamen gericht tegen eiwitten van het postsynaptische membraan die leiden tot een verstoorde neuromusculaire transmissie. Klinisch wordt MG gekenmerkt door spierzwakte en snelle vermoeidheid die verergert bij inspanning en verlicht wordt door rust. Het belangrijkste auto-antigeen, bij 80-90% van de MG-patiënten, is de acetylcholinereceptor (AChR) in de spier, een pentamerisch kanaal dat de synaptische transductie op de neuromusculaire junctie medieert. Bij een aantal van de resterende MG-patiënten worden auto-antilichamen tegen spierspecifiek tyrosinekinase (MuSK) of tegen lipoproteïne-gerelateerd eiwit 4 (LRP4) aangetoond. Zowel MuSK als LRP4 vormen een receptorcomplex dat bindt aan het extracellulaire matrixproteoglycaan agrine, wat resulteert in AChR-clustering, cruciaal voor de neuromusculaire junctiefunctie.

Hoewel MG een ziekte is die beide geslachten treft, op alle leeftijden en bij alle rassen , is uit verschillende epidemiologische studies gebleken dat er een geslachts- en leeftijdsafhankelijke bimodale verdeling van de incidentie is, met een piek in de tweede en derde levensdecennia, die vooral bij vrouwen wordt waargenomen, en een tweede piek in de zesde en zevende levensdecennia, die vooral bij mannen voorkomt. Bovenstaande observatie heeft geleid tot de classificatie van MG in een vroege fase die optreedt vóór de leeftijd van 50 jaar en gewoonlijk verband houdt met hyperplasie van de thymus en een late fase van MG (>50 jaar) met normale of atrofische thymus.

De mate van genetische bijdrage aan de gevoeligheid voor MG is geëvalueerd door middel van familie- en tweelingstudies, die de familiaire clustering van de ziekte en vervolgens de genetische overerving weerspiegelen. Hoge concordantiepercentages van MG bij monozygote tweelingen in vergelijking met dizygote tweelingen suggereren sterk de betrokkenheid van genetische factoren bij de pathogenese van MG . Bovendien hebben verschillende studies gerapporteerd dat MG-patiënten kunnen worden getroffen door een andere auto-immuunziekte, meestal schildklieraandoeningen en reumatoïde artritis. Deze bevinding leidt tot de hypothese dat een meer algemene stoornis van de immunologische functie optreedt.

Het menselijk leukocyten antigen (HLA) complex is de prominente genomische regio die betrokken is bij het ontstaan van MG. HLA-A1 en B8 allelen voor klasse I en DR3 voor klasse II vormen een voorouderlijk haplotype dat “8.1” wordt genoemd en dat reproduceerbaar in verband is gebracht met MG op jonge leeftijd en thymische hyperplasie. Verder onderzoek gericht op de ontleding van deze uitgebreide A1-B8-DR3 haplotype, leidde tot de identificatie van de MYAS1 locus, een regio van 1,2 Mb omvat 36 genen, op de grens van klasse III en proximale klasse I regio, dus, met uitsluiting van de klasse II loci en bevestiging van de overheersende associatie van B8 allel over die van DR3 .

Naast het HLA zijn ook een aantal niet met het HLA verbonden genetische loci onderzocht op hun betrokkenheid bij de gevoeligheid voor MG. Deze bevindingen zijn voornamelijk afgeleid uit kandidaat-gen studies, terwijl de genen waarvan is gerapporteerd dat ze al dan niet geassocieerd zijn met MG in detail worden besproken in .

Interferon (IFN) regulerende factor 5 (IRF-5) is een lid van de IRF-familie van transcriptiefactoren. IRF-5 wordt geactiveerd door IFN-α/B en upreguleert een reeks proinflammatoire cytokines, zoals IL-6, TNF-α, en IL-12, terwijl het verder IFN-genexpressie induceert. Resultaten van verschillende studies, besproken in , hebben IRF-5 geïmpliceerd als een susceptibiliteitsgen in SLE. Zoeken naar gemeenschappelijke varianten die IRF-5 niveaus beïnvloeden leidde tot de identificatie van SNP rs10954213 (c.*555G > A), gelegen binnen de polyA+ signaalsequentie AATAAA in de 3′ UTR. Het G-allel verstoort de polyadenyleringsplaats en de transcriptie wordt ver stroomafwaarts beëindigd, waardoor langere en minder stabiele IRF-5 mRNA transcripten ontstaan. Verder bepaalt een 30-bp in-frame insertie-deletie variant (rs60344245) in het zesde exon van IRF-5 de vorming van twee families van eiwit-isovormen die een verschillend vermogen hebben om transcriptie van IRF-5 doelgenen te initiëren .

Het TNFα-geïnduceerde eiwit 3 (TNFAIP3), ook bekend als A20, is een sleutelmolecule in de negatieve terugkoppelingsregulatie van NF-κB-afhankelijke reacties. Het remmende effect van TNFAIP3 op de NF-κB signalering komt voort uit de coöperatieve activiteit van zijn twee ubiquitine-bevattende domeinen: het N-terminale ovarium tumor domein (OTU), verantwoordelijk voor het deubiquitineren van receptor interagerende proteïne 1 (RIP1), een essentieel adaptor proteïne van de TNF-geïnduceerde signaleringsroute, en het C-terminale zinkvinger-bevattende domein, dat functioneert als een E3 ubiquitine ligase dat de proteasomale degradatie van RIP1 bevordert.

De SNP rs13207033 (g.137965418G > A), gelegen op 6q23 intergenische regio, ongeveer 185 kb stroomopwaarts van TNFAIP3, beïnvloedt waarschijnlijk genexpressie door de aanwezigheid van potentiële regulerende DNA-elementen . Een andere studie wees uit dat een niet-synonieme coderende SNP (c.380T > G, rs2230926) resulterend in een fenylalanine-naar-cysteïne verandering op residu 127 (p.F127C), in het OTU domein van het TNFAIP3 eiwit, geassocieerd is met SLE bij individuen van Europese afkomst .

Interleukine-10 (IL-10) is een pleiotroop cytokine dat door verschillende celtypes, zoals T-cellen en myeloïde lijncellen, wordt afgescheiden. IL-10 is gekarakteriseerd als een anti-inflammatoire cytokine door zijn stimulerende effecten op TH2 cellen en de gelijktijdige onderdrukking van TH1 cellen. Bovendien induceert IL-10 de proliferatie en differentiatie van geactiveerde B-lymfocyten wat leidt tot verdere activatie van de humorale respons. Bij experimentele auto-immune MG (EAMG) veroorzaakte de toediening van IL-10 de toename van anti-AChR antilichaamspiegels, wat wijst op een ziekteversterkende rol van IL-10 .

Er zijn verschillende varianten waargenomen in de 5′ flankerende sequentie van het menselijke IL-10 gen. Drie SNPs, namelijk, rs45552637 (A/C), rs1800872 (T/C), en rs1800896 (A/G), respectievelijk gelegen op posities -592, -819, en -1082, bepalen de vorming van drie haplotypes (GCC, ACC, en ATA). De positie van deze SNPs is gebaseerd op de eerder gepubliceerde sequentie U16720, gedeponeerd in de EMBL-EBI database. Een studie van Turner en collega’s meldde correlatie van deze haplotypen met IL-10 eiwitproductie in vitro. Meer bepaald werd het GCC/GCC genotype geassocieerd met een hoge concanavalin A geïnduceerde IL-10 productie, de GCC/ACC en GCC/ATA genotypes met een gemiddelde en de ACC/ACC, ATA/ATA, en ACC/ATA genotypes met een lage IL-10 productie.

In de huidige studie werd een hypothese-gedreven aanpak aangenomen om de betrokkenheid van bepaalde gemeenschappelijke varianten in MG gevoeligheid te beoordelen. Daarom voerden we een kandidaat-gen case-control studie uit, gericht op genen met een cruciale rol in de werking van het immuunsysteem, met als doel vast te stellen of eerder gerapporteerde associaties tussen de bovengenoemde genen en andere auto-immuunziekten zouden kunnen gelden voor MG.

2. Materialen en Methoden

2.1. Studiepopulatie

Er werden in totaal 101 niet-verwante MG patiënten, allen van Helleense afkomst, in deze studie opgenomen. Bloedmonsters van MG patiënten werden verzameld op het Hellenic Pasteur Institute tijdens routine diagnostisch onderzoek. Alleen AChR-positieve MG-patiënten werden in onze studie opgenomen. De diagnose van MG werd gebaseerd op de aanwezigheid van anti-AChR antilichamen in het serum van de patiënt, met behulp van een radio-immunoprecipitatie assay (RIPA). De patiënten die positief waren bevonden voor auto-antilichamen tegen MuSK, hebben wij opzettelijk uitgesloten van de genetische analyse, om de heterogeniteit van de onderzoeksgroep te verminderen. Hoewel de sera van MG-patiënten niet werden geanalyseerd op anti-LRP4 auto-antilichamen, doet de afwezigheid van deze test geen probleem rijzen met betrekking tot heterogeniteit in de studiepopulatie, omdat anti-LRP4 en anti-AChR antilichamen zelden naast elkaar voorkomen. De belangrijkste kenmerken van de anti-AChR MG groep (leeftijd bij aanvang en geslacht) zijn samengevat in Tabel 1. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. De controlegroep bestond uit 101 etnisch en geslachts-gematchte gezonde personen.

2.2. Genotypering

Genomisch DNA van elk individu werd geëxtraheerd uit perifeer veneus bloedmonster met behulp van de QIAamp Blood Midi kit (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland). Polymerase kettingreacties (PCR’s) werden uitgevoerd met de KAPA2G Fast HotStart ReadyMix kit (KAPABIOSYSTEMS, Woburn, MA, USA). Primersequenties worden in het aanvullend materiaal gepresenteerd als Supplementary Table 1 (zie Tabel 1 in Supplementary Material online beschikbaar op http://dx.doi.org/10.1155/2012/484919), terwijl de reactievoorwaarden op verzoek beschikbaar zijn.

Vermenigvuldiging door PCR en agarosegel-elektroforese-analyse werden gebruikt om de 30 bp insertie/deletie-variant van IRF5 te genotyperen.

Een op PCR gebaseerde restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) assay werd gebruikt voor de detectie van SNP rs2230926 (T > G) in TNFAIP3. De geamplificeerde fragmenten van 549 bp werden gedigesteerd met het restrictie-enzym Fnu4HI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) en werden vervolgens geanalyseerd door elektroforetische scheiding op 2% w/v agarose gel. Het G-allel creëert een Fnu4HI-restrictieplaats, wat resulteert in de digestie van de amplicons tot fragmenten van 319 en 230 bp.

De identificatie van IL-10 promotor SNP genotypen werd uitgevoerd door directe DNA Sanger sequencing. Een fragment van 585 bp, dat alle drie varianten omvatte, werd door PCR geamplificeerd. De PCR-producten werden gezuiverd met de op kolommen gebaseerde PureLink PCR Purification kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De sequentie van het 585 bp fragment werd bepaald met behulp van de BigDye Terminator chemistry v3.0 kit op een Applied Biosystems DNA sequencer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). De gebruikte primers waren dezelfde als die voor de amplificatie van dit gebied.

De twee SNPs, rs10954213 (A/G) in het 3′ UTR van IRF5 en rs13207033 (G/A) gelegen in een 6q23 intergenische regio, werden gegenotypeerd door real-time PCR en hoge resolutie smeltcurve (HRM) analyse op een RotorGene Q real-time cycler (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland). De amplificatie van het fragment dat het SNP van interesse bevat, werd uitgevoerd met de Type-it HRM PCR kit (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland), volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens HRM stijgt de temperatuur van 65 tot 95°C, met een opwarmsnelheid van 0,1°C/2 sec, wat leidt tot de denaturatie van PCR-producten en de generatie van smeltcurves, kenmerkend voor elk genotype. Aangezien één enkel basenpaar verandering een significante verschuiving in de smelttemperatuur veroorzaakt (), is genotypering gebaseerd op de analyse van de smeltprofielen: homozygoten voor het A-allel vertonen vergelijkbare smeltprofielen en met een lagere , vergeleken met de G/G homozygoten, terwijl heterozygoten worden onderscheiden door een verandering in de vorm van de smeltcurve.

Bij alle genotyperingsprocessen werden zorgvuldig geen controles van het sjabloon uitgevoerd. Negatieve en positieve controlemonsters werden in eerste instantie geïdentificeerd door DNA-sequencing en werden vervolgens gebruikt in alle genotyperingsmethoden. Elk monster werd in duplo getest, behalve de monsters die door PCR-RFLP en DNA-sequencing werden geanalyseerd.

2.3. Statistische analyse

De verschillen in genotype verdeling en allelfrequenties tussen gevallen en controles werden berekend door analyse of Fisher’s Exact test. waarden lager dan 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.

3. Resultaten

Genotype verdelingen van alle varianten waren consistent met Hardy-Weinberg equilibrium in zowel MG patiënt en controle groepen (gegevens niet weergegeven).

De allel- en genotypefrequenties van de IRF-5 rs60344245-variant vertoonden een gelijksoortige verdeling in de gescreende groepen van 101 MG-patiënten en 100 controles (). Wat betreft de IRF-5 rs10954213 SNP, bleek het A/G genotype iets frequenter voor te komen bij MG patiënten dan bij controles (54,8% versus 45,5%), maar analyse toonde geen significant verschil (). Allel- en genotypefrequenties van beide IRF-5 varianten zijn weergegeven in tabel 2.

De TNFAIP3 rs13207033 G/G genotype frequentie toonde een toename bij gezonde controles (44,6%) in vergelijking met MG patiënten (33,3%). Statistische analyse gaf echter geen significant verschil aan tussen de twee groepen (). In het geval van rs2230926 coderende SNP zijn de genotypes gelijk verdeeld in de 73 onderzochte MG patiënten en 81 controles, zoals wordt afgeleid door de waarde . Genotype frequenties van de rs2230926 variant, in zowel MG patiënten als controles, zijn in overeenstemming met die afgeleid van monsters van Europese afkomst (CEU) die deel uitmaken van het internationale HapMap project. Bovendien vertoonde onze studiegroep rs13207033-genotype frequenties die vergelijkbaar zijn met de frequenties gerapporteerd in Europese populaties, in de dbSNP database. Genotyperingsresultaten van de twee TNFAIP3-varianten zijn samengevat in Tabel 3.

De leeftijd van het begin van de ziekte werd ook geëvalueerd door MG-patiënten te verdelen in patiënten met een vroege en late ontwikkeling. Er werd geen significant verschil in genotypeverdeling gedetecteerd tussen de twee subgroepen en de controlegroep (gegevens niet weergegeven).

DNA-sequentieanalyse van de IL-10 promotor regio toonde aan dat het ACC/GCC genotype het meest frequent waargenomen genotype was in zowel MG patiënten als controles (23,72% en 28%, resp.), gevolgd door het lage secretie genotype ATA/ACC, dat werd gedetecteerd in 21,62% van de totale MG en 18% van de controles (tabel 4). De huidige studie liet echter geen statistisch significant verschil zien in de verdeling van IL-10 genotypen tussen het complete cohort van MG patiënten (d.w.z. totaal MG) en de controlegroep (). Vergelijking tussen de subgroepen naar leeftijd bij aanvang toonde aan dat het hoge IL-10 secretie GCC/GCC genotype in een lage frequentie wordt aangetroffen bij MG met een vroege aanvang (4%), terwijl het oververtegenwoordigd is bij MG gevallen met een late aanvang (20%) (Tabel 4). Een statistische trend van associatie () tussen de IL-10 fenotype verdeling en de twee subgroepen van vroege en late onset werd onthuld (figuur 1).

Figuur 1

IL-10 fenotype verdeling in de subgroepen van vroege en late beginnende MG patiënten.

4. Discussie

MG is een heterogene auto-immuunziekte met een duidelijke genetische predispositie. Naast de HLA loci, zijn verschillende veel voorkomende varianten in HLA-ongebonden genen in verband gebracht met de gevoeligheid voor MG. Veel van deze risico-geassocieerde genen zijn wijdverspreid onder verschillende auto-immuunziekten, wat de notie ondersteunt dat auto-immuunziekten worden gekenmerkt door gedeelde pathogenetische paden. In deze studie hebben we een case-control associatie studie uitgevoerd om de bijdrage te onderzoeken van gemeenschappelijke varianten in IRF-5, TNFAIP3, en IL-10 genen aan de gevoeligheid voor MG. Deze genen werden als goede kandidaten beschouwd vanwege hun cruciale rol in de regulatie van de immuunrespons en hun eerder bekende betrokkenheid bij het auto-immuunproces. Alleen patiënten met anti-AChR antilichamen in hun serum werden opgenomen in de genetische analyse, omdat verwacht werd dat zij een meer homogene subgroep vertegenwoordigen dan de bredere MG groep. Deze subgroep werd verder onderverdeeld in twee verschillende ziekte-entiteiten: vroeg ontstane MG-patiënten, die voornamelijk uit vrouwen bestonden, en laat ontstane MG-patiënten, die een hoger percentage mannen vertoonden.

Voor zover wij weten, is dit de eerste studie, in welke populatie dan ook, waarin de associatie tussen MG en gemeenschappelijke varianten van de IRF-5 en TNFAIP3 genen is onderzocht. Volgens eerdere studies, besproken in , zijn verschillende varianten in de IRF-5 locus reproduceerbaar geassocieerd met SLE wat IRF-5 impliceert als een susceptibiliteitsgen in lupus. De rs10954213 SNP blijkt invloed te hebben op de polyadenylering van het mRNA en daardoor het IRF-5 eiwit te beïnvloeden; A/A homozygoten vertonen ongeveer 5 maal hogere niveaus van immuunreactief IRF-5 vergeleken met de G/G homozygoten. Voor de rs60344245-variant verwijdert de deletie van 30 bp (GGCCGCCTACTGCAGCCGCCCACTCTGC/-) 10 aminozuren uit het IRF-5-eiwit en verandert een proline-, glutaminezuur-, serine- en threonine-rijk (PEST) domein. In de IRF-familie van eiwitten nemen dergelijke domeinen deel aan eiwitinteracties en ze veroorzaken ook snelle proteolytische degradatie . Ondanks hun duidelijke functionele rol, werd in de huidige studie geen significante associatie aangetoond van de IRF-5 rs10954213 en rs60344245 varianten met MG ( en , resp.), wat suggereert dat IRF-5 mogelijk niet betrokken is bij de pathogenese van MG.

Daarnaast hebben recente bevindingen van GWA-studies significante associaties onthuld tussen varianten in de menselijke TNFAIP3 locus en een breed spectrum van auto-immuunziekten. Een GWA scan van reumatoïde artritis patiënten, met anticitrullinated peptide antilichamen, ontdekte sterke aanwijzingen voor associatie van de rs13207033 SNP met de ontwikkeling van RA . Evenzo werd in een studie van Musone en collega’s de associatie van de niet-synonieme coderende SNP, rs2230926 met SLE gerapporteerd. Functionele studies om de biologische impact van rs2230926 te bepalen toonden aan dat het minor Cys127 eiwit een verminderde remmende activiteit vertoont . Toch werd er geen associatie waargenomen tussen MG en TNFAIP3 rs13207033 () en rs2230926 () SNPs.

Al met al kunnen onze gegevens erop wijzen dat de orgaanspecifieke MG een andere genetische achtergrond zou kunnen hebben die leidt tot de afscheiding ervan van een brede cluster van systemische auto-immuunziekten die SLE en RA omvatten. Een alternatieve verklaring voor het gebrek aan associatie in onze studie zou te maken kunnen hebben met het onvoldoende statistisch vermogen ten gevolge van de relatief kleine steekproefgrootte. Zoals algemeen bekend is, zijn gemeenschappelijke varianten verantwoordelijk voor een bescheiden deel van het genetische risico met betrekking tot de autoimmuunziekten. In dergelijke gevallen kunnen duizenden stalen nodig zijn om een associatiesignaal op te sporen dat kan onderscheiden worden van de achtergrondruis. Bij ziekten met een lage prevalentie, zoals MG, is de aanwerving van grote aantallen monsters echter zeer moeilijk. Het is vermeldenswaard dat de diagnose-eenheid voor MG in het Hellenic Pasteur Institute de enige eenheid in Griekenland is die sinds 1983 systematisch bloedmonsters heeft ontvangen en geanalyseerd. Daarom is onze verzameling DNA-monsters van MG momenteel de grootste in Griekenland en wordt zij voortdurend verrijkt met nieuwe gevallen.

Daarenboven, ondanks de specifieke selectie van anti-AChR patiënten en hun verdeling in vroege en late onset, een verdere classificatie volgens de thymus anomalieën (thymoma of hyperplasie) zou informatief kunnen geweest zijn; histologische gegevens waren echter niet beschikbaar.

Ten slotte was een onverwacht resultaat het ontbreken van associatie van de IL-10 promotor SNPs met MG. Aangezien deze varianten verondersteld worden binnen de IL-10 promotor regio te liggen, kunnen zij invloed hebben op de binding van transcriptiefactoren die IL-10 expressie reguleren. Een recente studie van Alseth en collega’s, uitgevoerd bij de Noorse bevolking, onthulde een associatie van ACC/ACC genotype met de subgroep van titine antilichamen-positieve MG patiënten, terwijl een statistisch significant verhoogde ATA/ATA frequentie werd waargenomen bij MG patiënten die vroeg aan de ziekte waren begonnen. In onze groep van Griekse MG gevallen werd geen bewijs van associatie gevonden, toen we de genotype verdeling tussen het complete cohort van MG patiënten en de controlegroep vergeleken (). GCC/GCC-genotype vertoonde echter een statistische trend van associatie met MG, in de verschillende subgroepen van vroege en late MG-patiënten (). Verdere studies met grotere steekproeven zouden dus mogelijke associaties van MG met IL-10 aan het licht kunnen brengen. Het is ook opmerkelijk dat de allelfrequenties voor een bepaalde SNP aanzienlijk kunnen verschillen tussen etnische groepen. Het verschil dat werd vastgesteld in de frequentie van het ACC/ACC genotype tussen de Noorse en de Helleense controlegroepen (3,4% versus 15%) weerspiegelt deze omstandigheid.

Over het geheel genomen is dit, voor zover wij weten, de eerste poging geweest om de mogelijke associatie tussen gemeenschappelijke genetische varianten van IRF-5 en TNFAIP3 en de genetische basis van MG te onderzoeken, in welke populatie dan ook, terwijl verdere studies nodig zijn om de, nog grotendeels onbekende, genetische achtergrond van MG te ontrafelen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dank verschuldigd aan de MG patiënten en vrijwilligers die hebben deelgenomen aan onze studie. Anna Kokla en Maria Belimezi van het Hellenic Pasteur Institute worden bedankt voor hun hulp bij het verzamelen van monsters van MG patiënten. De huidige studie werd financieel ondersteund door de Europese Commissie subsidies Fight MG aan S. J. Tzartos en GEN2PHEN (FP7-200754) aan G. P. Patrinos, met deelname van fondsen van Thales project (auto-immuniteit) aan S. J. Tzartos en K. Poulas en Hellas / Turkije Bilaterale Samenwerking project (MuSK-myasthenia gravis) aan K. Poulas.

Aanvullend materiaal

Het aanvullend materiaal bevat aanvullende tabel 1 met informatie over de primers voor PCR-amplificatie van elke variant en de flankerende sequentie.

1. Aanvullende tabel